温肾阳方及其拆方通过TGF-β信号通路促进小鼠肢芽干细胞增殖与分化

目的?探讨温肾阳方及方中单味中药骨碎补、淫羊藿是否通过TGF-β信号通路促进小鼠肢芽干细胞增殖与分化。方法?分别采用温肾阳方（0.42 g生药/mL）、骨碎补（0.09 g生药/mL）及淫羊藿（0.09 g生药/mL）煎剂和等体积生理盐水给大鼠灌胃，制备含药血清，分离孕12.5天小鼠肢芽干细胞进行微团培养，含药血清干预后，CCK-8法检测肢芽干细胞增殖能力，阿尔新蓝染色检测软骨分化能力，IPP软件统计软骨球个数及面积，Real-time PCR法检测Col2a1及Aggrecan表达水平。采用293T细胞，脂质体转染TGF-β信号通路报告基因4×SBE，荧光素酶实验分析各组对TGF-β信号通路的调节作用。采用TGF-β信号通路抑制剂SB431542抑制肢芽干细胞中TGF-β信号通路，进行阿尔新蓝染色及软骨细胞外基质检测。结果?与空白组比较，温肾阳方、淫羊藿、骨碎补组干预48 h和72 h后小鼠肢芽干细胞增殖均增强（P<0.01，P<0.05）。阿尔新蓝染色显示，温肾阳方、淫羊藿、骨碎补组软骨球个数及面积增加（P<0.05），软骨细胞基质Col2a1及Aggrecan的表达增强（P<0.01）。荧光素酶实验发现，与空白组比较，各中药组TGF-β信号通路活性上调（P<0.01，P<0.05）。加入TGF-β信号通路抑制剂SB431542后，与空白组比较，抑制剂组软骨球个数及面积均明显减少（P<0.01）；而温肾阳方、淫羊藿、骨碎补组软骨生成抑制显著缓解（P<0.05），但与空白组比较，软骨球个数及面积仍明显减少（P<0.01，P<0.05），Col2a1及Aggrecan水平也有相似的变化趋势（P<0.01）。结论?温肾阳方及温肾阳药骨碎补、淫羊藿可以部分通过TGF-β信号通路促进小鼠肢芽干细胞增殖与分化。     

补肾活血方含药血清对退变型人原代软骨细胞microRNA表达谱的影响

目的:探究补肾活血方含药血清对白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)刺激的人原代软骨细胞microRNA芯片表达的影响。方法:采用免疫组化和甲苯胺蓝染色鉴定了原代培养的人软骨细胞,然后采用IL-1β(10 ng/m L)刺激人原代软骨细胞,并且加入补肾活血方含药血清处理24 h。抽提细胞RNA采取反转录荧光标记microRNA,标记完成之后取样品与microRNA表达谱芯片进行杂交,并用激光扫描仪检测其杂交信号,再用相应软件分析所得数据。结果:与对照组比较,补肾活血方含药血清导致9个已知的microRNA表达呈明显上升(诱导倍数 2)以及4个已知的microRNA表达明显下降(抑制倍数 2)。RT-qPCR结果表明补肾活血方含药血清对miR-140-5p的表达具有明显诱导作用。结论:补肾活血方可能通过调节miR-140-5p靶向ADAMTS-5和MMP-13等基因在维持软骨细胞外基质稳态中发挥作用。     

基于PI3K/Akt通路探讨健脾清热活血方含药血清对人结肠癌SW480细胞增殖、凋亡、周期及P-β-catenin表达的影响

目的:观察健脾清热活血方对人结肠癌SW480细胞凋亡、增殖、周期及P-β-catenin蛋白的影响,探讨该方防治结肠癌可能机制。方法:培养人结肠癌SW480细胞,分别予空白胎牛血清、不同浓度健脾清热活血方含药血清及PI3K阻断剂LY294002干预24 h,MTT法及流式细胞术检测细胞增殖、凋亡及细胞周期,免疫荧光染色法检测P-β-catenin核内转位。结果:健脾清热活血方含药血清组细胞增殖抑制率及凋亡率显著高于空白对照组(P0.05);同时S期细胞比例显著升高、G1期细胞比例显著降低(P0.05)。健脾清热活血方含药血清组及LY294002组细胞P-β-catenin以膜表达为主,而空白对照组P-β-catenin以膜表达缺失及核内表达增加为主。结论:健脾清热活血方可能通过调控P-β-catenin核内转录,阻滞SW480细胞周期于G1期,诱导细胞凋亡,抑制细胞增殖,从而发挥防治结肠癌的效用。     

益气化瘀补肾方血清对兔关节软骨细胞增殖与Caspase3/7酶活性的影响

目的观察益气化瘀补肾方含药血清对体外培养的兔关节软骨细胞增殖与Caspase3/7酶活性的影响。方法取兔的膝关节软骨,将软骨细胞分离传代后,取第三代细胞,用10μg/L的IL-1β诱导正常软骨细胞退变,制备益气化瘀补肾方含药血清作为干预措施。益气化瘀补肾方组分别加入IL-1β及不同溶度（5%,10%,20%）益气化瘀补肾方含药血清培养液,对照组分别加入IL-1β及不同溶度（5%,10%,20%）空白血清培养液,分别培养24h、48h后,采用MTT比色法检测软骨细胞增殖。另取对数生长期第三代软骨细胞分为4组：正常软骨细胞＋20%空白血清;正常软骨细胞＋20%益气化瘀补肾方含药血清;IL-1β诱导软骨细胞＋20%空白血清;IL-1β诱导软骨细胞＋20%益气化瘀补肾方含药血清。每组6个复孔,每孔100μl,各组分别用相应的血清培养24h、48h后进行检测,采用Caspase3/7试剂盒检测各组软骨细胞的Caspase3/7酶活性变化情况。结果不同浓度的益气化瘀补肾方血清均能拮抗IL-1β抑制软骨细胞增殖;与正常软骨细胞＋20%空白血清组比较,IL-1β诱导软骨细胞＋20%空白血清组Caspase3/7酶活性升高,差异有统计学意义（P〈0.05）;与IL-1β诱导软骨细胞＋20%空白血清组比较,IL-1β诱导软骨细胞＋20%益气化瘀补肾方血清组Caspase3/7酶活性降低,差异有统计学意义（P〈0.05）;正常软骨细胞＋20%益气化瘀补肾方血清组的Caspase3/7酶活性与正常软骨细胞＋20%空白血清组和IL-1β诱导软骨细胞＋20%益气化瘀补肾方血清组差异无统计学意义（P〉0.05）。结论益气化瘀补肾方血清能拮抗IL-1β抑制软骨细胞增殖,下调软骨细胞Caspase3/7酶活性,从而抑制软骨细胞的凋亡。     

补肾方含药血清干预大鼠椎间盘软骨细胞miRNA的差异表达

目的筛选补肾方含药血清干预大鼠椎间盘软骨细胞后差异表达的miRNA,为补肾方治疗颈椎病提供可供选择的目标miRNA,以探讨其通过调控靶基因表达发挥治疗效应的机制。方法原代培养的大鼠椎间盘软骨细胞经Ⅱ型胶原酶免疫荧光染色和甲苯胺蓝染色鉴定后,分别用补肾方含药血清、空白血清干预椎间盘软骨细胞,在给定时间点收获细胞,抽提纯化总RNA,行miRNA芯片检测,通过芯片差异性分析,挑选差异表达4倍以上的miRNA行定量聚合酶链式反应(PCR)验证。结果二次酶消化法可简便高效培养大量原代椎间盘软骨细胞,所培养细胞具有典型的椎间盘软骨细胞形态和功能,Ⅱ型胶原酶免疫荧光染色和甲苯胺蓝染色均为阳性。补肾方含药血清干预组芯片数据分别与相应时间点的空白血清组芯片数据行组间比较后再行组内比较,与含药血清干预椎间盘软骨细胞1 d相比,干预3 d的共有121个2倍以上表达差异的miRNA,其中上调的53个,下调的68个。差异表达4倍以上的miRNA定量PCR结果与芯片数据一致。结论补肾方含药血清干预椎间盘软骨细胞获得了一套较为特异的miRNA,初步预测上调的miRNA可能通过靶向Opn、Col、Bcl212、Vdr、IGF-I、Mmp-13等基因在椎间盘营养代谢相关信号通路中发挥作用。     

Klf4抑制Wnt/β-catenin信号通路调控软骨细胞增殖的研究

目的探讨Klf4基因对大鼠软骨细胞增殖影响及相关机制。方法从出生24 h SD幼鼠的股骨头提取软骨细胞,细胞免疫荧光鉴定Col2a1和Sox9基因的表达。转染慢病毒载体PCDH-GFP-Klf4和辅助质粒PSPAX2及PMD2.0G至293ft细胞中产生慢病毒,48 h后收集病毒上清,用其感染大鼠软骨细胞作为Klf4组,用PCDH-GFP慢病毒感染细胞作为对照组。采用CCK8法检测2组细胞生长增殖变化;采用Western blot方法,分别检测2组细胞中Klf4基因表达、增殖相关基因PCNA和CyclinD1蛋白表达、Wnt/β-catenin信号通路上下游基因表达情况。结果原代培养软骨细胞均强表达Col2a1和Sox9基因。慢病毒PCDH-GFP-Klf4和PCDH-GFP成功感染软骨细胞,Klf4基因在软骨细胞过表达。Klf4组软骨细胞生长明显受到抑制,PCNA和CyclinD1蛋白表达和Wnt/β-catenin信号通路相关基因表达均明显下调。结论过表达Klf4基因可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路相关分子的表达而抑制软骨细胞增殖。     

续骨补肾方含药血清对成骨细胞增殖及骨形成蛋白-2,Ⅰ型胶原表达的影响

目的:探究续骨补肾方含药血清在骨折愈合过程中对成骨细胞增殖及BMP-2,Ⅰ型胶原mRNA表达的影响,进一步揭示其促进骨折愈合的具体机制,为临床推广提供实验依据。方法:分离培养大鼠成骨细胞并进行鉴定,传代备用并制备15%含药血清并分组(高、中、低剂量3个含药血清组和生理盐水组)+DMEM培养基;MTT法观察各组对成骨细胞增殖的影响;RT-PCR检测成骨细胞的Ⅰ型胶原、BMP-2 mRNA表达。结果:续骨补肾方含药血清组在24 h,48 h,72 h均可促进成骨细胞增殖,且在24 h低剂量组促进成骨细胞增殖作用最强;在72 h时,中剂量组促进成骨细胞增殖作用最强,差异有统计学意义。续骨补肾方含药血清各剂量组均可上调BMP-2,Ⅰ型胶原mRNA的表达(P0.05),且低剂量组作用最强。结论:续骨补肾方可促进成骨细胞增殖,增加BMP-2,Ⅰ型胶原mRNA的表达,促进骨折愈合,且低剂量是最佳剂量。     

自拟益气化瘀补肾方对膝骨关节炎小鼠β-catenin信号通路的影响

目的研究自拟益气化瘀补肾方对β-catenin信号通路的影响及其治疗膝骨关节炎的作用机制。方法通过改良Hulth法切开小鼠右膝部内侧皮肤,切断内侧副韧带,切除内侧半月板,并切断前交叉韧带,造成小鼠膝骨关节炎模型,分为模型组和自拟益气化瘀补肾方组。假手术组单纯切开小鼠右膝部内侧皮肤。造模2个月后给予自拟益气化瘀补肾方灌胃,治疗2个月。采用Micro-CT扫描小鼠膝关节,ABH/OG染色观察小鼠膝关节软骨细胞变化,免疫组化染色观察小鼠膝关节β-catenin、MMP-13、Col X表达,RT-PCR检测Col X、MMP-9、MMP-13和OC基因表达。结果 (1)Micro-CT检测发现,与假手术组比较,模型组膝关节周围骨赘形成增加,自拟益气化瘀补肾方组膝关节周围骨赘形成少于模型组。(2)ABH/OG染色发现,假手术组关节软骨表面光滑,表浅层、移行层、放射层和钙化层4层结构清晰可辨,软骨细胞呈柱状排列,无软骨细胞巢聚;模型组关节软骨组织表浅层细胞数量减少,移行层和放射层见到大量软骨细胞巢聚,潮线前移,出现双潮线;自拟益气化瘀补肾方组关节软骨组织形态较模型组明显改善。(3)β-catenin免疫组化染色结果显示,与假手术组比较,模型组关节软骨细胞β-catenin蛋白表达显著增加,自拟益气化瘀补肾方组关节软骨细胞β-catenin表达比模型组显著减少(P0.05);免疫组化染色结果还发现,与假手术组比较,模型组关节软骨组织Col X、MMP-13蛋白表达显著增加(P0.05)。与模型组比较,自拟益气化瘀补肾方组关节软骨组织Col X、MMP-13蛋白表达显著减少(P0.05)。(4)RT-PCR反应检测结果显示,与假手术组比较,模型组关节软骨组织Col X、MMP-9、MMP-13和OC基因表达显著增加(P0.05)。与模型组比较,自拟益气化瘀补肾方组关节软骨组织中Col X、MMP-9、MMP-13和OC基因表达显著减少(P0.05)。结论自拟益气化瘀补肾方可以治疗膝骨关节炎,其作用机制可能是通过降低β-catenin的表达而实现。     

清肝活血方对肝星状细胞TGF-β1表达及细胞内信号传递的影响

目的:研究清肝活血方抗肝纤维化疗效及其机理。方法:以不同浓度清肝活血方含药血清干预HSC-T6细胞株,RT-PCR法检测TGF-β1、Smad3、Smad7mRNA表达,免疫细胞化学法检测TGF-β1蛋白的表达。结果:清肝活血方含药血清能抑制HSC-T6细胞株的增殖,下调TGF-β1、Smad3mRNA的表达以及TGF-β1蛋白表达水平,上调Smad7mRNA的表达,TGF-β1表达变化与Smad3表达改变的趋势一致。不同浓度的清肝活血方含药血清作用强度虽有一定的量效关系趋势,但无统计学差异。结论:清肝活血方的抗肝纤维化作用可能是通过非特异性作用于TGF-β1和Smad,从而抑制HSC的增殖。     

消炎散中活血化瘀药含药血清对成软骨诱导下兔骨髓间充质干细胞Wnt/β-catenin信号通路及SOX9影响的研究

目的探讨消炎散中活血化瘀药含药血清对成软骨诱导下兔间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)Wnt/β-catenin信号通路及SOX9的影响。方法提取并培养MSCs,先分为成软骨细胞诱导剂组和未成软骨细胞诱导剂组,每组又分为不加血清组、含药血清组、空白血清组、sFRP-3组。采用流式细胞仪检测细胞周期情况,运用RT-PCR、Western Blotting检测Wnt信号通路相关Wnt5a、β-catenin,SOX9基因及蛋白水平表达的变化。结果RT-PCR及Western Blotting显示,活血化瘀含药血清抑制诱导前MSCs表达Wnt5a、β-catenin mRNA和蛋白,促进SOX9 mRNA和蛋白表达,而对诱导后的MSCs促进Wnt5a、β-catenin mRNA和蛋白表达,抑制SOX9 mRNA和蛋白表达。结论消炎散中活血化瘀药含药血清可通过作用Wnt/β-catenin信号通路,改变SOX9的表达水平,进而影响MSCs的软骨分化。     

珍珠母超微粉蛋白及寡肽对小鼠镇静安眠作用比较

目的比较珍珠母超微粉蛋白、寡肽对小鼠镇静安眠作用。方法利用PCPA制造小鼠失眠模型,观察小鼠的自主活动情况,ELISA法测小鼠血中ATCH含量并计算脑及脑系数。结果阳性对照组、寡肽组小鼠的自主活动次数显著降低,小鼠血中ACTH的含量增加,但脑干系数无影响。结论超微粉寡肽类成分(MCP)镇静安眠活性最强,为镇静安眠主要活性部位,调节ACTH可能是其镇静安眠机制。     

丁香苦苷不同给药途径的药物动力学研究

目的:研究并比较丁香苦苷单体两种给药途径在家兔体内的药物动力学过程,考察丁香苦苷单体口服后的绝对生物利用度。方法:家兔静脉注射丁香苦苷注射液和灌胃给予丁香苦苷水溶液,采集血样,固相萃取小柱活化方法处理血浆后高效液相色谱法测定丁香苦苷血浆浓度,采用药动学软件3P97进行数据处理,确定药动学参数。结果:丁香苦苷静脉给药后在体内符合二室模型分布,其主要药动学参数分别如下:T1/2α为2.41min,T1/2β为15.38min。灌胃给药后丁香苦苷的药动学行为符合一级吸收二室模型,Cmax为17.91min,T1/2(α)为9.642min,T1/2(β)31.748min。绝对生物利用度为35.9%。结论:丁香苦苷单体经口服和静脉两种给药途径给药后,吸收和消除均较快。     

《老老恒言》论老年养生

简要论述了《老老恒言》中有关老年养生的思想和方法 ,认为饮食以调理脾胃为要 ,应注意饮食有节、五味调和、清淡为补 ;起居以养静为要 ,应注意调顺四时、起居有常、静养与导引相结合 ;养性以安命为要 ,应注意清心寡欲、修心养性     

中药产业竞争力提升战略研究

本文运用了竞争力理论与战略理论，分析了中药产业竞争力提升的环境与条件，提出了提升中药产业竞争力的三大战略目标、三大总体战略、四条战略举措及三个实施阶段与重点任务。     

病性变化和转化的哲理数学原理

病性的变化和转化以及疾病的传变是中医病理学的2个核心问题。它们可分别从阴阳五行数学的公理1和公理2、3得到圆满的解释。病性变化,其症结在于主导属性明晰度的大小发生变化;病性转化,其症结则在于主导属性明晰度的正负号发生变化。     

胃脘痛证候量化诊断的探讨

目的:探讨胃脘痛证候的量化诊断规律。方法:以因子分析方法对808例胃脘痛患者的临床四诊信息进行分析。结果:因子分析从胃脘痛临床症状中提取12个因子,分别代表脾胃湿热、脾胃虚寒、肝胃气滞、气阴两虚、胃热炽盛、胃阴亏虚、肝胃郁热、脾胃气虚等8个证候,同时对各个证候进行量化。结论:因子分析所得的胃脘痛的常见证候分类及量化诊断为临床辨证提供客观依据。     

中国中医科学院西苑医院肿瘤科

本文较详细地介绍了中国中医科学院西苑医院肿瘤科成立以来,确立了以中医综合治疗结、直肠癌为主攻方向,不断探索具体治疗方法和建立系统评价体系的成长历程。他们作为国家中医药管理局"十一五"结直肠癌专病建设组长单位,牵头联合全国26家医院以及挪威国家补充替代医学研究中心,进行的中医结直肠癌的诊疗方案的验证工作,牵头制定《结直肠癌中西医结合诊疗方案》,以及探索建立辐射社区医院的结直肠癌中医三级防治网络等工作,得到国内外医学界的广泛认可,具有典范借鉴意义。     

对中医学科建设与学科带头人培养的思考

通过中医学术发展的历史沿革回顾,提出了中医药学科建设的总体构思,指出要发展一个大的一级学科,首先要有教育,这是发展学科的基础;其次是科研来提高教育水平,并指导临床;再次是临床;三者缺一不可。同时提出了学科带头人应具备的条件及如何培养学科带头人。     

中医方剂学考试改革的探索与实践

传统的闭卷考试不能很好地反映方剂学教学的效果,因此,我们试行了以多种形式相结合的考试改革,考试成绩由笔试、机试、平时3个方面组成。结果大大提高了学生分析问题和解决问题的能力,激发了学生学习的兴趣,提高了教师教学水平,带动了教学改革和教学研究的全面进行。     

咳嗽六经辨治初探

六经皆有咳嗽,寒热皆可致咳,治疗上不可拘于一理一方,当穷究其机,辨证施治,方能事半功倍。以六经辨证为纲,分析《伤寒杂病论》对咳嗽的有关论述,以期提高咳嗽的临床疗效。