ACC-M与ACC-2细胞差异表达基因的研究

目的 对人唾液腺腺样囊性癌肺高转移细胞株(ACC—M)和肺低转移细胞株(ACC—2)差异表达的部分基因进行克隆和蛋白表达研究。方法 应用cDNA基因表达谱芯片，对ACC—2及ACC—M细胞所检测的基因差异表达数据，结合NCBI和生物信息学软件分析技术，利用RT—PCR方法，克隆ACC—2和ACC—M表达有显著差异基因的EST，将得到的EST重组至质粒PET—24a—d( )中，构建表达质粒；质粒转化大肠杆菌BL21，经IPTG诱导后表达目的蛋白。结果 克隆了RAB7L1、h4F2hc、G8、L6、KlAA0119共5个差异表达基因，成功构建表达载体，EST测序结果与GeneBank对照一致，5个EST均可表达目的蛋白。结论 从ACC—2和ACC—M细胞差异表达基因中，可克隆到能够表达目的蛋白的新基因，这些基因可能与腺样囊性癌转移表型产生有关。     

BDNF对唾液腺腺样囊性癌细胞株抗失巢凋亡能力和转移的影响

目的：观察脑源性神经营养因子（BDNF）对唾液腺腺样囊性癌细胞系抗失巢凋亡能力和转移的影响，揭示BDNF与唾液腺腺样囊性癌高转移特性的关系。方法：以唾液腺腺样囊性癌（SACC）高、低转移细胞系ACC-2和ACC—M为研究对象，利用MTT、悬浮培养、流式细胞仪、软琼脂克隆形成实验观察BDNF对SACC细胞系体外培养过程中增殖和抗失巢凋亡的影响。以SPSS10．0软件对实验结果进行配对t检验。结果：ACC-2和ACC—M在体外培养过程中均具有一定的抗失巢凋亡能力，且ACC—M高于ACC-2（P〈0．01）。25、50、100ng/mlBDNF对ACC-2和ACC—M增值均无显著影响（P〉0．05）。50ng／ml BDNF可以显著提高ACC-2的抗失巢凋亡能力（P〈0．01）和克隆形成（P〈0．01）。结论：SACC的转移特性与抗失巢凋亡能力相关，适合浓度的BDNF可以提高SACC的抗失巢凋亡能力。     

白血病抑制因子受体在人涎腺腺样囊性癌细胞系中的表达

目的 :探讨白血病抑制因子受体 (LIFR)与人涎腺腺样囊性癌转移的相关性。方法 :以涎腺腺样囊性癌细胞系ACC 2及其肺高转移株ACC M作为研究肿瘤转移分子机制的模型 ,应用RT PCR技术和免疫组化方法检测LIFR的表达。结果 :RT PCR检测表明LIFRmRNA在肺高转移细胞株ACC M细胞中的表达低于在ACC 2细胞中的表达 ,免疫组化检测表明LIFR蛋白在ACC M细胞中表达降低。结论 :LIFR在涎腺腺样囊性癌转移过程中可能发挥抑制作用。     

ADAM9、ADAM10基因沉默对腺样囊性癌高转移潜能细胞生物学行为的影响

目的：探讨ADAM9、ADAM10基因沉默对腺样囊性癌高转移潜能细胞生物学行为的影响。方法：采用免疫组化检测15例腺样囊性癌原发灶和相应淋巴结转移组织中ADAM9、ADAM10蛋白的表达情况;采用RNA干扰方法抑制腺样囊性癌高转移潜能细胞系ACC-M、SACC-LM中ADAM9、ADAM10基因的表达,检测该基因沉默后对肿瘤细胞周期及体外增殖、转移能力的影响。采用SPSS11.0软件包对数据进行单因素方差分析及Fisher确切概率检验。结果：ADAM9、ADAM10蛋白在腺样囊性癌淋巴结转移组织中的表达比在原发灶组织中显著增高（P〈0.05）;ADAM9、ADAM10基因沉默后细胞增殖能力下降（P〈0.05）,肿瘤细胞出现S期阻滞;并且ADAM9、ADAM10基因沉默后,肿瘤细胞的体外侵袭能力显著下降（P〈0.01）。结论：ADAM9和ADAM10基因表达与腺样囊性癌的转移有关。ADAM9、ADAM10基因沉默可改变腺样囊性癌细胞体外增殖能力、侵袭能力等生物学特性。     

肝素对ACC-M细胞与血小板粘附影响的体外实验研究

目的 :通过肝素体外对涎腺腺样囊性癌肺高转移细胞株ACC M细胞与血小板粘附影响的实验 ,了解肝素抗ACC M肺转移的作用及其机制。方法 :健康成年人静脉血 ,制备富血小板血浆 (PRP) ,调整PRP血小板数至 2× 10 8/ml加入 1mMCaCl2 、1mMMgCl2 ,加入 2 4孔细胞培养板中 ,按不同分组要求在不同时间加入相应剂量的肝素后 3 7℃孵育 ,在不同时间消化贴壁粘附细胞 ,用 1%多聚甲醛固定后 ,用计数板进行细胞计数 ,计算粘附率。结果 :肝素体外对涎腺腺样囊性癌肺高转移细胞株ACC M细胞与血小板粘附有明显抑制作用。结论 :肝素体外对涎腺腺样囊性癌肺高转移细胞株ACC M细胞与血小板粘附有明显抑制作用 ,其机制可能是肝素通过与肿瘤细胞P 选择素配体的竞争作用抑制了P 选择素中介的血小板对肿瘤细胞的包被。     

腺样囊性癌肺转移模型的动态观察

目的通过增强型绿色荧光蛋白（pEGFP-1）的转化和导入ACC—M细胞株，筛选出ACC-M-GFP细胞，并在模拟的肺环境下，建立腺样囊性癌肺转移灶的动态观察模型。方法利用基因转化技术制备高纯度的pEGFP-1真核表达质粒。利用阳离子脂质体介导的基因转染技术培养ACC—M-GFP细胞。体内接种4周后建立模拟肺环境，并用激光共聚焦显微镜观察。结果从接种的第2周开始，随接种时间延长，荧光细胞集落的数量和荧光强度逐渐增加，到第4周时荧光表达强烈，多数成片分布。观察结果同时显示仅有极少数的转移细胞有能力形成集落。结论成功建立了腺样囊性癌肺转移灶的动态观察模型，这一模型为早期转移肿瘤细胞的捕获和分析提供了较好的平台。     

腺样囊性癌肺转移相关蛋白质的筛选鉴定

目的　初步筛选和鉴定人涎腺腺样囊性癌肺转移相关蛋白质。方法　利用腺样囊性癌细胞株 (ACC 2 )及其肺高转移细胞株 (ACC M) ,通过蛋白质组学方法 ,差减处理 ,发现两细胞株间蛋白质表达的差异 ,并对差异蛋白质点进行分析鉴定。结果　发现ACC 2和ACC M细胞系之间有 12个蛋白质点表达水平明显不同。其中转酮醇酶、v Ha ras蛋白等在ACC 2中低表达 ,在ACC M中高表达 ;肿瘤坏死因子超家族成员 4 (配合基 )在ACC 2中高表达 ,在ACC M中低表达 ,Pirin仅在ACC 2中表达。结论　 12个差异蛋白质可能通过不同途径参与腺样囊性癌肺高转移 ,为研究腺样囊性癌肺转移提供新的线索     

nm23—h1基因导入对腺样囊性癌分化的影响

目的 探讨nm23h1基因对腺样囊性癌细胞分化的影响。方法 体外用了子脂质体介导nm23－h1质粒转染人口腔涎腺样囊性癌（ACC）细胞株,筛选出转染阳性细胞克隆,并植入4只裸鼠颌面部,3w后获取标本,石蜡包埋后进行常规组织学及免疫组织化学检查,实验以未转染的阴性细胞克隆植入4只裸鼠作对照。结果 nm23－h1阳性ACC植入裸鼠体内后肿瘤细胞有向原代细胞回归的倾向,即由实体型向筛状型或管状型转变,肿瘤细胞周围的肿瘤间质增多,巢状的肿瘤细胞外围有基底膜样结构;肿瘤细胞在体内增殖的过程中,表达nm23－h1的细胞数量有逐渐减少、表达强度减弱的趋势。结论 以nm23-h1为靶基因的治疗同时具有抑制转移和促进分化的作用,具有较大的研究价值和临床应用前景。     

紫杉醇抗涎腺腺样囊性癌远处转移的实验研究

目的　观察紫杉醇对涎腺腺样囊性癌细胞远处转移的作用及其对转移灶肿瘤细胞凋亡的影响。方法　用ACC -M裸鼠肺转移模型观察紫杉醇体内抗转移效果 ,原位杂交法检测转移灶肿瘤细胞凋亡。结果　对照组与紫杉醇治疗组相比 ,二者之间转移率 (90 %和 4 0 % )及瘤结节数均有显著性差异 (P <0 .0 5 ) ;对照组与治疗组凋亡指数分别为 6 .0 3± 3.36与 2 5 .4 7± 4 .78,二者对比有显著性差异 (P <0 .0 1)。结论　紫杉醇对涎腺腺样囊性癌肺转移有较好的抑制效果 ,诱导凋亡可能是其抗ACC -M裸鼠肺转移的作用机制之一。     

纤维粘连蛋白对人涎腺腺样囊性癌细胞株侵袭和转移的影响

为了研究纤维粘连蛋白（FN）与人涎腺腺样囊性癌（Acc）转移的关系，本研究应用免疫组织化学染色，Boyden小室体外移动试验和体外粘附试验，对人涎腺腺样囊性癌细胞系ACC—2和从其克隆出的高转移细胞株ACC—M细胞进行比较研究。结果发现FN在ACC—M表达明显高于ACC—2。在加入外源性FN后，ACC—2体外移动性、粘附率均明显提高，已接近ACC—M，而ACC—M无明显变化。结果表明FN在Acc侵袭和转移中起重要的调节作用。     

基质金属蛋白酶-1在人涎腺腺样囊性癌细胞中的表达

目的:测定基质金属蛋白酶-1(MMP-1)在人涎腺腺样囊性癌不同转移力细胞系中的表达。方法:以人涎腺腺样囊性癌ACC-2细胞系及其高转移株ACC-M作为研究肿瘤转移分子机制的模型,采用免疫组化法和蛋白印迹(Western blot)法检测MMP-1的蛋白表达水平。结果:MMP-1在ACC-M细胞中的表达水平高于ACC-2细胞。结论:MMP-1在人涎腺腺样囊性癌的侵袭转移过程中可能发挥作用。     

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目的观察Rho激酶抑制剂Y-27632对涎腺腺样囊性癌细胞肺高转移细胞株(ACC-M)生长增殖的影响,探讨Y-27632对涎腺腺样囊性癌可能疗效,以期为治疗涎腺腺样囊性癌提供新思路。方法 2007年10月至2008年2月在浙江大学医学实验室,形态学观察Rho激酶抑制剂Y-27632作用下ACC-M细胞的生长变化,并用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测不同药物浓度下ACC-M的增殖情况。结果抑制剂Y-27632作用下ACC-M细胞变成梭形,细胞长轴增加,细胞间连接消失,细胞膜不规则,皱缩不整齐,边界有丝状突起,有倾向凋亡的趋势;MTT比色法检测结果发现,不同浓度Y-27632作用下检测到的ACC-M细胞光密度值均比对照组小,且当药物浓度为10μmol/L时抑制作用有统计学意义(P<0.01)。结论 Rho激酶抑制剂Y-27632在体外实验中对涎腺腺样囊性癌细胞的生长增殖起一定的抑制作用。     

醋酸棉酚对人腺样囊性癌ACC-M细胞E-cadherin基因mRNA表达的影响及意义

目的 研究醋酸棉酚（gossypol acetic acid,GAA）对体外培养的人腺样囊性癌ACC-M细胞增殖及E-cadherin基因mRNA表达的影响,初步探讨GAA的抗肿瘤作用机制。方法 本研究于2013年4—7月在昆明医科大学附属口腔医院（云南省高校口腔医学重点实验室）完成。（1）应用四唑盐比色（MTT）法观察GAA对ACC-M细胞生长的作用。（2）应用实时荧光定量（RFQ-PCR）法检测ACC-M细胞在GAA作用48、72 h后E-cadherin 基因mRNA的表达变化。结果 （1）MTT法检测显示：GAA作用ACC-M细胞24、48和72 h后,细胞的生长受到抑制。（2）RFQ-PCR法检测显示：分别以19、10 μmol/L的GAA作用ACC-M细胞48 、72 h 后,细胞中E-cadherin mRNA的表达水平高于对照组（P＜0.05）。结论 GAA能抑制ACC-M细胞生长,增强E-cadherin基因mRNA表达。     

RNA干扰Survivin对腺样囊性癌细胞株ACC-M生长的抑制作用

目的:探讨RNA干扰Survivin基因对腺样囊性癌细胞生长的抑制效应.方法:设计、合成siRNA(small interfering RNA),构建真核表达载体pGenesil-shRNA-Survivin,将重组质粒导入人腺样囊性癌ACC-M细胞株.采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PcR)、Western-blot法分别检测转染后的ACC-M细胞中Survivin mRNA和蛋白表达的变化,用噻唑蓝(MTT)法检测细胞的增殖,结果:测序证实真核表达载体构建成功,在pGenesil-shRNA-Survivin的ACCM细胞株中,Survivin mRNA及蛋白表达明显降低,ACC-M细胞生长受到抑制.结论:pGenesil-shRNA-Survivin重组质粒能有效抑制腺样囊性癌细胞生长.     

生存素小干扰RNA对人腺样囊性癌ACC-2细胞移植瘤体生长的抑制作用

目的观察生存素（Survivin）小干扰RNA（siRNA）在体内是否能抑制腺样囊性癌移植瘤体的生长。方法裸鼠体内注射稳定转染靶向Survivin基因的shRNA真核表达载体pGenesil-shRNA-Survivin后的人腺样囊性癌细胞株ACC-2,观察移植肿瘤生长情况,以空白对照组及阴性质粒对照组作为对照。处死裸鼠后测量移植瘤体积;采用苏木精-伊红染色病理证实移植瘤后,免疫组织化学法检测移植瘤的Survivin蛋白表达情况,半定量RT-PCR检测Survivin mRNA表达情况。结果处死裸鼠后测量移植瘤体积表明,pGenesil-shRNA-Survivin组移植瘤体积明显减小;其Survivin mRNA及蛋白表达明显降低（P<0.05）。结论siRNA能在体内明显抑制腺样囊性癌Survivin的表达,Survivin siRNA能有效抑制腺样囊性癌裸鼠体内移植瘤的生长。     

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目的 研究醋酸棉酚（gossypol acetic acid,GAA）对体外培养的人腺样囊性癌ACC-M细胞增殖及E-cadherin基因mRNA表达的影响,初步探讨GAA的抗肿瘤作用机制。方法 本研究于2013年4—7月在昆明医科大学附属口腔医院（云南省高校口腔医学重点实验室）完成。（1）应用四唑盐比色（MTT）法观察GAA对ACC-M细胞生长的作用。（2）应用实时荧光定量（RFQ-PCR）法检测ACC-M细胞在GAA作用48、72 h后E-cadherin 基因mRNA的表达变化。结果 （1）MTT法检测显示：GAA作用ACC-M细胞24、48和72 h后,细胞的生长受到抑制。（2）RFQ-PCR法检测显示：分别以19、10 μmol/L的GAA作用ACC-M细胞48 、72 h 后,细胞中E-cadherin mRNA的表达水平高于对照组（P＜0.05）。结论 GAA能抑制ACC-M细胞生长,增强E-cadherin基因mRNA表达。