谷氨酸致人神经母细胞瘤细胞兴奋性毒损伤的机制(英文)

目的探讨谷氨酸导致人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y cells)兴奋性毒损伤的机制。方法MTT法检测SH-SY5Y细胞存活率;测定乳酸脱氢酶释放量观察细胞损伤程度;DAPI染色法观察细胞凋亡形态学特点;钙流法检测胞浆钙离子浓度变化 ;以胞内谷胱甘肽、超氧化物歧化酶活性和胞外丙二醛含量检测谷氨酸引发SH-SY5Y细胞的氧化应激状态。结果谷氨酸导致SH-SY5Y细胞受损,包括存活率下降、乳酸脱氢酶释放量增多及形态结构发生改变;谷氨酸处理 20 min 后,胞浆钙离子浓度无显著改变,而处理 24 h 后,胞浆钙离子大量增加,且 MK801 (NMDA受体拮抗剂)及LY341495 (代谢型谷氨酸受体拮抗剂)均不能抑制钙离子内流的增多;谷氨酸可导致SH-SY5Y氧化损伤,包括胞内谷胱甘肽含量减少、超氧化物歧化酶活性降低、胞外脂质过氧化产物丙二醛水平升高等,而丹参酮IIA (一种抗氧化剂)可减轻这些氧化损伤。结论谷氨酸导致SH-SY5Y细胞兴奋性毒损伤可能是通过氧化损伤产生的,而不依赖于 NMDA 受体介导的钙稳态的破坏。     

血小板活化因子通过N-甲基-D-天(门)冬氨酸/突触后密度蛋白93途径致神经元损伤

目的探讨血小板活化因子(PAF)所致的神经元损伤是否涉及N-甲基-D-天(门)冬氨酸／突触后密度蛋白93(NMDA／PSD93)信号通路。方法细胞培养系统培养原代野生型和PSD93基因敲除型小鼠皮质神经元;0．3umol／LPAF处理神经元24h或5umol／LPAF受体拮抗剂(BN52021),10umol／L非竞争性NMDA受体拈抗剂(MK-801)和60umol／L神经性一氧化氮合成酶(nNOS)抑制剂(L—NAMA)预处理,碘化物／钙黄绿素染色检测细胞凋亡;免疫印迹检测野生型和基因敲除型小鼠皮质神经元中的多种蛋白表达;细胞免疫组化和共聚焦显微镜观察在同一神经轴突上共同表达多种蛋白;放免法测定神经元细胞蛋白中环鸟苷磷酸(cGMP)活性。结果(1)PSD93基因敲除型神经元不表达PSD93外,与野生型一样表达PSD93N-甲基-D-天(门)冬氨酸受体(NR2A)和nNOS。(2)神经轴突共同表达PSD93、NR2A和nNOS。(3)PSD93基因敲除型小鼠皮质神经元减少PAF对神经的毒性作用,并降低其cGMP活性。结论PAF通过NMDA／PSD93途径致神经细胞损伤。     

立体定向脑室注射代谢性谷氨酸受体1拮抗剂对SAH损伤影响的实验

目的研究侧脑室注射代谢性谷氨酸受体1(mGluR1)拮抗剂LY367385是否能减轻小鼠蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)后脑组织损伤。方法采用非开颅血管内线栓法制备小鼠SAH模型,随机分为3组:对照组(control组)、模型组[(SAH+生理盐水(NS)组)]、mGluR1拮抗剂LY367385组(SAH+LY367385组),于SAH后10min侧脑室注射NS或LY367385(500nmol)5μl,术后行神经功能评分。分别在SAH后6、24、48h3个时相点取右侧脑组织标本,采用蛋白免疫印迹法(Western biotting)检测mGluR1、p-ERK1/2蛋白的表达;用原位末端标记法(TUNEL)检测神经细胞凋亡情况。结果与对照组比较,模型组小鼠神经功能评分显著降低,各组小鼠mGluR1和p-ERK1/2蛋白均有不同程度增强,凋亡细胞增多。与模型组比较,拮抗剂组小鼠神经功能评分增加,mGluR1、p-ERK1/2蛋白表达均有不同程度下调,神经细胞凋亡数目减少。结论 (1)SAH后mGluR1的表达增强可通过激活ERK信号途径诱导神经细胞凋亡;(2)mGluR1选择性拮抗剂LY367385对脑血管痉挛(cerebral vaso-spasm,CVS)损伤具有保护作用。     

谷氨酸促进大脑皮层神经元Munc18的释放和细胞表面的分布(英文)

目的Munc18被普遍认为存在于神经元细胞内,参与神经递质的释放。虽然已有研究表明在Rasmussen’s脑炎病人中有Munc18自身抗体的产生,但对于Munc18的自身免疫机制目前还不清楚。本研究旨在观察Munc18是否可由神经元释放及是否部分分布于神经元细胞表面,并对Munc18抗体是否能诱导神经元损伤进行研究。方法分离胎龄17天Sprague-Dawley胎鼠大脑皮层神经元,用Neurobasal培养基培养。培养液中的蛋白经三氯乙酸沉淀后进行免疫印迹检测,细胞表面蛋白则用EZ-Link-sulfo-NHS-LC-Biotin进行生物素标记,细胞裂解后用结合有亲和素的琼脂糖珠获取生物素标记的蛋白,随后进行免疫印迹检测。在4°C进行活细胞免疫荧光染色,观察神经元细胞表面Munc18的分布。用乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)释放指标检测神经元损伤。结果用免疫印迹法可在神经元培养的条件培养液中检测到Munc18蛋白。用谷氨酸(50μmol/L)处理神经元1 h后,培养液中Munc18含量显著增加,同时培养液中未检测到β-actin和syntaxin1,LDH释放也未明显增加。此外,谷氨酸处理能增强神经元表面的Munc18分布。活细胞免疫荧光染色检测到在谷氨酸处理后,神经元表面分布有Munc18,主要位于神经突起与另一神经元接触的部位以及不同神经元的神经末梢交汇部位。谷氨酸诱导的神经元表面Munc18分布增加可被NMDA受体拮抗剂MK801抑制,而AMPA受体拮抗剂未有明显的抑制作用。LDH检测显示,在培养液含有血清成份的情况下,与对照的c-Fos抗体相比,Munc18抗体可明显诱导神经元损伤。结论一部分Munc18可由神经元释出或在神经细胞表面分布。谷氨酸可通过兴奋NMDA受体促进Munc18的释放和在神经细胞表面的分布。并且,Munc18抗体诱导的神经元损伤依赖于血清中的因子。     

洛伐他汀减轻NMDA诱导的兴奋性毒性损害

目的 探讨洛伐他汀(Lovastatin,LOV)对NMDA诱导的大鼠皮质神经元兴奋性毒性损害的神经保护作用.方法 选用胚胎17d的SD大鼠,取皮质神经元接种培养.通过台盼蓝排除实验评估细胞活力、TUNEL染色检测凋亡细胞及免疫荧光细胞化学技术测定神经元形态.结果 台盼蓝排除实验显示500nmol/L洛伐他汀预处理3d显著减轻NMDA诱导的大鼠皮质神经元兴奋性毒性损害,而不能减少蛋白激酶C抑制剂星形孢菌素诱导的细胞凋亡.LOV和L-甲羟戊酸(MVA)共同预处理不能减轻NMDA诱导的兴奋性毒性损害,提示其保护作用依赖于降低胆固醇水平.洛伐他汀的神经保护作用呈剂量和时程依赖性.TUNEL染色显示洛伐他汀预处理能减少NMDA诱导的细胞凋亡.免疫荧光细胞化学结果显示洛伐他汀能改善NMDA诱导的MAP-2神经元形态损害.结论 洛伐他汀选择性地减轻NMDA诱导的大鼠皮质神经元兴奋性毒性损害及形态损害,提示洛伐他汀对兴奋性毒性损害相关神经病理有潜在的神经保护作用.     

MCPG在神经元氧糖剥夺模型中的抗凋亡作用

目的通过神经元氧糖剥夺模型研究Ⅰ组代谢型谷氨酸受体拮抗剂α-甲基-4-羧苯基甘氨酸（MCPG）对神经元损伤的保护作用,并初步探讨其机制。方法大鼠皮层神经元原代培养2w后,采用氧糖剥夺法建立损伤模型,通过乳酸脱氢酶（LDH）活性测定及碘化丙啶（PI）/Hoechst33342双染鉴定神经元损伤程度;加入Ⅰ组代谢型谷氨酸受体拮抗剂MCPG（1mmol/L）,通过脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）检测神经元凋亡情况,并采用蛋白印迹法研究凋亡相关因子caspase-3、细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）、磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）的表达变化,讨论MCPG抗凋亡作用与ERK1/2信号通路的关系。结果 MCPG能抑制ERK1/2信号通路的活化并降低凋亡相关因子caspase-3的表达,减轻氧糖剥夺造成的神经元凋亡。结论 MCPG能够通过ERK1/2信号通路减轻氧糖剥夺造成的神经元凋亡。     

神经干细胞分化的神经元离子型谷氨酸受体NMDA亚单位的mRNA和蛋白表达

目的在体外研究由大鼠神经干细胞(NSCs)分化而来神经元细胞中离子型谷氨酸NMDA受体表达。方法分离培养孕14～16d胎鼠皮质和海马神经干细胞，对NSCs进行nestin和分化鉴定。通过RT—PCR、Western blot免疫印迹和免疫组化检测NSCs分化的神经元细胞中离子型谷氨酸NMDA受体亚单位NR1、NR2A和NR2B的mRNA和蛋白表达。结果从孕14～16d胎鼠大脑中分离培养出NSCs，NSCs分化后的神经元可以表达离子型谷氨酸NMDA受体亚单位NR1、NR2A和NR2B。结论由NSCs分化而来的神经元能表达离子型谷氨酸NMDA受体。     

突触后密度蛋白93基因敲除抑制血小板活化因子性神经元损害

目的　探讨血小板活化因子 (PAF)所致的神经元毒性损伤是否受突触后密度蛋白 93(PSD93 )基因调控。方法　用PAF处理培养的野生型和PSD93 基因敲除型的小鼠皮质神经元 ;经碘化物 (PI) /钙黄绿素(Calcein)染色 ,荧光显微镜观察并计算细胞死亡率 (% ) ;细胞生存能力检测 (MTT)神经元生存能力 ;免疫印迹法测定PSD93 和PSD95蛋白的表达。结果　野生型神经元表达PSD93 和PSD95蛋白 ,PSD93 基因敲除型只表达PSD95,不表达PSD93 ;基因敲除型的小鼠皮质神经元凋亡明显低于野生型 (P <0 0 5 ) ,生存能力高于野生型(P <0 0 1)。结论　PSD93 基因敲除抑制PAF所致的神经元损害     

Preso在PC12细胞氧化应激损伤中的作用

目的通过建立大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤分化细胞株(PC12)氧化应激损伤模型,研究一类新型结构蛋白脊椎形态发生突触后致密物质95(PSD-95)相关调节因子(Preso)在氧化应激损伤中的作用以及有可能的作用方式。方法建立PC12细胞氧化应激损伤模型,通过Western blot法检测损伤后Preso蛋白表达变化;通过干涉Preso蛋白表达,四甲基啖唑蓝(MTT)检测细胞存活率及乳酸脱氢酶(LDH)检测细胞损伤程度评价Preso在氧化应激损伤中的作用;使用地佐环平(MK-801)阻断离子型谷氨酸受体(NMDAR)激活,然后通过MTT法检测细胞存活率及LDH法检测细胞损伤程度,分析Preso在氧化应激损伤中可能起作用的途径。结果氧化应激损伤能够使Preso蛋白表达增高,而干涉Preso蛋白表达能够有效提高氧化应激损伤后细胞存活率,而抑制NMDAR激活会削弱干涉Preso蛋白表达的细胞保护作用。结论 Preso对于氧化应激损伤起到了促进的作用,干涉Preso表达可减轻细胞氧化应激损伤;Preso蛋白很可能通过结合突触后致密物质95进而促进NMDA受体激活,起到加重细胞氧化应激损伤作用。     

利培酮对N-甲基-D-门冬氨酸诱导的大鼠皮层神经细胞损伤保护作用的研究

目的探讨利培酮对N-甲基-D-门冬氨酸(NMDA)诱导的大鼠皮层神经细胞损伤的作用。方法清洁级Sperague-Dawley妊娠大鼠3只,孕期17~19 d。用50 μmol／L NMDA处理原代培养的大鼠皮层神经元15 min,观察不同浓度(0.1 μmol／L,1 μmol／IL,10 μmol／L)的利培酮对这种损伤的作用。结果 NMDA(50 μmol／L)处理15 min能显著增加上清液中的乳酸脱氢酶(LDH)活性(P<0.01),明显降低皮层神经细胞甲基噻唑基四唑(MTT)比色后的吸光度(P<0.01)。1μmol／L浓度水平的利培酮能抑制NMDA诱导的大鼠皮层神经元LDH的释放,使MTT比色增强,明显改善损伤后的神经元形态。结论利培酮对NMDA诱导的大鼠皮层神经元的损伤有保护作用。     

缺血性脑卒中发病机制研究新进展

短暂或持久的局灶性脑缺血可引起一系列病理生理变化导致脑损害 ,且随时间和缺血程度增加而加重。本文就中枢神经系统中兴奋性氨基酸 (谷氨酸 )三种受体 :NMDA、AMPA、metabotropic (促代谢 )受体 ,神经元及神经胶质细胞的去极复极化 ,缺血后的炎症反应及细胞凋亡几方面在缺血性脑卒中中的作用机制作一综述。     

代谢型谷氨酸受体与癫痫

兴奋性神经递质谷氨酸与谷氨酸受体结合 ,在癫痫的发病中发挥重要作用。对谷氨酸受体的研究表明 ,谷氨酸受体存在两种类型 [1 ] :离子型谷氨酸受体(intropic glutamate receptors,i Glu Rs)和代谢型谷氨酸受体 (metabotropic glu-tam ate receptors,m Glu Rs )。前者包括NMDA、     

Preso调控nNOS在神经元机械性损伤中的作用

目的通过建立神经元机械性损伤模型,研究突触后致密物质(PSD)支架蛋白中的树突棘突触后致密物质-95(PSD-95)相互作用调节蛋白(Preso)在创伤性脑损伤中的作用及调控机制。方法建立神经元机械性损伤模型,通过细胞活力和乳酸脱氢酶(LDH)检测神经元损伤程度,并通过Western blot检测明确Preso在损伤后的表达变化;利用Preso慢病毒过表达载体上调Preso在神经元中的表达,通过细胞活力和LDH检测明确上调Preso在神经元损伤中的作用;利用神经元特异性一氧化氮合酶(nNOS)特异性抑制剂ARL 17477,通过细胞活力和LDH检测明确抑制nNOS对上调Preso调控神经元损伤的影响。结果神经元机械性损伤后,Preso表达无明显改变,而上调Preso表达可加重神经元损伤;利用nNOS特异性抑制剂ARL 17477可显著改善神经元损伤,并抑制上调Preso表达对神经元损伤的影响。结论神经元机械性损伤后,Preso可促进神经元损伤的形成,而nNOS是其重要的下游效应分子。     

刺五加皂甙对神经元谷氨酸毒性损伤的保护作用

目的:观察不同谷氨酸浓度和谷氨酸作用不同时间对神经元活性的影响,探讨细胞损伤后刺五加皂甙(ASS)的有效保护浓度。方法:取孕13～15dICR小鼠,无菌条件下对胎鼠大脑皮层神经元进行原代分离培养,建立谷氨酸诱导的皮层神经元损伤模型。用MTT、LDH测定神经元活性,用硝酸还原酶法测定细胞培养上清液中NO的含量,用流式细胞仪检测细胞凋亡率,并在电镜下观察细胞形态学变化。结果:①经谷氨酸处理的神经元,其细胞存活率呈剂量和时间依赖下降、ASS能不同程度提高细胞存活率。②谷氨酸处理组的神经元凋亡率、LDH释放量和NO含量均升高,与正常对照组及ASS组比较有明显差异(P<0.01)。结论:一定浓度的ASS对谷氨酸引起的神经元损伤有保护作用;ASS可能是通过抑制NO的释放和稳定细胞膜,拮抗细胞元损伤。     

新型促红细胞生成素衍生肽对毛果云香碱致急性癫小鼠的神经保护作用及机制探究

目的探究新型促红细胞生成素衍生肽(DEPO)对毛果云香碱致急性癫小鼠的保护作用,借助N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)损伤神经元模型初步探讨DEPO的作用机制。方法 (1)健康成年C57BL/6小鼠随机分为DEPO组(DEPO 500μg·kg~(-1))、EPO组(EPO 50μg·kg~(-1))、溶剂组(ACN+Milliq,0.2 mL/只)、生理盐水组(生理盐水,0.2 mL/只)。腹腔注射毛果云香碱建立急性癫小鼠模型,比较各组干预后癫发作潜伏期、发作严重程度、死亡率的差异。(2)采用NMDA兴奋性毒性损伤神经元模型,分为DEPO组(DEPO 100μg·mL~(-1)干预)、EPO组(EPO 5μg·mL~(-1)干预)、对照组和正常组,检测各组乳酸脱氢酶(LDH)释放率、细胞存活率(MTT法)。(3)拮抗EPOR实验,设置EPO+anti-EPOR组,DEPO+anti-EPOR组,提前4 h加入anti-EPOR(1∶100,biorbyt)中和EPOR,检测LDH释放率和细胞存活率。结果 DEPO组和EPO组癫发作潜伏期分别较溶剂组、生理盐水组显著延长(P0.05、P0.001)。各组间死亡率、癫发作严重程度比较,差异无统计学意义。DEPO组和EPO组LDH释放率较对照组显著降低(P0.01),细胞存活率较对照组显著增高(P0.001)。DEPO+anti-EPOR组、EPO+anti-EPOR组的LDH释放率分别较DEPO组和EPO组显著增高(P0.01),细胞存活率分别较DEPO组和EPO组显著降低(P0.001)。结论新型DEPO可以显著延长毛果云香碱致急性癫小鼠的癫发作潜伏期,并通过EPOR介导其减轻NMDA诱导的神经元兴奋性毒性损伤,发挥神经保护作用。DEPO在癫治疗中存在可能的应用前景。     

孤啡肽受体拮抗剂对机械性损伤神经元存活率的影响

目的既往研究表明,孤啡肽在脑损伤后的表达明显升高,本研究通过特异性阻断孤啡肽受体(opioid-receptor-like receptor,ORL-1),观察对受损神经元是否具有保护作用。方法建立神经元机械性损伤模型,用孤啡肽受体特异性阻断剂([Nphe1]-NC(1-13)-NH2,Nphe)阻断孤啡肽受体,通过四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性,钙离子水平测定,研究Nphe对机械性损伤神经元存活率的影响。结果 MTT法测定神经元机械性损伤后12 h细胞存活率显示:单纯损伤组细胞存活率为46%±4%,与对照组相比显著下降(P<0.05),不同剂量Nphe(30、300、1 200 nM)干预组的细胞存活率分别为56%±5%、67%±7%、72%±8%,与单纯损伤组存活率46%±4%相比差异显著(P<0.05)。LDH活性检测提示损伤后12 h和48 h,Nphe干预组LDH活性与损伤组相比有显著差异(P<0.05)。神经元机械性损伤后12 h,Nphe能够降低损伤后细胞内钙离子水平(P<0.05)。结论 ORL-1的特异性拮抗剂Nphe能够减少机械性损伤后继发性神经元损害,对神经元具有一定的保护作用。     

前庭神经核内谷氨酸受体在帕金森病的变化

目的 探讨前庭神经核内离子型谷氨酸受体在帕金森病时的变化。方法 采用免疫组织化学染色技术检测小鼠前庭神经核内谷氨酸受体的表达。结果 在帕金森病时,前庭神经核内N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体增加,非NMDA受体减少。结论 非NMDA受体在帕金森病中起神经毒性作用,引起相应病理改变,推测其变化与临床运动障碍、平衡失调有一定关系。     

酸敏感离子通道1α介导缺氧皮质神经元损伤及相关机制的探讨

目的探讨缺氧条件下阻断酸敏感离子通道1α(acid sensing ion channels 1α,ASIC1α)对大鼠皮质神经元存活及细胞内钙离子水平的影响,以及缺氧对皮质神经元ASIC1表达的影响。方法通过使用ASIC1α阻断剂、N甲基D门冬氨酸(NMDA)受体阻断剂、电压门控通道阻断剂,利用fura-3/AM荧光显像,乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)释放实验等技术,比较观察对缺氧皮质神经元存活以及钙离子水平的影响,进一步利用Western印迹法检测ASIC1的表达变化。结果酸性环境中,缺氧皮质神经元形态明显改变,细胞内钙离子浓度升高;与加入NMDA受体阻断剂、电压门控通道阻断剂相比较,加入ASIC1α阻断剂明显抑制细胞内钙离子水平升高(P<0.05),对神经元起到保护作用。随缺氧时间的延长,神经元ASIC1蛋白表达增加。结论酸性环境中,缺氧皮质神经元的损伤与ASIC1α开放以及表达增加有关;阻断ASIC1α具有神经保护作用。     

GRIN2D相关发育性癫痫脑病的临床表型及突变功能异质性

正背景N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-Daspartate,NMDA)受体是一类重要的离子型谷氨酸受体,主要表达于神经元的突触后膜,介导中枢神经系统兴奋性突触传递中的慢钙电流成分,与学习记忆、突触可塑性等生理功能及癫痫、发育迟缓、精神分裂症等多种神经系统发育性疾病有关。GRIN2D主要表达于胎儿时期及生后早期,其编码     

洛伐他汀通过抑制Calpain和CDK5的过度激活减轻NMDA的毒性损害

目的 探讨洛伐他汀(LOV)对N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)诱导的大鼠皮质神经元兴奋性毒性损害的神经保护作用及可能机制. 方法 原代培养的大鼠皮质神经元分未处理组、NMDA组、LOV组及LOV+NMDA组(500 nmol/L LOV预处理神经元3d,100 μmol/L NMDA作用15 min),未处理组加入等剂量溶剂.台盼蓝排除实验评估细胞活力,免疫荧光染色检测微管相关蛋白-2(MAP-2)的表达;Westerning blotting检测NMDA作用时间为30 min时4组神经元兴奋性毒性相关蛋白的表达. 结果 与未处理组和LOV组比较,NMDA组、LOV+NMDA组台盼蓝阳性细胞数增多,MAP-2阳性细胞、神经元突起的数目和长度均减少,差异有统计学意义(P＜0.05);与NMDA组比较,LOV+NMDA组台盼蓝阳性细胞数减少,MAP-2阳性细胞、神经元突起的数目和长度均增加,差异有统计学意义(P＜0.05).与未处理组和LOV组比较,NMDA组SBDP/spectrin α、P25/P35灰度比明显增加,但是LOV+NMDA组SBDP/spectrin α、P25/P35灰度比低于NMDA组,差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 LOV可减轻NMDA诱导的大鼠皮质神经元兴奋性毒性损害,其神经保护作用与LOV抑制Calpain和细胞周期素依赖性激酶5(CDK5)的激活有关.