体外诱导人类B细胞分泌HLA抗体的实验研究

目的:探索体外诱导人类B细胞产生特异性HLA抗体的理想培养条件。方法:以EBV转化致敏肾移植患者B淋巴细胞系(BLCL)为模型,采用ELISA和ELISPOT方法,比较3种培养体系:(1)RPMI1640 抗OPTI单克隆抗体(mAb);(2)RPMI1640 0·1mmol/L非必需氨基酸液 1mmol/L丙酮酸钠 40mg/L转铁蛋白;(3)Hybridoma无血清培养液,以及3种培养条件:(1)对照组(仅培养液),(2)培养液 rIL-4 rIL-10 鼠抗人CD40(α-CD40),(3)培养液 rIL-4 rIL-10 重组人CD40配体(CD40L),人类B细胞产生免疫球蛋白(Ig)和特异性抗HLA抗体的能力。结果:BLCL细胞在Hybridoma SFM培养体系所产生的IgG和IgM浓度分别为25·2～28·1mg/L和7·14～7·95mg/L,高于其他两种培养条件(P<0·05)。BLCL细胞在添加了IL-4、IL-10和α-CD40或CD40L的杂交瘤无血清培养液中能产生特异性抗HLA-I抗体,所获得的斑点频数分别为3·06/每104个BLCL细胞和3·55/每104个BLCL细胞,高于对照组(1·77/每104个BLCL细胞)。结论:BLCL细胞在杂交瘤无血清培养液中和添加了IL-4、IL-10和α-CD40或CD40L的培养条件下,提高分泌IgG和IgM的能力和特异性抗HLA-I类分子的抗体。     

rHuIL-6和rHuIL-2对人杂交瘤细胞增殖、克隆化以及抗体产生的影响

rHuIL6对人一鼠杂交瘤86—1、87—3和人—(人×鼠)杂交瘤C_的增殖、克隆化和抗体分泌均有明显的促进作用。rHuIL-2能提高C_8杂交瘤的增殖水平。rHuIL-6和rHuIL-6和rHuIL-2同时应用对人—鼠杂交瘤86—1和87—3细胞的克隆化效率和抗体分泌水平有明显的协同作用。     

条件培养液中杂交瘤生长因子对人—鼠杂交瘤生长、克隆化及抗体分泌的影响

本文报道了含有杂交瘤生长因子的人纤维母细胞系CRL1506和EB病毒转化经克隆化的人B淋巴母细胞系N23两种条件培养液,对分泌肾综合征出血热病毒人单克隆抗体的人-鼠杂交瘤和人—(人—鼠)杂交瘤细胞系的生长、克隆化及抗体分泌有明显促进作用,并排除了白细胞介素2和白细胞介素4作用的可能性。结合文献报道,初步认为来自这两种条件培养液的杂交瘤生长因子很可能含有白细胞介素6。正确选择促进人—鼠杂交瘤生长、克隆化和抗体分泌的条件培养液,对于克服生产人单克隆抗体杂交瘤技术所存在的融合率低、克隆化难、抗体产量少等困难具有较大的应用价值。     

EBV-杂交瘤技术制备抗乳癌人单抗的研究

本研究用EBV-杂交瘤技术制备抗乳癌人单抗获得初步成功。实验中首先预选出病人血清对肿瘤相关抗原有强阳性反应的乳癌患者,取其引流区淋巴结细胞,去除T细胞。在体外用EBV转化。筛选出分泌阳性抗体的B细胞,扩增后与一株人-鼠骨髓瘤杂交株HMD-33融合,用含HAT-ouban 1640培基进行选择培养。融合后两周左右见有杂交瘤生长,融合率为38％,从中获得16株稳定分泌抗体的杂交瘤,抗体类型75％为人IgM余为人IgG或混合型,上清     

增加分泌单克隆抗体杂交瘤产量的短时PEG融合技术

本文评价了淋巴及骨髓瘤细胞混悬液与融合剂作用时间对杂交瘤克隆总数及分泌单克隆抗体的杂交瘤的影响。在不同时间用Sp2/0和FOX-NY骨髓瘤细胞与用羊红细胞免疫的鼠的脾细胞融合。最适融合时间是在37℃45秒内把融合剂加到混合细胞中(融合剂成份为0.5ml Kodak1450PEG,0.5ml二甲基亚砜,4.5ml磷酸缓冲盐水,pH7.0)。把此混合细胞逐渐稀释到50mlRPMI-1640中以终止融合过程。然后离心,重新将其悬浮于加滋养巨噬细胞的选择性培养液中培养。与常用的长时融合技术比较,本法用SP2/0作融合伙伴,杂交瘤产量约增加5倍,用FOX-NY时,增加30倍。这两种情况下,实际上所有孔都有分泌单克隆抗体的杂交瘤克隆。使用这个高效融合技术更利于产生针对弱抗原的单克隆抗体或缩短强抗原免疫所需要的时间。     

人-人杂交瘤单克隆抗体分泌的变异性

UC729-6细胞与淋巴结细胞一次性融合产生了几株人-人杂交瘤,对其所分泌和合成大分子类型和性质进行了鉴定。VLN3G2杂交瘤株生长4天后,分泌的IgG比细胞浆高4倍。而IgM的分布与IgG正相反。与VLN3G2不同,VLN5C7在同一时间内,胞浆中所含IgG与IgM的量比分泌型的量高出几倍。这二株杂交瘤所分泌的IgG和JgM,只有IgG对靶A431细胞表面抗原有免疫反应性。还有一株为VLN1H12,所分泌的IgM对靶A431细胞有免疫活性,未测到有IgG的分泌。反复冻融杂交瘤细胞制备的胞浆蛋白,NP-40的细胞膜提取获得膜蛋白,用ELISA检测各杂交瘤上清的分泌蛋白,以了解细胞和细胞外观察到的免疫蛋白的变异性。用于融合的亲本UC-729-6细胞系只产生微量无免疫活性的IgM。对这些杂交瘤上清的分子筛柱层折提示有完整IgG和IgM分子,缺乏游离重链或同时含有μ和γ量链的杂交抗体。用抗硫-蛋氨酸内标记VLN3G2杂交瘤细胞说明不仅有非免疫球蛋白存在,而且在培养上清有小分子量A蛋白结合多肽存在。从VLN3G2培养液,胞浆及细胞膜分离到的硫-蛋氨酸整合IgG和IgM抗体,也表明可与菌体A蛋白结合。因此本文结论就是,人-人杂交瘤分泌的MCAbs量的变异不是由于这些分子的合成减少所引起的。     

人—人杂交瘤免疫球蛋白分泌稳定性的研究

对三株人—人杂交瘤细胞株的免疫球蛋白分泌稳定性作了研究。研究中注意到用有限稀释法多次克隆的杂交瘤细胞(C_(10),13H_2)与未经克隆的细胞株(F_3)在体外培养和扩增中,其细胞形态大小,染色体数和抗体分泌能力有不同程度的变化。研究证实杂交瘤球蛋白分泌稳定性与染色体丢失或不分泌群体的过度生长有关。我们用HAT筛选培养液进行再处理,注意到C_(10)这一株细胞的四倍体细胞数明显增加,抗体分泌量也有所增加。结果提示对杂交瘤细胞及早克隆,或适时用HAT进行重筛选,对稳定分泌群体可能有一定的效果。     

鼠抗人4-1BB单克隆抗体的研制及其生物学特性的鉴定

目的:鼠抗人4-1 BB分子功能性单克隆抗体(mAb)的研制及其生物学特性的鉴定.方法:以高表达人4-1 BB分子的转基因细胞293T/4-1 BB为免疫原,常规免疫BALB/c小鼠,采用B淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合,并以293T/4-1BB为阳性抗体筛选细胞,293T/mock为阴性抗体筛选细胞,经免疫荧光标记和流式细胞术(FCM)分析、反复筛选和多次克隆化培养,筛选出特异分泌鼠抗人4-1BB分子mAb的杂交瘤细胞株;采用Western blot、间接免疫荧光法、竞争结合抑制试验、3H掺入和细胞凋亡分析等方法对mAb进行生物学特性的鉴定.结果:成功获得3株持续、稳定分泌鼠抗人4-1BB mAb的杂交瘤细胞株,命名为1G5、4B11和9F11.对mAb的生物学功能的研究结果表明,3株mAb均能识别活化T细胞和单核细胞来源的树突状细胞(Mo-DC)表达的4-1BB分子.mAb 4B11能有效地激发T细胞体外增殖、抑制其凋亡,并能促进Mo-DC体外扩增,上调CD80、CD83、CD86和CD1α的表达.结论:获得的3株分泌鼠抗人4-1BB mAb的杂交瘤,所分泌的抗体具有特异性地识别人4-1BB分子;其中4B1 1 mAb具有激发T细胞增殖及促进Mo-DC体外扩增与成熟的作用,为激发型4-1BB mAb.     

抗HLA抗原的抗体细胞空斑试验

本文作者建立了一种能够检测出产生抗HLA抗体的单个细胞的空斑试验。试验原理是用绿色荧光素(碳氧荧光素乙酰乙酸盐,CFDA)染活细胞,红色荧光素(Propidum iodide PI)染空斑内由抗体和补体作用溶解的细胞,在荧光显微镜下计数。标本干燥后可长期保存而不发生退色等改变。空斑形成的主要原理是细胞溶解,靶细胞释放荧光素,摄取PI而形成空斑。镜下可见桔红色的斑点,在其周围有带绿色荧光素的细胞围绕。靶细胞的来源是经EB病毒刺激后转化的淋巴母细胞。该细胞在加有L-谷氨酰胺和热灭活10%胎牛血清RPMI 1640培养液中培养,在其对数生长期收获,再用CFDA进行染色。抗体分泌细胞是通过鼠—鼠杂交瘤     

离体金黄地鼠气管器官培养的实验形态学研究

本文报告正常状态下金黄地鼠的体外器官培养变化。应用旋转培养方法,培养液用RPMI 1640及Eagle MEM,不论是否加小牛血清,培养的气管组织均可存活到8周。组织学及超微结构观察表明,培养1～4周内的气管上皮,保持着复层或单层柱状上皮结构,表面尚见纤毛,上皮细胞还没有明显的胞浆变性。细胞器如粗面内质网及线粒体等,还未见破坏。表层上皮细胞间的连接,也是常态的紧密连接。培养5周时,上皮表面大部分纤毛脱落,表层上皮细胞核变扁平、横位。7周以后,细胞结构出现退行性变化。放射自显影观察表明,上皮细胞核内仍有明显的~3HTdR掺入。本文认为,在一般条件下培养4周以内,气管上皮的超微结构较为完整,此时附加实验因素,开展实验病理研究是比较合适的。基础培养液Eagle MEM具有与RPMI 1640培养液相同的培养效果,无论从防止细胞增生引起培养组织的消耗,还是从经济观点考虑,在器官培养中使用基础培养液是值得推荐的。     

动物成骨细胞骨髓培养法的建立和鉴定

为评价改进的成骨细胞骨髓培养法,我们采用密度梯度离心新西兰大白鼠(SD)股骨骨髓中的单个核细胞,分散在含30%马血清的RPMI1640培养液中,按5×105/cm3细胞数量接种于96孔培养板内,置于含5%CO2、37℃饱和湿度培养箱中培养,每3d换培养液1次.细胞鉴定方法用活细胞形态学观察、瑞氏-姬姆萨染色和碱性磷酸酶(ALP)染色,为避免ALP的假阳性率,在破坏细胞内ALP后又作对照染色.结果显示从第5d开始,在倒置显微镜下可见培养细胞从原来的圆形逐渐变成多角形、梭形或鳞形,瑞氏-姬姆萨染色显示成骨细胞的特征性表现,ALP染色阳性在"2+”～"3+”之间,破坏ALP后对照染色阴性.提示,含30%马血清的RPMI1640培养液在体外能把骨髓的单个核细胞培养成为成骨细胞,同时,改进后的成骨细胞骨髓培养法具有培养时间短、污染机会少、工作效率高的优点.     

杂交瘤冻存的简便快速方法

本文介绍两种在96孔微培养板内冻存和复苏杂交瘤细胞的简便快速方法,可提高对杂交瘤的管理水平,以避免细胞的丢失。具体方法是:用福尔马林杀死的嗜肺军团菌(OLDA株)或鹌鹑肌细胞,分别免疫Balb/c小鼠。杀鼠取脾细胞,与Sp 2/O—Ag14小鼠浆细胞瘤细胞杂交得LD 8 a 2—3 D 8-1 B 7和MF 2-5 A6杂交瘤。通过间接免疫荧光试验检测杂交瘤所分泌的抗     

B细胞集落形成法及其临床应用

创立淋巴细胞系体外培养法,有利于用单一细胞集团分析免疫现象。T细胞克隆化已经成功,但B细胞克隆化尚未成功。本文介绍B细胞集落形成及其在临床上的应用。集落形成法主重是用不同浓度琼脂重层培养法。简言之,培养液由RPMI 1640加     

一株鼠抗人BTLA功能性单克隆抗体的研制及其生物学特性鉴定

为了研制鼠抗人BTLA功能性单克隆抗体,以高表达人BTLA分子的基因转染细胞L929/BTLA为免疫原,常规免疫BALB/c小鼠,采用B淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合,并以基因转染细胞293T/BTLA和293T/mock作为抗原,筛选阳性杂交瘤克隆,经间接免疫荧光标记和流式细胞术分析、反复鉴定和多次克隆化培养,筛选获得分泌特异性鼠抗人BTLA分子单克隆抗体的杂交瘤细胞株;采用Ig亚型快速定性试纸法、细胞核染色体计数、竞争结合抑制试验和T增殖抑制试验等对单抗进行生物学特性的鉴定。结果表明,成功获得一株持续、稳定分泌鼠抗人BTLA单克隆抗体的杂交瘤细胞株8H9,该单抗可特异性识别基因转染细胞以及静止与活化T淋巴细胞上表达的BTLA分子,单抗8H9和BTLA交联后能显著抑制鼠抗人CD3单抗对T细胞激发的增殖作用。     

适用于亲本瘤细胞和杂交瘤细胞生长的无血清培养基

以RPMI1640和DMEM-F12按1:1混合组成基础培养基(BM),再添加胰岛素等12种因子制成一种无血清培养基(SFM)。SP2/0等多种亲本瘤细胞以及异种、同种杂交瘤细胞均能在此SFM中适应生长,其细胞密度相当于含15%小牛血清的普通培养基的33%～120%。所有瘤细胞均能在SFM中长期传代培养,但贴壁性能有所降低,杂交瘤细胞能持续保持分泌单克隆抗体的能力。     

黄芪多糖定向诱生脐血来源树突状细胞及其对T细胞增殖作用的研究

目的：观察黄芪多糖（Astragalus polysaccharides，APS）体外对脐血单核细胞定向分化为树突状细胞（DCs）及其对T细胞的刺激增殖作用。方法：无菌条件下采集脐血，密度梯度离心法获得脐血单个核细胞分为3组，实验组：在含有APS（浓度为100mg/L）的RPMI1640完全培养液中培养；阴性对照组：在无药物的RPMI1640完全培养液中培养；阳性对照组：在含有细胞因子（IL-4、GM-CSF、TNF-α）的RPMI1640完全培养液中培养；培养过程中用倒置光学显微镜和扫描电镜观察细胞形态；收集部分培养第12天的细胞利用流式细胞仪检测各组细胞表面CD1a、CD80、CD83和CD86的表达；收集实验组培养第12天的细胞（DCs），作为刺激细胞；分离制备健康志愿者异基因外周血单核细胞（MNC），作为反应细胞混合培养，MTT比色法检测DCs对同种异体T细胞的刺激增殖作用。结果：在培养的第72小时后实验组和阳性对照组细胞形态开始变化，随着培养时间的延长，树突状结构更加明显，第12天细胞呈典型的树突状细胞形态；阴性对照组细胞生长缓慢，培养至第12天细胞呈梭形巨噬细胞形态。培养至10天的实验组细胞扫描电镜下呈典型的树突状细胞形态。培养12天实验组、阳性对照组细胞分别高表达DCs特异性抗原CD1a、CD80、CD83和CD86，与阴性对照组对应比较差异均有显著性（P〈0.01）；实验组与阳性对照组之间比较无统计学意义（P〉0.05）。混合淋巴细胞反应显示经黄芪多糖诱生的DCs对同种异体T淋巴细胞具有明显刺激增殖作用。结论：黄芪多糖及细胞因子体外均可诱导脐血单核细胞（DCs前体细胞）定向分化为功能性（成熟）DCs；黄芪多糖诱生的DCs具有明显刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力，且随DCs细胞数量的增加而作用增强。     

鼠抗人OX40L功能性单克隆抗体的研制及其生物学特性的鉴定

目的　鼠抗人OX4 0L分子功能性单克隆抗体的研制及其生物学特性的鉴定。方法以高表达人OX4 0L分子的转基因细胞L92 9/OX4 0L为免疫原 ,常规免疫BALB/c小鼠 ,采用B淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合 ,并以L92 9/OX4 0L为阳性抗体筛选细胞 ,L92 9/mock为阴性抗体筛选细胞 ,经免疫荧光标记和流式细胞术分析、反复筛选和多次克隆化培养 ,筛选出特异分泌鼠抗人OX4 0L分子单克隆抗体的杂交瘤细胞株 ;采用Westernblot、Ig亚型快速定性试纸法、间接免疫荧光法、竞争结合抑制试验和3 H TdR增殖试验等对单抗进行生物学特性的鉴定。结果　成功获得 3株持续、稳定分泌鼠抗人OX4 0L单克隆抗体的杂交瘤细胞株 ,命名为 9H10、4C12和 1G1。对单抗的生物学功能的研究结果表明 ,3株单抗均能识别活化B细胞和成熟DC表达的OX4 0L分子 ,且能抑制成熟DC对T细胞的促增殖作用 ,并与阻断型抗人B7 1单抗具有协同作用。结论　获得的 3株分泌鼠抗人OX4 0L功能性单克隆抗体的杂交瘤 ,所分泌的抗体具有特异性地识别人OX4 0L分子并能阻断OX4 0 /OX4 0L共刺激信号及抑制DC对T细胞的激发作用。     

粉防己碱对乳腺癌细胞系生长的影响

乳腺癌是一种严重影响妇女身心健康甚至危及生命的最常见的恶性肿瘤之一。我们报道粉防己碱(tetrandrine,Tet)对体外乳腺癌细胞系Bca-111生长的影响,以探索粉防己碱对乳腺癌的作用及其机制。Bca-111人乳腺癌细胞系由中国医学科学院基础医学研究所建系,细胞生物室保存、复苏。粉防己碱由中国药品生物制品检定所提供。RPMI1640培养粉购自LifeTechnologies公司,胎牛血清购自天津奶牛研究所,二甲基亚砜(DMSO),北京化工厂(分析纯),噻唑蓝(MTT),Sigma公司。常规配制RPMI1640培养液,0.25%的胰酶,0.4%台盼蓝液。粉防己碱以DMSO助溶后,用双…     

肺鳞癌细胞单克隆抗体的建立及鉴定

 目的 制备出高效价的抗人肺鳞癌单克隆抗体。方法 以云南个旧肺鳞癌细胞YTMLC -90免疫的Balb/C小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤NS-1、SP2/0细胞为亲代细胞,应用鼠-鼠杂交瘤技术建立杂交瘤细胞系。ELISA法筛选,有限稀释法克隆化培养,ELISA法测定抗体效价,双抗体夹心法鉴定Ig亚类,制备染色体,Giemsa染色计数染色体数目,ABC免疫组化法行不同组织细胞的交叉检测。结果 获得三株稳定分泌抗YTMLC-90细胞抗体的杂交瘤细胞株S2D1、N2D1及N3C5。培养上清效价分别为1∶512、1∶284及1∶1024,腹水效价分别为1∶105、1∶104及1∶104;Ig亚类分别为IgG1、IgG2a及IgG3;染色体众数在90～110之间;三株抗人肺鳞癌单克隆抗体与其它组织细胞无交叉反应性。杂交瘤细胞体外传代培养6个月仍保持抗体稳定分泌。结论 成功制备高效且特异的抗人肺癌单克隆抗体。     

一株鼠抗人4-1BBL功能性单克隆抗体的研制及其生物学特性的研究

目的：鼠抗人4—1BBL功能性单克隆抗体的研制及其生物学特性的鉴定。方法：以高表达人4—1BBL分子的基因转染细胞L929／4—1BBL为免疫原，常规免疫BALB／c小鼠，采用B淋巴瘤杂交瘤技术进行细胞融合，经流式细胞术分析和多次克隆化培养，筛选特异性杂交瘤细胞株；采用Ig亚型快速定性试纸法、染色体核型分析、竞争结合抑制试验、间接免疫荧光法对单抗的生物学特性进行鉴定，并采用体外细胞计数和ELISA检测分析单抗对单核细胞的作用。结果：获得1株持续、稳定分泌鼠抗人4-1BBL单抗的杂交瘤细胞株，命名为3E7。该单抗能识别人白血病细胞株和单核细胞表面的4-1BBL分子。对单抗生物学功能的研究结果表明，该单抗能有效地促进外周血单核细胞体外生长，并促进IL-6和TNF-α的分泌。结论：成功地获得了一株鼠抗人4-1BBL功能性单克隆抗体3E7，该单抗能特异地识别人4-1BBL分子，并有效地通过激发4-1BBL逆向信号通路促进单核细胞的体外生长及细胞因子的分泌。