小鼠未定带至PAG腹外侧区特异性神经元通路的形态学研究

目的:利用囊泡膜谷氨酸转运体2(VGluT2)-ires-cre、谷氨酸脱羧酶2(GAD2)-ires-cre和羟色胺转运体(Sert)-ires-cre小鼠结合重组狂犬病毒介导的逆行跨单级突触追踪技术,研究未定带(ZI)和中脑导水管周围灰质腹外侧区(vlPAG)内特异性神经元之间的纤维联系。方法:首先将辅助病毒注入转基因小鼠右侧vlPAG内,两周过后将重组狂犬病毒(RV)注入相同区域。一周后,在激光共聚焦显微镜下观察RV标记的突触前神经元在ZI内的分布。结果:将RV注入vlPAG后,在VGluT2-ires-cre小鼠ZI的吻尾方向上均可观察到逆标的突触前神经元分布;GAD2-ires-cre小鼠逆标神经元只见于ZI吻侧部,但Sert-ires-cre小鼠ZI内少见RV逆行标记的突触前神经元。结论:ZI神经元发出投射至vlPAG,作用于其中的谷氨酸能神经元或GABA能神经元,该通路可能参与了疼痛或恐惧样行为的调控。     

小鼠盆神经初级传入在脊髓的局部调控及与上级神经元的纤维联系

目的:利用重组伪狂犬病毒介导的逆行跨多突触追踪技术,观察小鼠盆神经初级传入在脊髓突触前神经元的形态特征及其与上级神经元的纤维联系。方法:在成年雄性C57小鼠一侧盆神经注射伪狂犬病毒,动物存活一周后灌注取材,在激光共聚焦显微镜下观察全脑的突触前神经元的分布;利用免疫荧光组织化学技术特异性标记脊髓神经元,观察盆神经初级传入的突触前神经元与痛相关神经元的共存情况。结果:将伪狂犬病毒介导的逆行跨多突触病毒注入盆神经后,脊髓和脑内大量核团,如下丘脑、运动皮质、中脑导水管周围灰质、臂旁核和腰骶髓后连合核(DCN)都可观察到密集分布的突触前神经元。利用免疫荧光组织化学染色技术,观察到DCN内存在大量SP受体(SPR)阳性神经元,且SPR阳性神经元与盆神经跨突触标记的突触前神经元不共存,这些突触前神经元主要呈GABA阳性。结论:DCN是盆神经初级传入在脊髓的关键中继部位,内脏伤害性信息可能在DCN处进行初级调控后向上逐级传导。     

延髓内脏带儿茶酚胺能神经元对LPS免疫刺激的Fos表达

目的　探讨“延髓内脏带 (MVZ)至下丘脑室旁核 (PVN)”的儿茶酚胺能通路在“免疫 脑通讯”中的作用。　方法　应用WGA HRP逆行追踪与抗Fos和抗酪氨酸羟化酶 (TH)抗体双重免疫组织化学相结合的三重标记方法 ,即先将WGA HRP注入大鼠一侧PVN内 ,存活 4 8h后经腹腔注射免疫刺激剂脂多糖 (LPS)诱发免疫反应后 ,观察MVZ中WGA HRP逆标细胞、Fos蛋白和儿茶酚胺能神经元 (以TH为标记物 )的分布及表达状况。　结果　在MVZ内发现 7种阳性神经元 ,即HRP、Fos、TH单标细胞、Fos HRP、Fos TH、HRP TH双标细胞和Fos HRP TH三标细胞。Fos HRP双标记和Fos HRP TH三标记细胞分别占总HRP逆行标记细胞的 12 5 %和 39 6 %。　结论　MVZ对LPS免疫刺激起反应 ,并可能将免疫信息经儿茶酚胺能神经元上传至PVN ;MVZ可能作为“免疫 脑通讯”的一个中继站 ,通过“MVZ→PVN”通路起免疫调节作用。     

大鼠中脑导水管周围灰质向下丘脑orexin神经元的纤维投射

目的:明确中脑导水管周围灰质(PAG)神经元调节下丘脑orexin神经元的解剖学基础。方法:首先采用逆行示踪技术,将霍乱毒素B亚单位(CTb)作为逆行示踪剂注射到下丘脑orexin神经元胞体分布的区域,免疫组织化学方法染色观察PAG内CTb逆行标记细胞的分布特点;接着采用顺行示踪技术和免疫组化相结合的方法,将生物素化葡聚糖胺(BDA)作为顺行示踪剂注射到PAG,观察下丘脑内BDA标记的神经纤维与orexin神经元的重叠分布特点;最后运用免疫电镜技术观察BDA标记轴突终末与orexin神经元之间的突触联系。结果:CTb注射到单侧下丘脑orexin神经元区域后,在PAG观察到大量CTb标记神经元,注射点同侧标记细胞数明显占优,其中PAG外侧区(lPAG)和腹外侧区(vlPAG)可见大量CTb逆标神经元,背外侧区(dlPAG)和背内侧区(dm PAG)可见少量标记神经元;注射点对侧lPAG及vlPAG区域也观察到少量CTb标记神经元。BDA注射到单侧lPAG后,下丘脑内双侧均可观察到BDA标记的神经纤维,但注射点同侧标记神经纤维数量明显占优。BDA标记纤维与orexin神经元胞体在穹窿背侧接近不定带(ZI)的区域(本文中将此区域称作"穹窿上区")形成显著的重叠分布。透射电镜下观察到BDA标记的轴突终末与orexin神经元之间形成突触联系,且多为非对称性类型。结论:lPAG投射到下丘脑的神经纤维在穹窿上区与orexin神经元形成优势重叠分布、并与orexin神经元的胞体或树突形成以非对称性为主的突触联系,提示orexin神经元可能在lPAG的直接支配下发挥其调节觉醒状态、摄食行为等功能。     

大鼠脊髓背角向丘脑和外侧臂旁核的神经降压素能投射

本研究应用荧光金(FG)逆行追踪结合神经降压素(NT)免疫荧光组织化学染色的双标记技术,观察了大鼠脊髓背角向丘脑(TH)和外侧臂旁核(LPb)的NT能投射。将FG注入一侧TH或LPb后,FG逆标神经元主要见于脊髓背角的I层;NT阳性神经元主要分布于脊髓背角的I层、II层外侧部及II层内侧部与III层交界处;脊髓背角I层内可观察到FG逆标记并呈NT阳性的双标记神经元。上述结果表明脊髓背角I层的NT阳性神经元向TH和LPb投射,提示脊髓背角I层内的NT阳性神经元可能向TH和LPb传递伤害性信息。     

大鼠延髓和脊髓背角的PKCγ阳性神经元向中脑导水管周围灰质的投射

目的　观察延髓和脊髓背角内蛋白激酶Cγ亚单位 (PKCγ)样阳性神经元向中脑导水管周围灰质(PAG)的投射。　方法　荧光金 (FG)逆行追踪与PKCγ的免疫荧光组织化学染色相结合的双标记技术。　结果　PKCγ样阳性神经元主要分布于延髓和脊髓背角的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ层及脊髓的外侧脊核 ;将FG注入PAG后 ,在延髓和脊髓背角的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ层及脊髓的外侧脊核内可见FG标记神经元 ;部分FG标记神经元呈PKCγ样阳性 ,FG PKCγ双标神经元也主要见于延髓和脊髓背角的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ层及脊髓的外侧脊核。　结论　延髓和脊髓背角的PKCγ阳性神经元可能参与将伤害性刺激信息向PAG的传递。     

病毒示踪法研究小鼠丘脑中央内侧核内谷氨酸能神经元的传出和传入纤维联系

目的:明确丘脑中央内侧核(CMNT)内谷氨酸能神经元的传入及传出投射联系,为CMNT的相关功能性环路研究奠定解剖学基础。方法:利用狂犬病毒(RV)的逆行跨单级突触的能力及携带增强型黄色荧光蛋白(EYFP)的腺病毒顺行标记突触末梢的能力,采用核团微量注射方式分别将Cre依赖的两种病毒注射到VGLUT2-Cre小鼠的CMNT内,待病毒表达之后灌注小鼠,取脑进行全脑切片成像。结果:CMNT内的谷氨酸能神经元主要接受来自运动皮层、岛叶皮层、丘脑网状核、下丘脑背内侧核、黑质、臂旁核的投射,并发出投射纤维至岛叶、尾状核、基底外侧杏仁核、丘脑网状核及嗅觉相关皮层。结论:CMNT内的谷氨酸能神经元在接受广泛的来自于皮层和丘脑核团投射的同时又投射至众多大脑核团和皮质,并且与岛叶、丘脑网状核之间存在着较多的往返投射联系,这表明CMNT可能参与到上、下游核团的相关行为的调控当中。     

大鼠孤束核内儿茶酚胺能神经元接受面口部深层组织伤害性信息并向臂旁核投射的形态学研究

为了探讨孤束核(NTS)内儿茶酚胺能神经元是否与面口部深层组织的伤害性信息有关并向臂旁核投射,本研究运用荧光金(FG))逆行追踪,福尔马林刺激咬肌和免疫荧光技术相结合的三重标记方法,在荧光显微镜下观察了大鼠NTS内酪氨酸羟化酶(TH)阳性并表达FOS蛋白的神经元向臂旁核的投射。将2％FG注入一侧臂旁外侧核后,向同侧咬肌内注射2％福尔马林溶液,并行TH和FOS免疫荧光组织化学染色,荧光显微镜下在同侧NTS内的连合、内侧、中间内侧和腹侧亚核中可见重叠分布的FG、FOS、TH单标神经元以及FG／TH、FOS／TH、FOS／FG双标和FG／FOS／TH三标神经元。FG／TH和FOS／TH双标神经元分别占同侧NTS内TH阳性神经元总数的28.6％和34.8％;FOS／FG双标神经元占同侧FG逆标神经元总数的26.4％;FG／FOS／TH三标神经元分别占同侧TH阳性神经元和FG逆标神经元总数的23.7％和8.4％。本结果提示大鼠NTS中的部分儿茶酚胺能神经元接受面口部深层组织的伤害性信息并向臂旁外侧核传递。     

孤束核内儿茶酚胺能神经元汇聚内脏传入与口面部躯体伤害性信息并向臂旁核投射

为了研究内脏初级传入与口面部深层组织躯体伤害性信息是否汇聚于孤束核(NTS)中向臂旁核(PBN)投射的儿茶酚胺(CA)能神经元。本实验将SD大鼠随机分为两组。第一组动物以生物素化的葡聚糖胺(BDA)注入颈部迷走神经主干跨节追踪,四甲基罗达明(TMR)注入臂旁外侧核(LPB)逆行追踪,福尔马林刺激咬肌并行FOS的免疫荧光组织化学染色;第二组动物以BDA注入颈部迷走神经主干跨节追踪,福尔马林刺激咬肌并行FOS和酪氨酸羟化酶(TH)染色。在激光扫描共聚焦显微镜下对两组大鼠NTS内的标记细胞和纤维进行了观察。两组实验中,主要在NTS的内侧、中间内侧和连合亚核内观察到重叠分布的TMR、FOS或TH、FOS单标神经元。其中部分TMR逆行标记的或TH阳性神经元呈FOS阳性并与BDA跨节标记的纤维和终末形成紧密接触。提示大鼠NTS内的CA能神经元可能汇聚了内脏初级传入和口面部深层组织的躯体伤害性刺激信息并向LPB投射。     

大鼠大脑运动皮质向脑干运动前神经元的谷氨酸能投射

为观察大鼠大脑运动皮质向脑干运动前神经元所在区域的谷氨酸能投射。用逆行追踪和免疫荧光组织化学染色相结合掇标技术，将四甲基罗达明分别注入臂上侧核，三叉上核或延髓网状结构外侧部后，ＴＭＲ逆神经元分别见于额叶２区，额叶１区域额叶１区和２区的Ｖ层；磷磷酸激活的谷氨酸胺酶，样阳性神经元见于大脑运动皮质Ⅱ－Ⅵ层的锥体细胞；ＴＭＲ逆标神经元几乎均呈ＰＡＧ样阳性。结果提示，大脑运动皮质发出的皮质脑干束主要终止干运     

杏仁核内去甲肾上腺素能神经纤维的传入联系

本实验用神经元逆行荧光标记和单胺荧光组化联合法研究了大白鼠杏仁核(AC)内去甲肾上腺素能(NA)神经纤维的细胞起源及投射特点。一侧AC内注射荧光标记物后,两侧蓝斑(A_6群)中段背份和头段、延體腹外侧网状结构(A_1群)和孤束核(A_2群)出现NA逆行荧光标记细胞,都以同侧为主。A_1和A_2群内的逆行标记细胞主要见于两细胞群的中下份。A_1,2,6群内尚存在少数非NA逆行标记细胞。AC与同侧尾壳核、伏隔核与额前皮质配对注入不同标记物后,同侧蓝斑内观察到双标记的NA神经细胞。双侧AC分别注入不同标记物后,两侧蓝斑均有双标记NA细胞出现。     

大鼠肾上腺素能神经元对咽肌前运动神经元的调控

用PRV和PNMT免疫组化双标记方法研究脑内肾上腺素能神经元对咽肌前运动神经元的调控.观察到在延髓的C1、C2及C3等部位有PRV和PNMT双标记细胞,直接证明脑干中的肾上腺素能神经元和孤束核中调控咽肌运动的前运动神经元有纤维联系.推测可能和调控咽肌的运动有关.     

APP/PS1双转基因阿尔茨海默病模型小鼠蓝斑去甲肾上腺素能神经元的体视学分析

目的:观察APP/PS1双转基因阿尔茨海默病(AD)模型小鼠(APP/PS1 dtg)蓝斑去甲肾上腺素能神经元的数量和形态变化.方法:选用雌性APP/PS1 dtg和同龄野生型小鼠,分为年轻组(5～6月龄)和老年组(16～17月龄).取小鼠脑组织冷冻切片,采用酪氨酸羟化酶(TH)免疫组织化学显色显示蓝斑去甲肾上腺素神经元、无偏差体现学方法定量分析TH阳性神经元总数及细胞体积等的变化.结果:免疫组织化学显色显示,与野生型小鼠比较,老年组APP/PS1 dtg蓝斑TH阳性神经元胞体变大,细胞总数量减少23％,并可见形态异常的TH阳性纤维.此外,在APP/PS1 dtg,蓝斑TH阳性神经元的平均细胞体积老年组比年轻组增加,并与蓝斑总体积呈正相关.结论:老年组APP/PS1 dtg小鼠蓝斑TH阳性神经元和纤维发生退行性改变,这些改变与AD患者蓝斑的病理改变相似.     

猫丘脑中央外侧核内丘脑皮质投射神经元的超微结构及其突触联系

应用ＨＲＰ逆行追踪法在电镜水平上对猫丘脑中央外侧核内皮质投射神经元的超微结构及其突触联系首次进行了研究。该核内皮质投射神经元以中型多见，胞核较大，核仁清晰，偏位，核膜有凹陷，常染色质较多，胞质内含丰富的线粒体，游离核糖体和粗面内质网。标记树突直径变化较大，从０．６８μｍ到４．４μｍ，含较多的线粒体、微管及滑面内质网，凶突触小泡。标记的皮质投射神经元胞体和树突做为突触后成分，与非标记的突触前成分形成     

通过猫脊髓背外侧索下行的单胺能神经元定位研究

将荧光染料核黄(NY)的逆行追踪和单胺荧光组织化学方法相结合,用于对通过猫脊髓背外侧索(DLF)下行纤维的胞体的定位。在4只猫上,于脊髓的T_2节段的DLF作单侧横切,并用NY处理以后,其脑干再用Falck和Hillarp的方法处理。在同侧的中缝大核和与之相毗邻的网状大细胞核内,看到被NY标记的5-羟色胺能神经元;在同侧上橄榄核的背外侧、蓝斑和蓝斑下核内,看到被NY标记的去甲肾上腺素神经元。这些结果暗示,DLF下行的单胺能纤维,主要起源于延髓的5-羟色胺能细胞群B_3和脑桥的去甲肾上腺素能细胞群A_5～A_7。     

大鼠中脑水管周围灰质各分区向下丘脑orexin阳性神经元分布区的投射及其联系

目的:观察大鼠中脑水管周围灰质(PAG)不同分区神经元发出的投射纤维与下丘脑orexin阳性神经元之间的联系,阐明PAG不同分区神经元支配下丘脑orexin阳性神经元的形态学基础。方法:首先将逆行示踪剂霍乱毒素B(CTb)注射到下丘脑orexin阳性神经元胞体分布区域,免疫组织化学显色观察PAG内CTb逆行标记神经元的分布特点;再将顺行示踪剂生物素化葡聚糖胺(BDA)注射到PAG不同分区,采用免疫组织化学双标记的方法,在下丘脑内观察BDA标记神经纤维及其终末与orexin阳性神经元的重叠分布特点和它们之间的联系。结果:将CTb注射到单侧下丘脑穹窿上区或外侧区后,在注射点同侧PAG的外侧区(lPAG)和腹外侧区(vlPAG)可见大量CTb逆标神经元,背外侧区(dlPAG)及背内侧区(dmPAG)仅见少量标记神经元。注射点对侧PAG区域也可观察到少量CTb标记神经元。将BDA分别注射到单侧dlPAG、lPAG和vlPAG后,在下丘脑双侧均可观察到BDA顺标纤维及其终末,但注射点同侧BDA标记纤维和终末的数量明显多于对侧。源自lPAG和vlPAG的BDA标记纤维及其终末与orexin神经元胞体在穹窿上区形成明确的重叠分布和密切接触,而源自dlPAG的纤维少见与orexin神经元接触。结论:lPAG及vlPAG来源的纤维及其终末与下丘脑内的orexin阳性神经元的分布区域重叠并形成密切接触,可能直接影响orexin神经元的功能。     

锥体束神经元在大鼠、树皮层的分布及其与GABA能神经元的关系

以大鼠和树作为研究材料，在脑桥下缘切断一侧锥体束，用HRP逆行标记和计算机三维重构观察锥体束神经元在皮层的分布，以及在光镜和电镜下观察锥体束神经元和GABA能神经元的关系。逆行标记的锥体来神经元主要分布于皮层的运动区和体感区，在枕区、扣带区、颞区和屏状皮层中都有少量分布。树锥体束神经元的总数是大鼠的1．5倍，用计算机重构显示HRP标记的锥体束神经元在脑内吻尾方向上的分布跨度比大鼠小，故其分布范围较大鼠集中，密度较高，且其中大细胞也较多．树的锥体来神经元长径在15μm以上者占74．0％；大鼠则占62．9％。在电镜下观察这些锥体束神经元的胞体上全分布着对称型的突触，其中既有GABA能，也有非GA-BA能者。不同胞体上接受GABA能和非GABA能突触的比例不同，一种较大的胞体上GABA与non－GABA阳性终末相比，前者数量大（13：3）而较小的胞体上则相反，两者的数量相比，为7：18。大鼠和树的锥体束神经元胞体的单位周长上接受的突触数目也不同，树锥体束神经元胞体的10μm单位周长上分布有4．4个突触。大鼠则为3．4个。随着动物进化锥体束神经元接受突触的数目有增加的趋势．     

大鼠臂旁核内5-羟色胺阳性纤维和终末的来源

本研究采用荧光金(FG)逆行追踪与5-羟色胺(5-HT)免疫荧光组化染色相结合的双重技术观察了臂旁核(PBN)内5-HT阳性神经纤维和终末的来源。将FG注入PBN后,FG逆标神经元主要分布在三叉神经核簇、脑干网状结构外侧小细胞部、中缝核簇和中脑导水管周围灰质(PAG);免疫荧光组化染色的结果显示5-HT阳性神经元主要位于中缝核簇和PAG;在中缝核簇和PAG内可见FG逆标并呈5-HT阳性的双重标记神经元。上述结果表明,中缝核簇和PAG内的5-HT能神经元向PBN发出投射,它们在躯体和内脏感觉信息的传递和调控方面发挥重要作用。     

小鼠中脑导水管周围灰质下行投射的SP能终末与中缝大核内SP受体阳性神经元的突触联系

P物质(SP)在中枢神经系统内具有镇痛作用,中脑导水管周围灰质(PAG)和中缝大核(NRM)是中枢内源性镇痛系统的关键结构。本研究采用顺行追踪与免疫组化双重染色相结合的三标方法,观察了起源于PAG的SP能阳性终末与NRM内SP受体(SPR)阳性神经元之间的突触联系。结果显示:将生物素化葡聚糖胺(BDA)注入小鼠PAG的腹外侧区后,BDA顺行标记终末可见于脑干的许多区域,但主要位于NRM。其中的部分BDA顺行标记终末呈SP阳性。NRM内可见到散在分布的SPR阳性神经元。在电镜下可见来自PAG的SP/BDA双标终末与NRM内的SPR阳性神经元的胞体和树突形成以非对称性为主的突触联系。本研究的结果提示起源于PAG的下行投射终末所释放的SP是激活中枢内源性镇痛系统并使之发挥镇痛作用的重要神经活性物质。     

猫丘脑腹后外侧核内皮质投射神经元超微结构及其突触联系——HRP法电镜研究

本文应用HRP逆行追踪法在电镜水平上对猫丘脑腹后外侧核内皮质投射神经元的超微结构及其突触联系进行了研究。该核内投射神经元超微结构特点为胞核较大,核仁清晰,核膜常有凹陷,常染色质较多,异染色质较少,胞浆丰富,含有大量的游离核糖体、粗面内质网及线粒体。标记的皮质投射神经元胞体和树突与非标记轴突形成轴-体突触和轴-树突触;标记树突还可以和突触前树突形成树-树突触,并做为中央树突参与形成汇聚型突触复合体。此外在标记的胞体与非标记的树突之间,标记的树突与非标记的树突之间,两标记的树突之间还存在着非突触丝状连接。