缺氧-复氧对大鼠海马培养神经元Bcl-2、Bax表达和神经元凋亡的影响

目的 观察缺氧-复氧对体外培养海马神经元Bcl-2和Bax表达和神经元凋亡的影响。方法 取培养12d的海马神经元，置于恒温(36℃)密闭容器内，连续充以无氧气体[90％(体积分数)N2、10％(体积分数)CO2]，在缺氧条件下继续培养4h后，再于常氧培养箱内复氧培养24h和72h。于不同时间观察神经元存活数，并分别用抗Bcl-2和Bax抗血清进行免疫组织化学染色，观察缺氧-复氧后大鼠海马培养神经元Bcl-2和Bax表达。并用原位末端标记(TUNEL)法和流式细胞术分别检测缺氧-复氧对体外培养海马神经元凋亡的影响。结果 缺氧-复氧后24～72h,海马神经元对Bcl-2的表达逐渐减弱，对Bax的表达逐渐增强，对Bax／Bcl-2比值逐渐增大，凋亡神经元百分率逐渐增多。结论 缺氧-复氧后24～72h神经元凋亡的发生与神经元Bcl-2表达逐渐减弱，Bax表达逐渐增强，Bax／Bcl-2比值逐渐增大有关。     

刺五加皂甙对皮质神经元缺血缺氧性损伤的保护作用

目的探讨刺五加皂甙(ASS)对皮质神经元缺血缺氧性损伤的保护作用。方法胎鼠皮质神经元经缺血缺氧和谷氨酸(Glu)作用模拟缺血性皮质神经元损伤模型。随机分成缺血缺氧组(HI组)、Glu组、ASS组和对照组;ASS组在实验前、中均加入终浓度为50mg/L的ASS。用流式细胞仪检测神经元凋亡率,用硝酸还原酶法测定细胞培养上清液中一氧化氮(NO)的含量,用3[4,5二甲基磺胺噻唑]2,5二苯基四唑溴化物(MTT)比色法、乳酸脱氢酶(LDH)释放量测定神经元活性,电镜下观察细胞形态学变化。结果(1)随着缺血缺氧时间延长神经元存活率逐渐下降,至缺血缺氧8h达到高峰;Glu作用的神经元,其存活率随作用时间延长而下降。(2)HI组及Glu组皮质神经元存活率显著低于正常对照组,LDH释放量、NO含量及凋亡率均显著高于对照组(均P<0.05);与HI组和Glu组比较,HI ASS组及Glu ASS组皮质神经元的存活率显著升高,而LDH释放量、NO含量及凋亡率均显著降低(均P<0.05)。结论ASS能提高缺血神经元存活率、降低凋亡率,抑制NO和LDH释放,从而起到神经保护作用。     

凋亡敏感基因在短暂性缺氧再复氧复注血清后的大鼠星形胶质细胞中的表达及其意义

目的研究一种新发现的抗氧化蛋白质--凋亡敏感基因(SAG)在短暂性缺氧再复氧复注血清诱导的细胞坏死和凋亡中的作用.方法用短暂性缺氧再复氧复注血清来诱导原代培养的大鼠大脑皮质星形胶质细胞损伤,用免疫细胞化学方法检测凋亡敏感基因的表达,并作图像分析;用流式细胞仪检测胶质细胞在短暂缺氧再复氧复注血清后不同时间点的凋亡率.结果凋亡敏感基因在缺氧15 min再复氧复注血清5 h后表达最高,在复氧复注血清16 h后恢复至对照组水平;细胞凋亡率在缺氧15 min再复氧复注血清1h时达到最高,而在再复氧复注血清5 h后降至对照组水平.结论凋亡敏感基因具有抗凋亡的作用,可减轻星形胶质细胞的缺血再灌注损伤.     

依达拉奉对培养乳鼠海马神经元缺氧复氧损伤的保护作用

目的:探讨依达拉奉对海马神经元缺氧复氧损伤的保护作用及其机制。方法:制备培养乳鼠海马神经元缺氧复氧损伤模型,分别用依达拉奉1、10、100、300μmol·L-1干预后研究依达拉奉对脂质过氧化及细胞凋亡的作用。结果:海马神经元在缺氧复氧损伤后,依达拉奉干预能降低脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量,增加细胞内超氧化物歧化酶(SOD)活性,减少神经元凋亡。结论:缺氧复氧损伤后,依达拉奉具有清除氧自由基、抑制脂质过氧化及降低细胞凋亡率的作用。     

刺五加皂甙对谷氨酸毒性神经元凋亡的保护作用

目的观察神经元在谷氨酸毒性损伤时一氧化氮(NO)的动态变化及其与凋亡的关系,探讨刺五加皂甙(ASS)的有效保护浓度。方法采用谷氨酸(Glu)诱导的皮质神经元凋亡模型。随机分成Glu组、正常对照组及ASS3组;用流式细胞仪检测神经元凋亡率,用硝酸还原酶法测定细胞培养上清液中NO的含量,用MTT法测定神经元存活率并在电镜下观察细胞形态学变化。结果(1)Glu呈剂量和时间依赖性增加神经元培养液中NO含量,ASS能不同程度地减少NO含量;(2)与Glu共培养的神经元,其存活率呈剂量和时间依赖性下降,ASS能增加神经元存活率;(3)经Glu处理的神经元发生凋亡,细胞超微结构呈现凋亡样改变,其凋亡率与正常对照组比较有显著性差异(P<0.01)。ASS能减少Glu毒性神经元凋亡。结论NO介导了Glu毒性神经元凋亡,ASS可能通过抑制NO的释放及其神经毒性作用,拮抗Glu引起的神经元凋亡。     

刺五加皂甙对神经元谷氨酸毒性损伤的保护作用

目的:观察不同谷氨酸浓度和谷氨酸作用不同时间对神经元活性的影响,探讨细胞损伤后刺五加皂甙(ASS)的有效保护浓度。方法:取孕13～15dICR小鼠,无菌条件下对胎鼠大脑皮层神经元进行原代分离培养,建立谷氨酸诱导的皮层神经元损伤模型。用MTT、LDH测定神经元活性,用硝酸还原酶法测定细胞培养上清液中NO的含量,用流式细胞仪检测细胞凋亡率,并在电镜下观察细胞形态学变化。结果:①经谷氨酸处理的神经元,其细胞存活率呈剂量和时间依赖下降、ASS能不同程度提高细胞存活率。②谷氨酸处理组的神经元凋亡率、LDH释放量和NO含量均升高,与正常对照组及ASS组比较有明显差异(P<0.01)。结论:一定浓度的ASS对谷氨酸引起的神经元损伤有保护作用;ASS可能是通过抑制NO的释放和稳定细胞膜,拮抗细胞元损伤。     

大鼠成年海马神经干细胞体外氧糖剥夺/复氧模型的建立

目的 探讨一种简便、稳定、可重复的大鼠成年神经干细胞体外氧糖剥夺/复氧模型的制备方法 .方法 以来自于成年Fisher344大鼠的海马神经干细胞系为研究对象,以无血清培养基培养并传代,并用nestin和DAPI免疫荧光双染确认其生物学特性.将三气培养箱氧气浓度调至1％以制备缺氧环境,将培养基换为不含葡萄糖的Earle′s平衡盐溶液,分别缺氧缺糖2h、4h、6h、8h、10h后取出细胞,恢复正常条件继续培养24 h后倒置显微镜下观察细胞形态学变化,CCK-8比色法检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡率.同时设置常氧常糖的正常对照组.结果 与正常对照组相比,缺氧缺糖2h组细胞吸光度值明显升高,细胞存活率有一定的增长,但差异无统计学意义(P＞0.05).随着缺氧缺糖时间延长,神经干细胞形态学损伤逐渐加重,细胞吸光度值逐渐下降,缺氧缺糖6h后与正常对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05);缺氧缺糖6h起细胞存活率均较正常对照组明显下降,比较差异有统计学意义(P＜0.05);神经干细胞凋亡率逐渐增高,且均明显高于正常对照组,差异有统计学意义(P＜0.05),其中缺氧缺糖6h时细胞的凋亡率已超过50％.结论 利用三气培养箱物理缺氧方法 可成功建立一种简便、有效的神经干细胞体外氧糖剥夺/复氧模型.     

缺氧/复氧条件下星形胶质细胞水通道蛋白4和5表达变化的研究

目的：观察缺氧/复氧条件下星形胶质细胞水通道蛋白（AQP）4和5表达的变化,探讨脑缺血再灌注后脑水肿与AQP4和AQP5的关系。方法：取新生24h内的SD大鼠皮质新鲜脑组织,进行原代和传代培养。以95%N2和5%CO2造成细胞缺氧,用倒置相差显微镜对细胞进行形态学观察,用锥虫蓝染色法测定缺氧及复氧后不同时间点星形胶质细胞的死亡数以反映星形胶质细胞的存活能力,应用细胞免疫化学技术测定星形胶质细胞缺氧及复氧后各个时间点AQP4、AQP5表达的变化。结果：缺氧4及8h后细胞形态变化不明显,随着复氧时间的延长出现细胞损伤的表现。与对照组比较,缺氧后4及8h有少量细胞死亡（P〈0.05）,随着复氧时间延长细胞死亡数亦逐渐增多（P〈0.01）;缺氧4及8h后,AQP4、AQP5阳性表达细胞数均减少（P〈0.01）,而复氧后AQP4、AQP5阳性表达细胞数逐渐升高并随时间延长呈增高趋势（P〈0.01）。结论：星形胶质细胞对缺氧的耐受能力较强,但复氧时出现明显损伤;AQP4、AQP5表达的变化与缺血-再灌注损伤后脑水肿存在相关性。     

亚低温对缺氧/复氧条件下星型胶质细胞AQP4表达的影响

目的:探讨亚低温对缺氧/复氧条件下星形胶质细胞（astrocytes,AS）AQP4表达变化的影响。方法:分离新生24h内的SD大鼠皮质,进行星形胶质细胞培养,分为正常对照组(C)、常温缺氧/复氧组(H)、亚低温干预缺氧/复氧组(M)。用台盼蓝染色法测定37℃及32℃时缺氧/复氧不同时间点AS的存活率,对细胞进行形态学观察,应用细胞免疫化学技术检测缺氧/复氧各个时间点AQP4的表达水平。结果:(1)与对照组比较,常温组缺氧后4h及8h有少量细胞死亡(P＜0.05),随着复氧时间延长死亡细胞数亦逐渐增多（P＜0.01）;缺氧4h及8h时,亚低温组细胞死亡数与常温组比较无明显差异,从复氧4h开始,亚低温组细胞死亡数明显少于常温组(P＜0.05)。(2)常温组缺氧4h及8h后,AQP4阳性表达细胞数减少(P＜0.01),而复氧后AQP4阳性表达细胞数逐渐升高并随时间延长呈增高趋势(P＜0.01)。至复氧后8h,亚低温组缺氧/复氧时AQP4阳性表达细胞数均较常温组减少(P＜0.05)。结论:亚低温干预条件下,星形胶质细胞AQP4表达水平降低,可能是亚低温神经保护作用机制之一。     

RNAi抑制星形胶质细胞Cx43对缺氧/再复氧后细胞凋亡的影响

目的探讨RNA干扰技术对星形胶质细胞Cx43蛋白的抑制作用以及对细胞缺氧/再复氧后凋亡的影响。方法化学合成针对大鼠Cx43基因的小干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA)及其阴性RNA,通过脂质体转染体外培养原代星形胶质细胞,Western blot检测Cx43蛋白表达情况,MTT法检测siRNA转染对细胞的毒性作用;通过流式细胞术观察抑制Cx43蛋白对星形胶质细胞缺氧/再复氧后细胞凋亡情况的影响。结果 Western blot结果可见,转染siRNA后12h,Cx43蛋白表达开始抑制,48h抑制最明显,MTT结果显示siRNA组和脂质体组的细胞活性明显低于未转染组(P0.05),siRNA组与脂质体组未见明显区别(P0.05);流式细胞术示缺氧12h复氧不同时间,凋亡率逐渐增加,复氧48h凋亡率最高,siRNA干扰组明显低于正常对照组(P0.05)。结论 RNAi技术是研究Cx43功能的一种有效方法,siRNA转染能有效抑制星形胶质细胞Cx43蛋白表达,siRNA转染时,细胞毒性来自脂质体;siRNA抑制Cx43蛋白能够明显减轻星形胶质细胞缺氧/再复氧后的细胞凋亡。     

缺氧对海马培养细胞人重组白细胞介素-6免疫组化反应的影响

本文观察了缺氧对体外培养海马细胞中rhIL-6免疫反应的影响。结果显示，体外培养的海马神经元和神经胶质细胞的rhIL-6呈弱阳性免疫反应，缺氧1～4h后神经元和神经胶质细胞的rhIL-6免疫组化反应明显增强。对免疫染色细胞作图像分析结果显示，缺氧后神经元和神经胶质细胞的平均光密度较缺氧前增加，尤以缺氧2h时最明显，之后随缺氧时间延长，神经元和神经胶质细胞的平均光密度又逐渐减弱。上述结果表明，海马脑区存在rhIL-6免疫反应细胞；缺氧条件下rhIL-6免疫组化反应增强，提示rhIL-6可能参与脑缺氧损伤的调控。     

大鼠急性局灶性脑挫裂伤后神经细胞线粒体膜电位变化及其意义

目的 研究大鼠急性局灶性脑挫裂伤后神经细胞线粒体膜电位变化及其意义. 方法 70只SD大鼠采用随机数字表法分为假手术组(n=10)和脑损伤组,损伤组按伤后1、6、24、48、72和168 h观察时间点分为6个亚组(n=10).用Feeney氏自由落体撞击法制作重型颅脑损伤模型.利用激光扫描共聚焦显微镜观察损伤后不同时间荧光探剂JC-1标记的活体脑片细胞线粒体膜电位的动态变化,应用Hochest33342荧光染色和Tunel法观察神经细胞凋亡程度,透射电镜观察神经细胞超微结构. 结果 (1)与假手术组相比,损伤组脑皮质神经细胞线粒体膜电位在伤后1 h即开始显著降低.24h降至最低,之后一直无恢复(P<0.01).(2)Hochest33342荧光染色发现神经细胞呈现凋亡的特征.(3)Tunel染色显示损伤组在1 h可见少量阳性细胞,6h阳性细胞数明显增加.48h达峰值,与假手术组比较差异有统计学意义(P<0.05),与线粒体膜电位下降时间比较延迟24 h.(4)电镜发现脑损伤后6h神经细胞核发生染色质散在,核仁边集.细胞核核膜增宽等凋亡特征;24h出现核皱缩,核内染色质溶解. 结论 创伤性脑损伤早期(<1 h)神经细胞线粒体膜电位即下降.并引起神经细胞凋亡.     

nNOS抑制剂在大鼠海马缺氧损伤的保护作用

目的为进一步证实缺血、缺氧时神经原性ＮＯ的神经毒性作用。方法在大鼠离体海马脑片上,应用微电极记录技术,研究ｎＮＯＳ抑制剂７－ＮＩ对缺氧所致神经元损害的保护作用。结果ｎＮＯＳ抑制剂７－ＮＩ对海马脑片缺氧后群峰电位（ＰＳ）变化较对照组显著减小。结论７－ＮＩ对海马脑片缺氧损伤有明确保护作用。作用机理可能是７－ＮＩ抑制ｎＮＯＳ活性降低缺氧后海马神经原性ＮＯ的过多形成,从而提高海马脑片抗缺氧损伤的能力,更加明确了缺氧早期神经原性ＮＯ的神经毒性作用。     

常压缺氧性脑损伤小鼠血清蛋白质表达谱的变化及意义

目的观察常压缺氧小鼠脑组织损伤之特点及其血清差异蛋白质表达,探寻常压缺氧性脑损伤的生物标志蛋白。方法60只雌性昆明小鼠,随机分为正常对照组和常压缺氧组,建立常压缺氧小鼠模型并按缺氧持续时间分为缺氧1周、2周和3周组,分别检测血清和脑组织中超氧化物歧化酶活性和丙二醛含量;应用弱阳离子交换芯片结合表面增强激光解析电离飞行时间质谱技术分析常压缺氧后不同时间血清蛋白质表达谱的变化。结果常压缺氧后小鼠血清超氧化物歧化酶活性逐渐降低,其中缺氧3周组与正常对照组之间差异有统计学意义（P〈0.01）;常压缺氧2周组小鼠血清丙二醛含量明显升高,与正常对照组和缺氧1周组比较差异有统计学意义（均P〈0.01）。常压缺氧后各亚组小鼠脑组织中超氧化物歧化酶活性与正常对照组比较差异无统计学意义（均P〉0.05）;常压缺氧后脑组织中丙二醛含量呈升高趋势,缺氧2周组和3周组与正常对照组比较差异有统计学意义（均P〈0.01）。弱阳离子交换芯片结合质谱分析共获得342个血清蛋白质峰,其中相对分子质量为3500、3578、3706、3516和4130等5个蛋白质峰的相对强度在缺氧性脑损伤后升高,与正常对照组相比差异有统计学意义（P〈0.05）;另有73个蛋白质峰分布于各缺氧组但在正常对照组中未检测到。这78个蛋白质峰中30个蛋白质峰于缺氧后≤2周表达,48个蛋白质峰于缺氧2周后表达。结论常压缺氧可引起小鼠脑组织损伤,使血清及脑组织中与氧自由基相关的酶活性发生改变,血清超氧化物歧化酶活性降低,血清及脑组织中丙二醛含量升高;并可改变血清蛋白质的表达谱。提示血清中出现的部分蛋白质可能为常压缺氧性脑损伤诱导的血细胞基因表达产物,在血清中所检测到的差异蛋白质以及缺氧后新出现的蛋白质可能是脑损伤的生物标志蛋白。     

Nitric oxide is involved in anoxic preconditioning neuroprotection in rat hippocampal slices

Sublethal anoxia/ischemia protects against subsequent damaging insults in intact brain or hippocampal slices. To help further understand mechanisms underlying anoxic/ischemic preconditioning, we tested three hypotheses which were that: (a) anoxic preconditioning (APC) improves electrical recovery in rat hippocampal slices; (b) anoxic preconditioning requires nitric oxide (NO); and (c) anoxic preconditioning blocks mitochondrial dysfunction that occurs following re-oxygenation after anoxia. Control hippocampal slices underwent a single 'test' anoxic insult. Experimental slices were preconditioned by 3 short anoxic insults prior to the 'test' insult. Evoked potentials (EPs), and NADH redox status were recorded prior to, during and after preconditioning and/or 'test' anoxic insults. To examine the role of NO, studies sought to determine whether APC could be produced by the NO donor, DEA/NO, and whether APC could be inhibited by NO synthase (NOS) inhibitor (7-nitroindazole). EP amplitudes recovered significantly better after reoxygenation in preconditioned slices and after NO-emulated preconditioning (90.0+/-17.7% and 90.0+/-21.3%, respectively, n=9, ** p<0.01, vs. 17.0+/-7.9%, n=9, in control slices). Inhibition of NOS blocked APC protection (6.8+/-6.8%, n=9). The intensity of NADH hyperoxidation was not significantly different among groups following 'test' anoxia. These data confirm that preconditioning by anoxia improves electrical recovery after anoxia in hippocampal slices. Evidence supports that NO from constitutive hippocampal NOS may be involved in the neuroprotection afforded by preconditioning by a mechanism that does not change the apparent mitochondrial hyperoxidation after anoxia.     

人重组白细胞介素-6对缺氧后海马培养神经细胞Fos表达的影响

用免疫组化方法，观察缺氧诱导体外培养大鼠海马神经细胞Fos表达及人重组白细胞介素-6（rhIL－6）的影响。结果显示，经rhIL－6孵育的海马神经细胞缺氧后Fos免疫反应阳性胞核的百分率和Fos免疫反应阳性胞核的平均光密度均明显低于对照组，表明缺氧能诱导体外培养海马神经细胞Fos的表达，rhIL－6能抑制缺氧神经细胞Fos的表达。提示rhIL-6可能参与脑缺氧损伤的调控。     

Effect of recurrent epileptiform discharges induced by magnesium-free treatment on developing cortical neurons in vitro

As seizures in infants and children often originate from the neocortex, neocortical epilepsy models may be appropriate for studying epileptiform activity and seizure-induced injury in the developing nervous system. However, the characterization of epileptiform activity or seizure-induced injury in cultured developing cortical neurons has seldom been reported. Therefore, We attempted to establish a cultured developing cortical neuronal epilepsy model, and to study the subsequent effect on neurons. Cultures were exposed to Mg(2+)-free media for 3 h, and then returned to regular media. Using whole-cell patch-clamp intracellular recording techniques, we found that spontaneously recurrent epileptiform discharges for at least 72 h could be induced after transient Mg(2+)-free treatment. Neuron morphology following Mg(2+)-free treatment demonstrated no prominent alterations. At different time points (6, 24 and 72 h) after Mg(2+)-free treatment, neuronal viability, identified by trypan blue staining and LDH activity, and apoptosis, measured by flow cytometry, showed modest but non-significant (P>0.05) changes compared with the age-matched control group after various culture periods (6 and 17 days) in vitro. Mitochondrial metabolic activity, measured by MTT assay, significantly decreased by 15% at 6 h after Mg(2+)-free treatment (P<0.05) in neurons cultured for 6 days, and at 24 h showed a 29% decrease in neurons cultured for 17 days (P<0.05). In conclusion, brief Mg(2+)-free treatment constitutes a cultured developing cortical neuron 'seizure' model, and can induce transient mitochondrial dysfunction without cell loss.