UCP2通过调控mTOR对LPS诱导的HK2细胞自噬产生影响

目的探讨线粒体解耦联蛋白2(uncouplingprotein2,UCP2)在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导肾小管上皮细胞(HK2细胞)自噬中的作用机制。方法以HK2细胞为研究对象,采用不同质量浓度LPS(0,0.1,0.5,1,5μg/ml)干预不同时间(0,12,24,48 h),Western blot检测HK2细胞UCP2蛋白水平变化。并将HK2细胞分为4组:正常对照组,LPS组(LPS induced),UCP2shRNA组(UCP2 shRNA+LPS)和UCP2 scramble组(UCP2 scramble+LPS),LPS为1μg/ml,24 h。利用Real-time PCR和Western blot检测HK2细胞UCP2 mRNA和蛋白表达水平,免疫荧光检测线粒体动力相关蛋白1(Drp1)表达变化,Western blot检测线粒体融合蛋白2(Mfn2)、Drp1,自噬相关蛋白Beclin-1、LC3B,凋亡相关蛋白Bcl-2、Cleaved-Caspase-3以及mTOR的蛋白表达水平。结果 Western blot结果显示,1μg/ml LPS处理的HK2细胞,在12 h和24 h UCP2蛋白的水平较对照组明显增加(P0.05);0.1,0.5和1μg/ml的LPS刺激24 h,UCP2水平与对照组相比逐渐增加。使用1μg/ml的LPS刺激24 h,免疫荧光和Western blot发现,UCP2, Drp1较对照组明显增加,Mfn2表达减少(P0.05),而转染UCP2 shRNA后,可显著抑制UCP2, Drp1水平的增加以及Mfn2水平的降低(P0.05)。同时,Western blot发现LPS组自噬相关蛋白Beclin-1,LC3B,促凋亡相关蛋白Cleaved-Caspase-3明显增加(P0.05),抗凋亡相关蛋白Bcl-2水平降低(P0.05),而转染UCP2 shRNA后,Beclin-1,LC3B,Bcl-2表达水平降低,Cleaved-Caspase-3水平进一步增加(P0.05)。Western blot结果显示转染UCP2 shRNA组p-mTOR水平较正常组和LPS组明显增加(P0.05);而mTOR蛋白水平各组间无统计学差异(P0.05)。结论 UCP2在LPS诱导的HK2细胞损伤中通过自噬发挥保护作用。     

法舒地尔减轻大鼠缺血/再灌注心肌线粒体损伤和细胞凋亡北大核心CSCD

目的观察线粒体融合蛋白2(Mfn2)和发动蛋白相关蛋白1(Drp1)在法舒地尔抑制Rho激酶对抗心肌缺血/再灌注(I/R)损伤中的变化,并分析其意义。方法离体大鼠心脏,结扎冠状动脉左前降支缺血0.5 h,持续再灌注2 h模拟心肌I/R损伤模型。实验分假手术组、I/R组、法舒地尔组。测定心室动力学变化和再灌注期间冠脉流出液中乳酸脱氢酶(LDH)含量,透射电镜观察心肌超微结构改变,免疫组织化学染色检测Rho激酶下游磷酸化的蛋白磷酸酶1调节亚基12A(p-PPP1R12A/p-MYPT1)表达,Western blot法检测Mfn2、Drp1和裂解型胱天蛋白酶3(c-caspase-3)蛋白水平。结果与假手术组相比,各组再灌注不同时间点左心室收缩和舒张功能均降低,LDH释出增加;与I/R组相比,法舒地尔组左心室收缩和舒张功能得到改善,LDH释出减少;透射电镜结果显示I/R组心肌明显肌丝断裂、肌原纤维结构不完整、线粒体损伤,免疫组织化学染色显示p-MYPT1蛋白表达上调;与I/R组比,法舒地尔组心肌肌原纤维和线粒体损伤减轻,p-MYPT1蛋白表达下调;Western blot结果显示,与假手术组相比,I/R组Mfn2蛋白表达减少,Drp1和c-caspase-3蛋白水平增加,与I/R组相比,法舒地尔组Mfn2蛋白水平无明显变化,Drp1和c-caspase-3蛋白水平减少。结论法舒地尔抑制Rho激酶的抗心肌I/R损伤作用与Mfn2蛋白表达无明显关联,可能与降低Drp1蛋白表达减少线粒体损伤,进而减少细胞凋亡有关。     

干扰线粒体融合蛋白2表达对滋养层细胞株JEG-3侵袭能力影响的作用机制研究

目的 观察干扰线粒体融合蛋白2(Mfn2)表达对滋养层细胞株JEG-3侵袭能力影响及其作用机制。方法 收集2018年1月至2021年5月我院接收治的40例子痫前期孕妇以及同期正常健康孕妇40例胎盘组织,采用qRT-PCR检测Mfn2的mRNA在两组孕妇胎盘组织中的表达情况。构建Mfn2低表达组（Si-Mfn2）及阴性对照空载体组（Si-NC）,分别转染滋养层细胞株JEG-3,并设立JEG-3对照组。采用Western blot检测各组细胞中Mfn2水平;CCK-8和细胞克隆实验检测Mfn2对JEG-3细胞增殖能力的影响;Transwell实验检测Mfn2对JEG-3细胞侵袭和迁移能力的影响;JC-1染色和透射电镜观察各组细胞的线粒体膜电位（MMP）和线粒体形态结构变化;采用Westernblot检测各组细胞中缺氧诱导因子（HIF-1α）、缺氧诱导因子脯氨酸羟化-1(HPH-1)以及瘦素的表达水平。结果 正常孕妇胎盘组织Mfn2蛋白呈强阳性表达,子痫前期孕妇胎盘组织的Mfn2蛋白呈弱阴性表达,与正常孕妇胎盘组织相比,子痫前期孕妇胎盘组织的Mfn2 mRNA相对表达量显著降低（P<0...     

FoxO3a介导药根碱保护N2a-SW模型中损伤线粒体机制的初步探讨

目的 探讨FoxO3a介导药根碱(JAT)保护稳转APP695swedish基因的小鼠神经瘤N2a细胞(N2a-SW)模型中损伤线粒体的机制.方法 以小鼠神经瘤N2a细胞为对照组,N2a-SW细胞为AD模型组,应用不同浓度JAT进行处理后,检测JAT对模型组损伤线粒体中FoxO3a、mRNA及线粒体相关蛋白的表达影响.结果 与N2a组相比较,SW模型组细胞形态呈明显损伤形态、细胞中Aβ蛋白表达增加至(176.01±17.47)％、细胞内活性氧ROS聚集升高至(264.14±8.93)％;与SW组相比,应用20 μmol/L、40 μmol/L JAT处理SW细胞24 h后,可以降低ROS水平分别至(170.06±8.20)％、(100.51±11.81)％;与 SW 组相比,不同浓度 JAT(10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L)处理组不仅可以减少细胞色素C(Cyto-c)在胞浆中的释放[分别为(66.71±7.88)％、(67.99±6.89)％、(56.64±5.99)％],降低线粒体分裂调节蛋白Drp1的表达[分别为(67.62±5.87)％、(56.99±3.62)％、(38.00±10.16)％],还可抑制SW组FoxO3a磷酸化蛋白表达[分别为(66.49±3.11)％、(42.14±1.94)％、(51.12±4.55)％],并增加线粒体核心蛋白PGC1α的表达[分别为(201.51±12.43)％、(179.43±1.77)％、(157.80±16.32)％]及mRNA的表达[分别为(162.46±5.98)％、(244.92±2.67)％、(149.11±4.76)％],而总蛋白FoxO3a及mRNA不受影响,上述结果差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 JAT可能通过FoxO3a来发挥对阿尔茨海默病损伤线粒体的保护作用.     

干扰miR-29a抑制氧糖剥夺/复氧诱导的大鼠H9c2心肌细胞线粒体融合与分裂

目的 探讨干扰miR-29a对氧糖剥夺/复氧(OGD/R)诱导的心肌细胞线粒体融合与分裂的影响。方法 将H9c2细胞分为正常对照组、模型组、阴性对照组和miR-29a干扰组。采用OGD/R法诱导大鼠H9c2心肌细胞损伤模型,阴性对照组细胞转染anti-NC, miR-29a干扰组转染anti-miR-29a,正常对照组细胞不转染。反转录PCR检测miR-29a干扰效率,CCK-8法检测细胞增殖倍数,流式细胞术检测细胞凋亡率和线粒体膜电位变化,试剂盒检测超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和乳酸脱氢酶(LDH)含量,Western blot法检测Bcl2相关X蛋白(BAX)、Bcl2拮抗剂/杀伤因子(BAK)、胱天蛋白酶9(caspase-9)、线粒体分裂蛋白1(Fis1)、线粒体融合蛋白1(Mfn1)、线粒体融合蛋白2(Mfn2)、视神经萎缩蛋白1(OPA1)、磷酸化的胞外信号调节激酶(p-ERK)和磷酸化的线粒体动力蛋白相关蛋白(p-Drp1)水平。结果 与OGD/R组比较,anti-miR-29a处理的OGD/R组H9c2细胞miR-29a表达水平显著降低,细胞增殖倍数显著增...     

白藜芦醇缓解低氧/复氧诱导的TCMK1细胞线粒体自噬

目的 研究白藜芦醇(Res)对低氧/复氧(H/R)导致小鼠肾小管上皮细胞系TCMK1内线粒体功能及线粒体自噬的影响。方法 体外建立H/R细胞模型,经Res或(和)线粒体自噬抑制剂1 (Mdivi-1)预处理TMCK1细胞2 h,采用CCK8法检测TCMK1细胞存活率;试剂盒法检测钙离子超负荷情况;流式细胞测量术测定线粒体膜电位(MMP)变化和活性氧(ROS)含量;Western blot检测线粒体融合蛋白(OPA)、分裂蛋白(DRP)以及凋亡相关蛋白cleaved caspase-3,Bax, Bcl2表达;免疫荧光检测线粒体外膜转位酶(TOMM20)和自噬溶酶体相关膜蛋白2(LAMP2)共定位情况。结果 与对照组相比,H/R组TCMK1细胞存活率显著减低(P<0.05),细胞内钙离子、ROS及MMP含量显著减低(P<0.05),OPA表达显著减低(P<0.05),同时DRP表达显著增高(P<0.05),线粒体与LAMP2共定位的细胞数目显著减少;与H/R组相比,10μmol/L Res可以显著增加TMCK1细胞的存活率(P<0.05),抑制细胞内ROS的...     

Mfn2在环孢素A诱导HeLa细胞生长停滞中的作用

 目的: 探讨环孢素A (TSA) 对HeLa细胞中线粒体融合蛋白 2(Mfn2)表达水平极其下游通路的影响。方法: 运用不同浓度的TSA处理HeLa细胞,分别检测细胞增殖、细胞凋亡以及细胞的周期改变;Western blot检测Ras、p-Raf、Raf、p-ERK、ERK、p-Akt、Akt和Mfn2的蛋白水平;real-time PCR检测Mfn2 mRNA的表达水平;用免疫共沉淀法检测Mfn2与Ras结合的水平。将HeLa细胞过表达Mfn2后,观察上述指标的改变。结果: TSA对HeLa的抑制作用呈剂量依赖和时间依赖的特点。HeLa细胞经TSA处理后,Mfn2的mRNA和蛋白表达水平均显著增高,Mfn2与Ras的结合升高,Raf和ERK的磷酸化水平降低。过表达Mfn2抑制了Ras-Raf-ERK通路并诱导了HeLa细胞的生长阻滞,但对细胞的凋亡水平影响较小。结论: Mfn2参与了TSA诱导的HeLa细胞生长阻滞,其效应可能是通过抑制Ras-Raf-ERK通路实现的。     

动力相关蛋白1促进高糖诱导的冠状动脉内皮细胞线粒体损伤

目的 探讨动力相关蛋白1(Drp1)在高糖诱导的冠状动脉内皮细胞中的表达水平、生物学功能及其对线粒体功能的影响。方法 通过实时荧光定量PCR和Western blot实验检测高糖诱导的冠状动脉内皮细胞中Drp1、OPA1及MFN1的表达水平；通过转染Drp1 shRNA表达质粒敲低Drp1的表达，用CCK-8实验检测细胞活力，用Annexin V染色实验检测细胞凋亡水平，并通过JC-1荧光染色实验和Calcein-AM荧光染色实验分别检测线粒体膜电位和线粒体通透性转换孔。结果 高浓度葡萄糖处理的冠状动脉内皮细胞中Drp1 mRNA和蛋白的表达显著升高（均P<0.05），细胞活力显著下降（P<0.05），凋亡细胞比例显著升高（P<0.05），线粒体膜电位降低（P<0.05），线粒体通透性转换孔活性升高（P<0.05）；敲低Drp1可以增强细胞活力（P<0.05），并显著抑制高糖诱导的细胞凋亡（P<0.05）、线粒体膜电位下降（P<0.05）和线粒体通透性转换孔活性的升高（P<0.05）。结论 Drp1在高糖诱导的冠状动脉内皮细胞损伤中...     

尿酸对大鼠肾细胞线粒体损伤及Pgam5/Drp1表达的影响

目的:探讨尿酸干预大鼠肾细胞对其线粒体损伤及磷酸甘油酸变位酶家族成员5(Pgam5)和发动蛋白相关蛋白1(Drp1)表达的影响。方法:0. 6 mmol/L尿酸干预大鼠肾细胞NRK-52E,采用MTT法检测细胞活力,Hochest 33258染色观察细胞形态,流式细胞术检测细胞凋亡水平,透射电镜观察线粒体形态结构,免疫荧光染色观察Pgam5和Drp1阳性表达情况,RT-qPCR检测线粒体中Pgam5 m RNA的表达水平,Western blot检测细胞质基质中Pgam5和Drp1蛋白表达水平。结果:与正常细胞比较,尿酸干预组细胞活力显著降低,凋亡率显著升高,线粒体肿胀、空泡化,嵴断裂,线粒体中Pgam5的m RNA表达显著降低,而细胞质基质中Pgam5和Drp1的蛋白表达水平显著升高(P<0. 01)。结论:尿酸可破坏肾细胞线粒体结构,上调细胞质基质中Pgam5/Drp1表达,诱导细胞凋亡。     

四川新康温石棉通过活性氧/c-Jun氨基末端激酶(ROS/JNK)通路诱导A549细胞凋亡北大核心CSCD

目的研究活性氧/c-Jun氨基末端激酶(ROS/JNK)途径在四川新康温石棉诱导A549人肺上皮细胞凋亡过程的作用。方法采用(12.5、25、50、100、200)μg/m L温石棉作用A549细胞24 h,MTT法检测细胞存活率;设置ROS抑制组,异硫氰酸荧光素标记的膜联素Ⅴ/碘化丙啶(annexinⅤ-FITC/PI)双染色结合流式细胞术检测细胞凋亡、JC-1标记检测线粒体膜电位、二氯二氢荧光黄乙酰乙酯(DCFH-DA)负载检测ROS水平,Western blot法检测磷酸化的c-JNK1(p-JNK1)、p-JNK2、裂解型胱天蛋白酶3(c-caspase-3)蛋白水平。结果随着温石棉剂量增大,细胞存活率下降,温石棉半数抑制剂量为223.43μg/m L;细胞凋亡率呈现剂量-效应关系,胞内ROS水平升高,p-JNK1、p-JNK2、c-caspase-3蛋白水平明显上调,线粒体膜电位降低;与相同剂量温石棉组比较,ROS抑制剂能显著抑制细胞凋亡,降低ROS水平,减少线粒体膜电位的降低程度,并下调p-JNK1、p-JNK2和c-caspase-3蛋白的表达。结论四川新康温石棉可能通过ROS/JNK途径诱导A549细胞发生凋亡。     

过表达脾酪氨酸激酶降低氧化应激诱导的小鼠成骨细胞凋亡

目的探究脾酪氨酸激酶(SYK)对氧化应激(OS)诱导的小鼠成骨细胞MC3T3-1凋亡的影响及其机制。方法过氧化氢(H_2O_2)孵育MC3T3-1细胞,建立OS模型;实时荧光定量PCR检测SYK的mRNA表达量;Western blot检测SYK、AKT、p-AKT和UCP2蛋白表达量;构建重组质粒pcDNA.3.1-SYK或pcDNA.3.1-UCP2,分别转染MC3T3-1;AKT抑制剂HIMO抑制AKT磷酸化;annexin-V FITC/PI法检测细胞凋亡;caspase-3荧光检测等试剂盒检测caspase-3活性和ROS水平。结果 OS降低MC3T3-1中SYK的表达(P0.01);过表达SYK降低OS诱导的细胞凋亡(P0.05)、caspase-3活性(P0.01)和ROS水平(P0.01);过表达SYK提高AKT的磷酸化水平(P0.05)和UCP2的表达量(P0.01);抑制AKT磷酸化后可消除过表达SYK对细胞凋亡和UCP2的表达的影响(P0.01)。在过表达SYK、抑制AKT的MC3T3-1细胞中,过表达UCP2,细胞凋亡(P0.05)和ROS水平(P0.01)均显著降低。结论过表达SYK可通过调控AKT/UCP2降低OS对小鼠成骨细胞的伤害。     

亚精胺对人子宫内膜基质细胞自噬和炎症细胞因子表达的影响

目的：探讨克罗米芬（CC）对子宫内膜基质细胞（hEndoSCs）的损伤作用,并研究亚精胺对受损子宫内膜基质细胞自噬和炎症细胞因子表达的影响。方法：实验分为对照组、亚精胺组、克罗米芬组（CC组）、CC+亚精胺组。MTT法检测hEndoSCs与不同浓度CC或亚精胺共同孵育24 h后细胞的存活率;流式细胞技术检测4组细胞内活性氧（ROS）含量和细胞凋亡水平。Western blot检测自噬途径相关蛋白ULK1、p-ULK1、LC-3Ⅱ和凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Cleaved-caspase 3的表达。采用RT-qPCR检测IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA表达量。结果：与对照组相比,CC组细胞存活率下降,细胞凋亡率、ROS含量、Bax、Cleaved-caspase 3表达量升高,Bcl-2表达量降低,自噬相关蛋白p-ULK1、LC-3Ⅱ/Ⅰ水平降低,炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-αmRNA表达升高（P<0.01）。与对照组相比,亚精胺组细胞的存活率无明显变化（P>0.05）。与CC组相比,CC+亚精胺组细胞存活率显著提高,细胞凋亡率、ROS含量、Bax和...     

mfn2基因转染对非酒精性脂肪肝细胞线粒体功能的影响

目的:研究线粒体融合蛋白基因2(mfn2)对非酒精性脂肪肝细胞线粒功能的影响。方法:利用脂质体lipofectamine2000将mfn2基因荧光表达载体(pEGFP-mfn2)转染肝细胞株L02,并采用油酸诱导L02建立非酒精性脂肪性肝细胞模型,RT-PCR及Western blotting检测细胞mfn2mRNA和蛋白的表达;荧光素酶ADP/ATP发光法检测各组细胞内ATP水平,荧光探针DCFH-DA测定细胞活性氧(ROS)生成水平;JC-1标记细胞线粒体,流式细胞仪检测线粒体跨膜电位(Δψm)的变化。结果:转染mfn2基因的L02可以稳定高表达mfn2mRNA及蛋白,转染后L02内ATP浓度及线粒体跨膜电位显著升高(P0.05),而ROS生成水平则显著下降(P0.05);经油酸诱导肝细胞脂肪变性后,L02mfn2表达受抑制,各组细胞内ATP浓度及线粒体跨膜电位均显著下降(P0.01),而ROS生成水平较前均显著升高(P0.01),但转染组细胞内ATP下降水平以及线粒体跨膜电位下降幅度均显著低于未转染组,而未转染组ROS升高程度则显著高于转染组(P0.01)。结论:外源性mfn2基因转染可以抑制油酸诱导的肝细胞内ATP浓度和线粒体跨膜电位的下降以及ROS生成的增加。     

IL-8促进A549细胞迁移过程中对线粒体融合与分裂基因表达的影响

目的:探讨IL-8作用下人肺腺癌A549细胞的迁移率变化以及线粒体融合与分裂基因的变化。方法:实验分为对照组和IL-8作用组。采用细胞划痕实验方法观察IL-8作用下细胞迁移能力的变化;Transwell小室检测细胞的迁移率;ELISA实验检测不同迁移率的细胞内源性IL-8的分泌量;Western blot法检测线粒体外膜蛋白Tom20及线粒体膜间腔蛋白细胞色素C(cytochrome C,Cyt C)的表达。RT-PCR检测线粒体融合基因Mfn1、Mfn2、OPA1及分裂基因Fis1、Drp1、MTP18的表达;Mito Tracker Red CMXRos染色激光共聚焦显微镜观察细胞中线粒体的形态。结果:肺腺癌A549细胞的迁移率高于SPC-A-1细胞,且内源性IL-8的分泌也高于SPC-A-1细胞。IL-8作用下A549细胞的迁移率增加,并存在时间依赖性。与对照组比较,IL-8作用组的A549细胞线粒体膜间腔蛋白Cyt C蛋白表达降低(P0.05),外膜蛋白Tom20表达增加(P0.05),线粒体外膜融合基因Mfn1及Mfn2表达增加(P0.05),内膜融合基因OPA1表达降低(P0.05),分裂基因Fis1无明显变化(P0.05),Drp1及MTP18增加(P0.05);激光共聚焦显微镜显示IL-8作用下线粒体形态发生变化,出现点状聚集。结论:A549细胞在IL-8作用下迁移率增加,可能与A549细胞线粒体融合与分裂基因变化有关。     

囊性纤维化跨膜转导调节因子对低氧诱导的心肌H9c2细胞凋亡的影响

目的:探讨囊性纤维化跨膜转导调节因子(CFTR)对低氧诱导的大鼠心肌H9c2细胞损伤的影响及其作用机制。方法:利用专业缺氧工作站使大鼠心肌H9c2细胞暴露于1%氧含量环境中建立缺氧培养模型。H9c2细胞中CFTR过表达后在缺氧环境中培养,RT-qPCR和Western blot法检测CFTR的mRNA和蛋白表达水平;MTT法检测细胞存活率;Hoechst 33342和Annexin V-FITC/PI染色法检测细胞凋亡;DCF-DA探针检测细胞内活性氧簇(ROS)的生成。结果:1%低氧环境培养可显著诱导H9c2细胞凋亡,同时伴随CFTR mRNA和蛋白水平的下调和ROS的生成增加(P0.05)。过表达CFTR后低氧诱导的H9c2细胞凋亡以及ROS生成均明显减少;而CFTR蛋白特异性抑制剂CFTRinh-172可显著逆转过表达CFTR的作用。结论:CFTR可能通过抑制ROS生成对抗低氧诱导的心肌细胞凋亡。     

异土木香内酯通过介导ROS 产生及线粒体损伤诱导人宫颈癌Hela细胞凋亡

目的:探讨异土木香内酯通过介导ROS 产生及线粒体损伤诱导人宫颈癌Hela 细胞凋亡机制。方法:不同终浓度异土木香内酯体外诱导Hela 细胞24 h 及加入抑制剂NAC 作为实验组,以正常细胞作为对照组,MTT 测定细胞活性;Hoechst 33258 染色观察Hela 细胞凋亡细胞核变化;流式细胞仪检测细胞凋亡及周期和ROS 产生变化和MMP 水平;Western blot 方法测定细胞色素C 蛋白、Bcl-2、Bax 和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase-3)蛋白表达水平。结果:异土木香内酯以浓度依赖性抑制Hela 细胞生长;20 mol/ L 和40 mol/ L 终浓度异土木香内酯处理Hela 细胞24 h 后,细胞核出现典型的核固缩及核碎裂凋亡形态,细胞凋亡率增加,可抑制细胞生长于S 期,细胞内均可诱导ROS 的产生。ROS 抑制剂NAC 可以明显阻断异土木香内酯对Hela 细胞生长的抑制作用,降低细胞凋亡率;20 mol/ L 和40 mol/ L 终浓度异土木香内酯处理Hela 细胞24 h后,Bax 蛋白表达水平明显增加而Bcl鄄2 蛋白表达水平明显降低,同时Caspase-3 蛋白也被活化,出现cleaved Caspase 蛋白,线粒体内细胞色素C 蛋白释放增加。结论:异土木香内酯在体外可通过介导ROS 产生及线粒体损伤来抑制人宫颈癌Hela 细胞生长且诱导其凋亡,且伴随Bax 蛋白表达上调、Bcl-2 蛋白表达下调及Caspase-3 活化相关变化。     

青蒿琥酯通过增加活性氧簇生成诱导人肝癌HepG2细胞凋亡

目的:探讨青蒿琥酯诱导人肝癌Hep G2细胞凋亡的机制及活性氧簇(ROS)在青蒿琥酯诱导Hep G2细胞凋亡中的作用。方法:采用MTT法观查青蒿琥酯对人肝癌Hep G2细胞存活的影响,Hoechst 33258荧光染色法观察细胞凋亡形态的变化,流式细胞术检测Hep G2细胞的凋亡率,DCFH-DA检测细胞凋亡过程中ROS的变化。Western blot检测细胞内凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3和细胞色素C(Cyt C)蛋白水平的变化。采用NADPH氧化酶抑制剂夹竹桃麻素(apocynin)预处理Hep G2细胞,Western blot检测NADPH氧化酶亚基p47~(phox)和p22~(phox)蛋白表达水平,流式细胞术检测ROS变化。结果:与对照组相比,青蒿琥酯作用于Hep G2细胞24 h后,细胞存活率明显减少(P0.05);细胞核呈致密浓染色,细胞凋亡比例升高(P0.05);ROS明显升高(P0.05);Western blot结果显示,青蒿琥酯作用后细胞内Bcl-2蛋白表达下调,Bax蛋白表达上调,Bax/Bcl-2蛋白表达比例升高,cleaved caspase-3和Cyt C蛋白水平升高。Apocynin预处理能降低青蒿琥酯给药组细胞内p47~(phox)和p22~(phox)蛋白表达及ROS的生成。结论:青蒿琥酯能诱导Hep G2细胞凋亡,其凋亡过程可能与ROS的生成增加相关。     

胱抑素C对氧化型低密度脂蛋白诱导的人血管平滑肌细胞凋亡的影响

目的： 研究胱抑素C（cystatin C）对氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）诱导的人血管平滑肌细胞（VSMC）的作用，以探讨cystatin C在心血管疾病中的生物学特性。方法：利用ox-LDL诱导人VSMC，MTT法检测ox-LDL诱导时间及浓度对细胞存活率的影响，确定ox-LDL最佳诱导浓度和时间，将对数生长期的人VSMC随机分成正常细胞组、pCDNA3.1-cystatin C转染组、ox-LDL诱导组以及ox-LDL+ pCDNA3.1-cystatin C转染组，检测各组细胞乳酸脱氢酶（LDH）、活性氧（ROS）、三磷酸腺苷（ATP）生成量以及caspase-3活性变化，并通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blotting法测定各组凋亡相关基因bax、bcl-2和Bax、Bcl-2蛋白的表达情况。结果：ox-LDL+ pCDNA3.1-cystatin C转染组与ox-LDL诱导组比较，LDH、ROS生成量和caspase-3表达量明显降低，差异有统计学意义（P<0.01）；ATP生成量显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）。RT-PCR和Western blotting法测定显示ox-LDL诱导组促凋亡基因bax及Bax蛋白表达增加、抗凋亡基因bcl-2和Bcl-2蛋白表达减少，ox-LDL＋pCDNA3.1-cystatin C转染组Bcl-2表达增加、Bax表达减少，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：Cystatin C抑制ox-LDL诱导的VSMC凋亡，其机制可能与其上调Bcl-2及下调Bax表达有关。     

AGEs对人主动脉内皮细胞线粒体融合蛋白表达的影响

目的:明确晚期糖基化终产物(AGEs)是否可引起内皮细胞线粒体融合蛋白Mfn1和Mfn2表达水平的变化。方法:AGEs用糖基化牛血清白蛋白(AGE-BSA)代替。将购买的原代人主动脉内皮细胞株进行体外扩增、传代、分组,进行AGEs干预,分为对照组,不同浓度梯度的AGEs干预组(50 mg/L、100 mg/L和200 mg/L)和干预不同时间组(分别是100 mg/L的AGEs干预人主动脉内皮细胞6 h、12 h、24 h和48 h)。采用实时荧光定量PCR方法对AGEs干预后的人主动脉内皮细胞Mfn1和Mfn2的mRNA表达水平进行检测;采用Western blot法对AGEs干预后的人主动脉内皮细胞Mfn1和Mfn2的蛋白表达水平进行检测。结果:不同浓度AGEs干预人主动脉内皮细胞24 h可引起Mfn1和Mfn2的mRNA和蛋白表达水平显著降低;100 mg/L AGEs干预人主动脉内皮细胞6 h,Mfn1和Mfn2的mRNA和蛋白表达水平与对照组相比无显著变化,而干预12 h、24 h和48 h均引起人主动脉内皮细胞Mfn1和Mfn2的mRNA和蛋白表达水平显著降低。结论:AGEs干预体外培养的人主动脉内皮细胞12 h后其线粒体融合蛋白Mfn1和Mfn2的表达水平降低,提示AGEs可能引起内皮细胞线粒体动力学的改变,并可能通过这一途径引起内皮细胞线粒体功能异常,而导致内皮细胞的功能异常。     

6-姜酚对大鼠髓核细胞凋亡的影响

目的:研究6-姜酚对过氧化氢(H_2O_2)诱导的大鼠髓核细胞凋亡的影响及其可能机制。方法:获取SD大鼠髓核细胞并在体外扩增培养,CCK-8法测定不同浓度H_2O_2及6-姜酚对髓核细胞活力的影响,同时采用Western blot检测6-姜酚作用不同时间后p-Akt的蛋白水平。实验分为4组:对照组、H_2O_2组、6-姜酚组(6-姜酚+H_2O_2)及LY294002组(6-姜酚+H_2O_2+LY294002)。流式细胞术检测细胞凋亡及活性氧簇(ROS)水平,TUNEL荧光比较凋亡细胞比率,透射电镜观察线粒体微结构改变,Western blot检测caspase-3、Bcl-2、Bax、p-Akt、Akt及p53蛋白的水平,RT-qPCR检测蛋白多糖及Ⅱ型胶原的mRNA表达。结果:CCK-8实验结果发现24 mg/L为6-姜酚促进大鼠髓核细胞活力的最佳浓度,80μmol/L的H_2O_2作用6 h可用于氧化损伤造模。p-Akt的蛋白水平随6-姜酚干预时间延长而增多。与对照组比较,H_2O_2组的细胞凋亡率、细胞内ROS水平及TUNEL染色阳性细胞比率增高,细胞线粒体肿胀明显,同时促凋亡蛋白caspase-3、Bax及p53的蛋白水平明显增加,抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低,蛋白多糖及Ⅱ型胶原的mRNA表达下降(P0.05);与H_2O_2组比较,6-姜酚可以减少H_2O_2造成的髓核细胞凋亡及相关凋亡蛋白表达,而PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002可以抑制6-姜酚的作用。结论:6-姜酚可经PI3K/Akt信号通路减轻H_2O_2诱导的髓核细胞氧化损伤,抑制髓核细胞凋亡,促进髓核细胞外基质表达。