氯喹通过抑制自噬促进TRAIL诱导的胶质瘤细胞凋亡

目的探讨氯喹对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)诱导的胶质瘤细胞凋亡的影响。方法体外培养人脑胶质瘤细胞U251和Hela细胞,分为对照组、氯喹组、重组人TRAIL蛋白(rhTRAIL)组和联用组(氯喹与rhTRAIL联合应用);MTT法检测细胞活力,Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡,共聚焦显微镜检测GFP-LC3的分布判断细胞自噬水平,Western Blot检测cleaved caspase-8的表达水平。结果氯喹和rhTRAIL均显著增加U251细胞和Hela细胞自噬水平,而且联用较单独应用自噬水平更高,Hela细胞自噬水平明显高于U251细胞。U251细胞和Hela细胞增殖抑制率和细胞凋亡率:氯喹组与对照组均无统计学差异(P0.05),rhTRAIL和联用组均明显高于氯喹组(P0.05),联用组明显高于rhTRAIL组(P0.05)。氯喹组和对照组Cleaved caspases-8水平无统计学差异(P0.05),rhTRAIL和联用组均明显增高(P0.05),联用组明显高于rhTRAIL组(P0.05)。结论氯喹能通过抑制细胞自噬,增强TRAIL诱导的U251细胞凋亡。     

抑制HSF-1增强PS-341诱导胶质瘤细胞凋亡

目的探索HSF1是否能诱导HSPs的高表达,以及抑制HSF1是否能够增强PS-341诱导胶质瘤细胞凋亡。方法 Western检测HSP70、HSF1的表达,以及JNK的磷酸化。转染siRNA敲除HSF1,胎盘蓝染色及sub-G1检测细胞凋亡。结果胶质瘤细胞中HSP70及HSF1的表达明显高于正常脑组织。敲除HSF1能通过抑制HSP70明显增强PS-341诱导的胶质瘤细凋亡,并能增强及延长JNK通路的活化。在HSF1+/+细胞中,PS-341能够强烈诱导HSP70的表达;而在HSF1–/–细胞中,PS-341诱导并延长了JNK通路的激活。热休克预处理对两种细胞活性都没明显影响,但能明显增强HSF1+/+细胞对抗PS-341诱导凋亡的能力。结论胶质瘤细胞中,HSF1的激活能促进HSPs的表达,进而对抗PS-341诱导的细胞凋亡。抑制HSF-1能增强PS-341诱导胶质瘤细胞凋亡,这有望成为一种新的胶质瘤治疗途径。     

KU-55933抑制替莫唑胺诱导的U87胶质瘤细胞自噬

目的研究KU-55933对替莫唑胺(TMZ)诱导的U87细胞自噬及TMZ毒性的影响及机制。方法 U87细胞分别给予5、10、15、20μmol/L KU-55933作用72 h,或10μmol/L KU-55933作用24、48、72、96 h,MTT法检测细胞增殖。U87细胞分别给予DMSO、100μmol/L TMZ、10μmol/L KU-55933、100μmol/L TMZ+10μmol/L KU-55933作用72 h,流式细胞术检测自噬小体,Western blot检测相关蛋白的表达。结果 KU-55933抑制U87细胞的增殖,并呈剂量及时间依赖性;KU-55933抑制TMZ诱导的共济失调突变蛋白(ataxia-telangiectasia mutated,ATM)、自噬激活激酶(unc-51 like autophagy activating kinase1,ULK1)、P53蛋白磷酸化,降低微管相关蛋白(microtubule-associated protein 1 light chain 3 beta,LC3B)裂解,减少自噬小体的生成,增加TMZ敏感细胞组蛋白亚型γH2AX的形成,但对细胞周期检测点激酶1(checkpoint kinase 1,Chk1)、细胞周期检测点激酶2(checkpoint kinase 2,Chk2)蛋白磷酸化无影响。结论 KU-55933可抑制TMZ诱导的胶质瘤细胞自噬,并且增强TMZ对敏感胶质瘤的细胞毒性。     

双氢青蒿素诱导胶质瘤细胞自噬作用的研究

目的 研究双氢青蒿素(DHA)抑制胶质瘤生长作用、机制及联合替莫唑胺(TMZ)的协同抗肿瘤作用.方法 选用胶质瘤细胞株10个,MTT法检测DHA持续作用72 h后细胞株半数抑制浓度(IC50);0.5 μg/ml浓度DHA联合梯度浓度TMZ作用于SKMG-4细胞株,MTT法检测IC50;MDC法荧光分析DHA作用后自噬泡形成;梯度浓度DHA作用SKMG-4,Western Blot法检测caspase-3、Beclin -1、LC3-B蛋白表达.结果 DHA抑制胶质瘤细胞生长IC50为(1.17±0.078)μg/ml-(23.568±0.796)μg/ml;在SKMG-4细胞株中,DHA实验组与空白对照相比,可见明显的自噬泡染色;Beclin-1及LC3-B表达随DHA浓度增加而增加,而cagpase-3表达无明显变化;DHA联合TMZ抑制SKMG-4生长,IC50值明显下降(P＜0.01).结论 DHA具有抗胶质瘤活性,诱导胶质瘤细胞自噬;DHA联合作用可提高TMZ的抗胶质瘤SKMG-4活性,机制可能为增强了TMZ自噬效能.

Abstract：

Objective To investigate the anti - glioma efficacy of dihydroartemisinin ( DHA) and combined with temozolomide (TMZ) on human glioma cell line in vitro. Methods The growth inhibition of DHA on 10 glioma cell lines induced by DHA treatment for 72 h was analyzed by MTT method. TMZ combined with 0. 5 μg/ml DHA, and the IC50 value was measured in SKMG - 4 cells. The autofluorescent drug monodansylcadaverine (MDC) was used to mark autophagicvacuoles. The autophagy related protein LC3 - B and Beclin - 1, and the apoptosis protein caspase - 3 were analyzed by western blot ( WB). Results The IC50 of DHA was different in ten glioma cell lines [from (1. 17 ±0. 078) μg/ml to (23. 568 ±0. 796) μg/ml]. In SKMG -4 cells, the autophagicvacuoles were detected in the DHA group, the IC50 of TMZ had significant difference with 0. 5 μg/ml DHA contrast to the control group ( P ＜ 0. 01), and the levels of LC3 - B and Beclin -1 protein were increased gradually with the increase of DHA concentration, and caspase - 3 protein has no difference. Conclusion DHA can inhibit proliferation of glioma cell lines and increase the efficacy of TMZ, and the autophagy may be the mechanism.     

丙戊酸诱导胶质瘤细胞自噬及其机制研究

目的对丙戊酸诱导胶质瘤细胞发生自噬性死亡的过程进行观察,并初步探讨其可能的机制。方法丙戊酸处理人脑胶质瘤细胞系U87、T98G和SF295,台盼蓝染色检测细胞活性并计算细胞存活率;流式细胞仪测定细胞周期,透射电子显微镜和荧光测定仪观察细胞超微结构及自噬水平,West-ern blotting检测经丙戊酸处理后细胞内LC3-Ⅱ、Beclin-1、p-Akt和p-p70S6K等蛋白质的表达水平。结果经不同浓度丙戊酸处理后,人脑胶质瘤细胞系U87、T98G和SF295细胞活性明显受到抑制,其胶质瘤细胞半数抑制浓度分别为(2.45±0.32)、(4.78±0.62)和(6.62±0.95)mmol/L,其中丙戊酸对人脑胶质瘤细胞系U87具有较明显的杀伤作用(P<0.05)。透射电子显微镜观察可见人脑胶质瘤细胞系U87细胞胞质内有大量自噬体和自噬溶酶体,其自噬水平随丙戊酸浓度的升高而逐渐增强。经丙戊酸处理后,人脑胶质瘤细胞系U87细胞自噬相关蛋白LC3-Ⅱ和Beclin-1表达水平明显升高,而p-Akt和p-p70S6K表达水平明显降低。结论丙戊酸可诱导胶质瘤细胞发生自噬,其诱导胶质瘤细胞发生自噬的机制可能与阻断Akt信号转导通路有关。     

白藜芦醇抑制胶质瘤细胞生长与诱导细胞凋亡实验研究

目的探讨白藜芦醇(Res)对脑胶质瘤细胞(C6细胞株)和正常成纤维细胞(3T3细胞株)体外增殖的影响,进而观察Res诱导C6和3T3细胞系的凋亡作用.方法用不同浓度的Res处理C6和3T3细胞,以四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测Res对C6和3T3细胞的增殖作用,通过HE染色、扫描电子显微镜(SEM)、原位末端标记法(TUNEL)和流式细胞仪Annexin Ⅴ荧光染色,观察细胞的形态学结构改变,并定量检测细胞凋亡.结果 Res抑制了C6细胞的生长与增殖( P < 0.01 ),呈浓度依赖性反应;Res能明显诱导C6细胞凋亡,经210 μmol/L、120 μmol/L Res处理24 h后及对照组的C6细胞,其凋亡率分别为29.7%、14.6%及2.1%;相应的3T3细胞凋亡率分别为4.3%、3.5%、2.6%. 结论 Res能通过诱导C6细胞凋亡而抑制其生长与增殖,但对3T3细胞无此作用.本研究为临床应用Res治疗脑胶质细胞瘤提供了实验依据.     

姜黄素诱导自噬抑制脑胶质瘤U87细胞增殖的研究

目的研究姜黄素对脑胶质瘤U87细胞增殖的抑制作用及机制。方法采用10、20、40、60、80μmol/L姜黄素分别处理U87细胞72h后,MTT法检测姜黄素对U87细胞增殖的影响。流式细胞术检测40μmol/L姜黄素处理前后U87细胞周期和凋亡变化。提取40μmol/L姜黄素处理前后不同时间点U87细胞总蛋白,Westernblot检测自噬相关蛋白LC3的表达。结果姜黄素呈剂量依赖性抑制U87细胞增殖(P0.05),半数抑制浓度(IC50)为42.44μmol/L。姜黄素诱导G2-M期细胞周期阻滞,实验组G2-M期细胞比例为(47.71±2.67)%,对照组为(17.96±0.88)%(P0.01);实验组细胞凋亡率为(3.93±0.82)%,对照组为(1.80±0.65)%,两组差异无统计学意义(P0.05)。姜黄素给药12、24、48h,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值分别为(0.89±0.004)、(0.93±0.01)、(1.09±0.02),高于对照组(0.76±0.04)(P0.05);3-MA能减弱姜黄素对U87细胞增殖的抑制作用。结论姜黄素通过诱导自噬抑制脑胶质瘤U87细胞的增殖。     

p16基因抑制脑胶质瘤细胞恶性增殖并诱导细胞凋亡

目的：探索p16基因在脑胶质瘤发生过程中的作用及其与脑胶质瘤细胞凋亡的关系。方法：采用脂质体,磷酸钙＋DMSO休克转染的方法,分别将外源野生型p16基因导入胶质瘤细胞株U251,SWO,观察p16基因短暂转染与长期稳定转染对胶质瘤细胞的作用,并筛选阳性克隆。同时以空载体质粒pCDNA3为对照,免疫组化,Northern杂交检测p16基因表达,对转染后细胞生长的抑制,细胞周期,凋亡及裸鼠致瘤能力的变化进行分析,结果：外源p16基因的高水平表达显著抑制了胶质瘤U251,SWO细胞的生长,克隆形成率减少,肿瘤细胞发生了G1期阻滞,p16基因短暂转染可诱导胶质瘤细胞凋亡,而长期稳定转染无明显的凋亡诱导作用。结论：外源野生型p16基因可抑制胶质瘤细胞恶性增殖并诱导细胞凋亡,肿瘤细胞的异质性特点与p16基因转染后的“自然选择”作用可能是p16基因长期稳定转染无明显凋亡诱导作用的主要机制。     

FasL基因诱导胶质瘤细胞凋亡和抑制增殖作用的研究

目的 :探讨FasL基因诱导胶质瘤细胞凋亡和抑制增殖的作用。方法 :脂质体介导FasL基因转染TJ90 5胶质瘤细胞系 ,原位杂交 ,FasL免疫组化鉴定转染成功 ,应用MTT法、Ki 67免疫组化检测TJ90 5细胞的增殖变化 ,TUNEL法检测细胞凋亡。结果 :FasL基因转染成功后 ,肿瘤细胞内FasL表达增加 ,细胞增殖率降低 ,而凋亡细胞数增多。结论 :FasL基因诱导的细胞凋亡可能成为胶质瘤治疗的新途径之一     

FLIP蛋白抑制顺铂诱导大鼠C6胶质瘤细胞凋亡

目的探讨自杀相关因子（Fas）相关死亡结构域样白介素1（IL-1）β转化酶抑制蛋白（FLIP）对于顺铂（CDDP）诱导大鼠脑胶质瘤细胞（C6细胞株）凋亡的抑制作用,为进一步研究胶质瘤的耐药性奠定分子生物学基础。方法利用由Ad—Max腺病毒包装系统成功构建的携载大鼠FLIP基因的腺病毒表达载体Ad—FLIP感染大鼠C6胶质瘤细胞,24h后经逆转录酶一多聚酶链反应（RT—PCR）及Westernblot检测感染组及对照组细胞中FLIP基因的mRNA及蛋白表达水平;分别给予Ad—FLIP感染组及对照组细胞不同浓度的CDDP（0,1,2,4,8mg／ml）,药物处理48h后,经流式细胞仪（FCM）分析细胞凋亡状况;四唑蓝显色法（MTF）测定并比较两组细胞活力。结果Ad—FLIP感染组细胞与对照组细胞相比,FLIPmRNA和蛋白表达水平明显增高;流式细胞仪检测结果显示Ad—FLIP感染组细胞凋亡率明显低于对照组。MTT法结果提示经CDDP处理后,Ad—FLIP感染组与对照组细胞活力均有下降,但FLIP蛋白具有明显的抑制作用。结论FLIP蛋白在大鼠c6胶质瘤细胞中具有抵抗化疗药物的作用。     

bFGF反义寡核苷酸诱导胶质瘤细胞的凋亡

目的:探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)反义寡核苷酸对胶质瘤细胞凋亡的诱导作用。方法:将硫代磷酸修饰的bFGF反义寡核苷酸转染人脑胶质瘤细胞系TJ905,采用原位细胞死亡检测方法和电子显微镜,观察胶质瘤细胞凋亡的形态学变化,并用免疫组化法检测了增殖细胞核抗原(PCNA)的变化。结果:胶质瘤细胞呈现凋亡的形态改变,PCNA的表达明显降低。结论:bFGF反义寡核苷酸可诱导胶质瘤细胞的凋亡,抑制胶质瘤细胞的增殖。bFGF基因可作为反义治疗的目的基因。     

miR-106a抑制胶质瘤细胞增殖并诱导凋亡

目的胶质瘤是最常见的原发性中枢神经系统肿瘤,具有较高的病死率。现有的研究表明miR-106a在多种肿瘤中表达上调,并发挥着致癌性作用,但miR-106a在胶质瘤中的表达和作用却并不清楚。方法不同级别胶质瘤组织和胶质瘤细胞系(T98G,SHG44,U87,U251,U373)内的miR-106a水平通过实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)测定。转染miRNA寡聚核苷酸后的U87和U251细胞的增殖能力和细胞周期分别采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法和流式细胞仪测定,并且通过膜联蛋白/碘化丙啶(annexin V/PI)双染法测定了miR-106a对胶质瘤细胞的凋亡影响。结果miR-106a在胶质瘤组织和胶质瘤细胞系内表达水平相对正常脑组织显著下降,并且miR-106a表达水平与胶质瘤病理级别负相关。胶质瘤细胞转染miR-106a后,可检测到过表达的miR-106a可显著抑制胶质瘤细胞的增殖能力,阻滞细胞周期于G0/G1期,同时诱导胶质瘤细胞凋亡增加。结论 miR-106a可阻滞胶质瘤细胞细胞周期、抑制增殖和诱导凋亡。     

高浓度谷氨酸诱导胶质瘤细胞凋亡及其机制

目的：研究高浓度谷氨酸对原代培养人脑胶质瘤细胞的凋亡诱导作用,进一步探讨其凋亡的可能机制。方法：对新鲜的人脑胶质瘤进行体外原代培养,不同浓度的谷氨酸作用不同时间,形态学观察;四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测肿瘤细胞生长抑制率;流式细胞术检测肿瘤细胞凋亡率;激光共聚焦显微镜检测细胞膜内游离钙离子的浓度变化。结果：原代培养胶质瘤细胞的生长抑制率随谷氨酸浓度的增加呈递增趋势。25、50和100mmol/L谷氨酸作用胶质瘤细胞48h的凋亡率分别为9.65%、31.13%和20.35%。脑胶质瘤原代培养细胞内钙离子浓度在谷氨酸作用后明显升高,与对照组相比有显著性差异（P〈0.01）;但不同浓度组、24h和48h组之间钙离子的浓度无显著性差异（P〉0.05）。结论：高浓度的谷氨酸可诱导原代培养人脑胶质瘤细胞凋亡,凋亡率在一定范围内呈明显的剂量依赖性。钙离子在谷氨酸诱导的细胞凋亡中起重要作用。     

自噬对TRAIL诱导的肿瘤细胞凋亡的影响

正肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumornecrosis factor related apoptosis-induced ligand,TRAIL)是肿瘤坏死因子家族中的一员,能够诱导大多数人类肿瘤细胞凋亡,而对正常细胞没有明显的细胞毒性。因此,TRAIL被认为是一种很有希望有效的抗肿瘤药物~([1])。在临床前期试验中,TRAIL表现     

白藜芦醇对C6鼠胶质瘤细胞抑制生长和诱导凋亡的作用

白藜芦醇（resveratrol，Res）是一种广泛存在于植物中的植物补体，Res不但可以作为一种抗氧化剂，有防治心血管疾病的功效。而且具有抗炎和抗癌的作用，它可以在肿瘤的起始、发生、进展等各个阶段通过多种途径起到抑制肿瘤的作用。近年来有关胶质瘤的大量研究证实，表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）的基因扩增和过表达是恶性胶质瘤发生、发展的重要始动事件之一，其介导的信号转导通路发挥着关键的作用旧J。本实验进一步就Res对C6鼠脑胶质瘤细胞生长增殖的抑制、诱导细胞凋亡及其与胶质瘤增殖、凋亡相关的EGFR等重要基因变化进行了探讨。     

肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体诱导人胶质瘤细胞U87的凋亡

目的 探讨肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体(Tumor Necrosis Factor-related Apoptosis-inducing Ligand,TRAIL)诱导胶质瘤细胞凋亡的机制。方法 以人重组可溶性TRAIL蛋白(human recombinant soluble TRAIL,rsTRAIL)处理人胶质瘤细胞U87;用AnnexinV-FITC-PI双染色流式细胞术检测细胞凋亡;用DiOC6荧光染色流式细胞术检测细胞线粒体跨膜电位(ΔΨm);比色法测定细胞Caspase-3、8、9活性的变化;ELISA法检测胞浆cyt C浓度;观察Caspase-8阻断剂(Z-IETD-fmk)对U87细胞凋亡、ΔΨm和Caspase-3、8、9活性变化的影响。结果 rsTRAIL以时间依赖方式诱导U87细胞凋亡,同时导致U87细胞ΔΨm进行性下降、Caspase-3、8、9活性及胞浆内cyt C浓度的升高;Caspase-8阻断可明显减弱rsTRAIL对U87细胞的上述生物学效应。结论 TRAIL通过激活caspase-8间接启动线粒体凋亡途径诱导恶性胶质瘤细胞U87凋亡。     

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体诱导胶质瘤细胞凋亡机制研究

目的 探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)诱导胶质瘤细胞凋亡的机制.方法 以人重组可溶性TRAIL蛋白(rsTRAIL)处理人胶质瘤细胞U87;AnnexinV-FITC/PI双染色流式细胞术检测细胞凋亡;DiOC6荧光染色流式细胞术检测细胞线粒体跨膜电位(△ψm);比色法测定细胞caspase-3、8、9活性的变化;ELISA法检测胞浆cytC浓度;观察caspase-8阻断剂(Z-IETD-fmk)对U87细胞凋亡、△ψm和caspase-3、8、9活性变化的影响. 结果 rsTRAIL以时间依赖方式诱导U87细胞凋亡.同时导致U87细胞△ψm进行性下降,caspase-3、8、9活性及胞浆内cyt C浓度升高:caspase-8阻断剂可明显减弱rsTRAIL对U87细胞的上述生物学效应. 结论 TRAU通过激活caspase-8间接启动线粒体凋亡途径诱导恶性胶质瘤细胞U87凋亡.     

Celecoxib诱导C6胶质瘤细胞凋亡的研究

目的探讨Celecoxib(塞来昔布)诱导C6胶质瘤细胞凋亡的作用。方法应用吖啶橙、透射电镜和流式细胞仪(FCM)检测方法。结果通过吖啶橙及电镜检查发现Celecoxib 50μmol／L组细胞凋亡明显多于12．5μmol／L组，FCM检测Celecoxib 50μmol／L组细胞凋亡为15．32％，12．5μmol／L组凋亡为5．83％，不同浓度的Celecoxib对C6胶质瘤细胞有增殖抑制及诱导凋亡的作用，凋亡随药物浓度增加而升高。结论Celecoxib对C6胶质瘤细胞呈剂量依赖性抑制及诱导凋亡的作用．对胶质瘤治疗有重要意义。     

西罗莫司对C6鼠胶质瘤细胞抑制生长和诱导凋亡的作用

西罗莫司(sirolimus,SRL)是从吸水性链霉菌发酵液中提取出来的一种大环内酯类抗生素,目前作为免疫抑制剂已在临床开始使用.最近研究发现,SRL不仅是一种新型的抗移植排斥反应药物,还具有广泛的抗肿瘤的作用[1-1].我们以鼠胶质瘤细胞C6为对象,探讨SRL对胶质瘤细胞生长抑制及诱导细胞凋亡的作用.     

三氧化二砷诱导C6胶质瘤细胞凋亡实验研究

目的：研究三氧化二砷（As2O3）在体外是否具有抗鼠胶质瘤作用,并对其作用机制进行初步探讨。方法：应用不同浓度As2O3,且在不同时间点分别处理C6胶质瘤细胞株及原代培养的正常鼠神经胶质细胞,采用甲基噻唑基四唑（MTT）法,观察As2O3对C6胶质瘤细胞株及正常鼠神经胶质细胞生长的影响,以透射电镜、Hoechst33342和碘化丙啶（PI）双重荧光染色检测两种细胞凋亡的形态变化,并用异硫氰酸荧光素（FITC）标记的Annexin-V和PI双标记法通过流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果：MTT法发现,As2O30.5～8.0μmol/L的浓度均可显著抑制C6胶质瘤细胞株的生长,而对正常原代神经胶质细胞株的抑制作用较弱。经As2O3作用后,透射电镜、Hoechst33342/PI双染荧光均观察到C6胶质瘤细胞发生了显著的凋亡形态改变;运用Annexin-V-FITC/PI双标记法在流式细胞仪检测显示,随As2O3浓度的增大和时间的延长,C6胶质瘤细胞株的凋亡率明显上升,而正常神经胶质细胞的凋亡率要明显小于C6胶质瘤细胞株。结论：As2O3在体外可显著抑制C6胶质瘤细胞株生长,其机制与诱导肿瘤细胞凋亡有关,且凋亡率随As2O3作用的时间和剂量的增加而增加。但As2O3对正常神经胶质细胞生长的抑制作用较弱,提示As2O3抑制细胞生长的作用具有一定的选择性。