RNA干扰沉默神经干细胞Nogo-66受体基因阻断Nogo-66抑制神经突生长作用的研究

目的检测Nogo-66是否对大鼠脊髓来源神经干细胞分化形成的神经元具有神经突生长抑制作用,以及其抑制作用是否可以通过沉默Nogo-66受体（Nogo-66 receptor,NgR）基因的方法进行阻断。方法体外培养大鼠脊髓来源神经干细胞,经小分子干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）转染以沉默NgR基因表达,用免疫荧光法和Western blot检测神经干细胞在转染前后NgR基因的表达。取神经干细胞分为四组,均在含10%胎牛血清的培养基中分化。对照组不加干预因素;Nogo-P4组在分化过程中加入Nogo-66的活性片段Nogo-P4;siRNA组神经干细胞经siRNA转染使NgR基因表达沉默后开始分化;siRNA加Nogo-P4组神经干细胞经siRNA转染后在含有10%胎牛血清和Nogo-P4的培养基中分化。免疫荧光法标记分化形成的神经元,测量神经突长度,比较各组神经突长度的变化。结果悬浮培养的细胞形成典型的神经球,经免疫荧光检测Nestin表达阳性。加入10%胎牛血清分化1周后,可观察到神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白质和髓鞘碱性蛋白标记阳性的细胞。siRNA转染后24h,大部分神经干细胞NgR基因染色转为阴性,Western blot检测神经干细胞NgR基因表达显著降低,NgR基因阻断效率为90.35%±3.10%。神经干细胞分化第3天形成的神经元神经突长度在对照组为97.80±6.97μm,Nogo-P4组为80.54±6.75μm,siRNA组为92.14±7.27μm,siRNA加Nogo-P4组为94.01±8.37μm。Nogo-P4组与其他各组比较差异有统计学意义（P〈0.01）,对照组、siRNA组和siRNA加Nogo-P4组间比较差异无统计学意义（P〉0.05）。结论Nogo-66对神经干细胞分化形成的神经元有神经突生长抑制作用,可以通过RNA干扰技术使神经干细胞NgR基因表达沉默,并阻断Nogo-66抑制神经突生长的作用。     

RNA干扰抑制整合素β1在人表皮干细胞中的表达

目的观察整合素β1对人表皮干细胞（KSC）增殖与分化的影响。方法选择人整合素β1RNA干扰靶点特异性的寡核苷酸，连接到小干扰RNA（siRNA）表达质粒pSilencer3.1／H1上，将其转染到KSC中，并根据转染的方式将KSC分为非转染、转染空载体、转染si整合素β1-1、转染si整合素β1-2、转染siNegative5个部分。通过蛋白质印迹法检测各部分KSC整合素β1蛋白的表达水平，并筛选出最有效的阳性载体，将其命名为si整合素β1进行后续实验；通过逆转录聚合酶链反应检测各部分KSC整合素β1mRNA的表达水平，上述检测均重复测定5次。结果非转染、转染空载体的KSC不能抑制整合素β1蛋白的表达；转染si整合素β1-1、si整合素β1-2的KSC能够在蛋白水平抑制整合素β1的表达，并且后者效果强于前者，抑制效率达到60％-70％，将其命名为si整合素β1；si整合素β1使KSC中整合素β1 mRNA水平明显下降，抑制效率约达70％。结论重组质粒转染KSC后可下调整合素β1 mRNA及其蛋白的表达。     

RNA干扰沉默酸性鞘磷脂酶1基因对人成纤维细胞凋亡的影响

目的为研发保护女性生殖细胞的小分子干扰RNA（siRNA）类药物,以人包皮成纤维细胞（HFF）为模型,检测靶向凋亡关键基因酸性鞘磷脂酶1（SMPD1）基因的siRNA对HFF凋亡的抑制作用。方法设计合成三对靶向SMPDI基因的siRNA并体外转染HFF细胞,转染后48h用丝裂霉素（MMC）诱导细胞凋亡。荧光定量逆转录-聚合酶链反应（O-RT-PCR）法及免疫印迹（Western blot）检测siRNA转染后SMPD1在mRNA水平和蛋白水平的变化,Annexin V—PI双染检测细胞凋亡率。用脂质体（lipofectamine 2000）和无干扰siRNA（NT siRNA）作为对照。结果siRNA1、2、3对SMPD1基因mRNA的抑制效率分别为（67．0±9．0）％、0％、（45．0±2．1）％,以siRNA1最高,蛋白水平的抑制也呈现相同变化。siR-NA1组细胞凋亡率为15．2％,明显低于MMC组（26．3％）。结论靶向SMPD1的siRNA可以抑制人包皮成纤维细胞凋亡。     

小干扰RNA抑制人端粒酶逆转录酶基因对胃癌细胞增殖的影响

目的 应用小干扰RNA(siRNA)技术特异性抑制人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因在胃癌SGC7901细胞中的表达,观察其对细胞增殖的影响.方法 hTERT基因的RNA干扰表达重组体用脂质体介导方法转染SGC7901细胞.荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测hTERT基因表达.TRAP-PCR法检测端粒酶活性、噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖.结果 SGC7901细胞转染前后hTERT基因的表达强度分别为:转染pU6组平均表达量为6.5×105拷贝/μg RNA;转染pU6-hTERT-siRNA Ⅰ组平均表达量为4.1 × 104拷贝/μg RNA;转染pU6-hTERT-siRNAⅡ组平均表达量为5.4×104拷贝/μg RNA.转染pU6组与其余两组P值<0.01;转染pU6-hTERT-siRNA Ⅰ组和转染pU6-hTERT-siRNAⅡ组P值>0.05.端粒酶活性下降,细胞生长速度明显减慢.结论 小干扰RNA能有效抑制SGC7901细胞中hTERT基因表达,hTERT基因表达下调影响SGC7901细胞增殖.     

RNA干扰沉默PPARγ基因对小鼠骨髓基质干细胞成脂与成骨分化潜能的影响

目的 观察RNA干扰沉默PPAγ基因对小鼠骨髓基质干细胞成脂与成骨分化潜能的影响.方法 针对小鼠PPARγ基因,构建短发夹RNA(shRNA)真核表达载体并转染小鼠骨髓基质干细胞,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫印迹沉淀(Wetem-blot)观察PPARγ的基因沉默效果.分别在成脂及成骨诱导培养基条件下,诱导培养14 d,采用油红O(Oil Red O)染色及茜素红染色鉴定分化结果.并与空载体转染组和未转染组比较.结果 测序证实成功构建PPARγ的shRNA真核表达载体pSilencer-shPPARγ,转染小鼠骨髓基质干细胞后,PPARγ基因表达在转录水平和翻译水平都显著受到抑制,与两对照组相比,抑制率分别为92%和90%.成脂及成骨诱导分化后,shPPARγ转染组小鼠骨髓基质干细胞的成骨分化率为56.46%±1.92%,明显高于pSilencer-neo空载体转染组和未转染组(P<0.01);成脂分化率为19.24%±0.98%,显著低于pSilencer-shPPARγ-neo空载体转染组和未转染组(P<0.01).结论 RNA干扰沉默PPARγ基因后,可增强小鼠骨髓基质干细胞的成骨分化潜能,抑制其成脂分化潜能.     

RNA干扰技术对大肠癌细胞人端粒酶逆转录酶基因的抑制作用

目的 观察RNA干扰对大肠癌细胞中人端粒酶逆转录酶基因(hTERT gene)的抑制效应.方法 大肠癌细胞株HT-29分为Control组、N-hTERT组、Lipofectamine组和sihTERT组;将靶向于hTERT基因的小干扰RNA,转染大肠癌细胞;分别检测大肠癌细胞转染前后的端粒酶活性,hTERTmRNA和蛋白水平,细胞生长增殖和凋亡情况.结果 sihTERT转染大肠癌细胞效率为60%;sihTERT组的端粒酶活性值、hTERT mRNA表达、hTERT蛋白表达、细胞凋亡率分别为0.73±0.14、0.47±0.08、0.37±0.07、49.5%,sihTERT组与其他三组比较差异有统计学意义(P<0.01).结论 靶向于hTERT的siRNA能特异性沉默大肠癌细胞hTERT基因,下调hTERT基因mRNA及蛋白表达水平,降低端粒酶活性,抑制癌细胞生长增殖从而促进大肠癌细胞凋亡.     

人胚神经干细胞移植对大鼠脑液压冲击伤的影响

目的　通过人胚神经干细胞 (HNSCs)移植大鼠脑液压冲击伤 (FPI)探讨HNSCs对脑损伤修复的影响。方法　体外培养HNSCs并用 5 溴脱氧尿嘧啶 (BrdU)标记 ,液压冲击大鼠右侧大脑皮质运动感觉区制作脑外伤模型 ,脑外伤后 2 4h移植HNSCs ,分别于脑外伤前、脑外伤后 2 4h、4周行神经运动行为学评分 (NMFE)和检测左下肢的短潜伏期体感诱发电位 (SLSEP)及免疫组织化学染色检测BrdU、巢蛋白 (nestin)、微管相关蛋白 2 (MAP2 )、胶质纤维酸性蛋白 (GFAP)和半乳糖脑苷 (GalC)蛋白表达。结果　大鼠液压冲击伤后 2 4h ,左下肢功能障碍明显 ,运动评分14 .3 75 0± 2 .13 3 9,SLSEP潜伏期 3 0 .463± 4.64 0与损伤前相比均差异有显著性 (P <0 .0 1) ,但移植HNSCs组与对照组差异无显著性 ;HNSCs移植后 1周 ,BrdU阳性细胞从移植区域向周围扩散 ,邻片nestin、MAP2和GFAP均为阳性 ,但MAP2阳性细胞较多 ;HNSCs移植后 4周 ,未见nestin阳性细胞 ,液压冲击区域聚集GFAP/BrdU双阳性细胞和MAP2 /BrdU双阳性细胞 ,且GFAP/BrdU阳性细胞较多。结论　HNSCs移植对大鼠脑液压冲击伤的功能恢复无影响 ,但早期HNSCs多数分化为神经细胞 ,晚期多数分化为神经胶质细胞。     

脂肪来源干细胞与延缓衰老

1 概说:人类的寿命延年益寿、长生不老,自古有之,人皆求之;爱美之心,人皆有之,健康年轻,美丽得之.这是人类永远追求的目标,首先要清楚人类生命发生、发展的本质和规律,这是一种生物学现象.儿时希望早点长大,成人后希望永葆青春,老时希望长生不老是人类的普遍规律.     

神经干细胞的自发永生化

目的 观察培养达24个月的神经干细胞(NSC)是否会发生永生化和恶变.方法 培养流产胎儿皮层来源的NSC.对培养超过24个月的NSC,分析其核型,检测其自我更新、增殖、衰老以及移植后的致瘤性等.检测其Bmi-1-p16INK4a/p14ARF基因通路的改变.结果 体外培养超过24个月的NSC自我更新旺盛,克隆形成率(14.89±4.75)%,显著高于正常培养8周NSC的(8.04±2.07)%;生长速度快,表现为传代1周后的新生神经球的直径为(85.98±30.24)μm,显著高于体外培养8周NSC的(15.97±9.97)μm.此外,培养超过24个月的NSC衰老细胞为(5.96±2.81)%,远低于正常培养8周NSC的(78.14±8.99)%;而且染色体数目异常,这些结果可以确定其发生了永生化.裸鼠移植未发现致瘤性,所以该细胞未发生恶变.此2株细胞中Bmi-1、p16INK4a、p14ARF基因均缺失.结论 体外长期培养的人类皮层神经干细胞能够自发永生化,表现为不进入衰老状态并不断增殖.其增殖不依赖于Bmi-1基因,而其不衰老状态可能和p16INK4a、p14ARF基因缺失有关.     

Bmi-1介导的甲强龙对脊髓源性神经干细胞增殖能力的影响

目的 观察甲强龙对脊髓源性神经干细胞增殖能力的影响,并探讨其机制.方法 体外培养及鉴定C57BL/6小鼠脊髓来源的神经干细胞分为甲强龙组与对照组,通过细胞生长曲线研究甲强龙对其增殖能力的影响,并利用半定量聚合酶链反应(PCR)法及Western blot法观察两组神经干细胞24、48、72 h自我更新重要调节因子Bmi-1、Numb、Notch表达的差异.结果 细胞生长曲线测定第7天甲强龙组神经干细胞计数为12.4×104,而对照组为19.3×104,相差6.9×104;在24、48、72 h甲强龙组与对照组Bmi-1 mRNA表达灰度比值分别为0.52±0.05、0.21±0.02、0.16±0.05,而Numb,Notch mRNA表达无明显变化,Western blot法测定甲强龙组与对照组Bmi.1蛋白表达的灰度比分别为0.63±0.07、0.33±0.04、0.19±0.06.结论 甲强龙抑制脊髓源性神经干细胞增殖通过Bmi-1介导.     

从人胚胎胰腺中分离获得巢蛋白表达阳性的细胞

目的 探讨从人胚胎胰腺组织分离巢蛋白（Nestin)阳性细胞并进行体外传代培养的方法。方法 取引产的16、18、20周人胚胎胰腺组织，分离胰岛样细胞簇（Ialet-like cell clusters,ICCs），进行体外培养。用免疫组织化学和逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测巢蛋白、胰十二指肠同源盒基因-1（Pancreatic and duodenal bomeobox gene-1,PDX-1/IPF-1)以及胰岛内分泌激素胰岛素和胰升糖素（Glucagon)的表达。结果 ICCs经体外培养可获得巢蛋白表达阳性细胞，这种细胞可进一步形成球状细胞簇，除有巢蛋白阳性细胞外，还有PDX-1，胰岛素和胰升糖素表达阳性的细胞。并且细胞可连续传代，结论 从人胚胎胰腺组织中可分离获得巢蛋白表达阳性细胞，这种细胞可在体外增殖并有向胰岛内分泌细胞分化的能力。     

低温冻存对胚胎大鼠神经干细胞生物学特性的影响

目的 研究不同冻存液对胚胎大鼠神经干细胞的保护作用及低温冻存对神经干细胞增殖及分化潜能的影响。方法 分别应用冻存液Ⅰ和冻存液Ⅱ对源于胚胎大鼠的神经干细胞球进行冷冻,于复苏后进行传代培养,并鉴定其增殖和分化能力。结果 复苏后的神经干细胞可以多次传代,冻存神经干细胞的克隆增殖率为(36.80±3.81)％,未冻存者为(38.15±4.80)％,两者相比差异无显著性(P>0.05)。冻存液Ⅰ和冻存液Ⅱ保存的神经干细胞分化为神经元的比例分别为(7.61±0.74)％和(12.76±2.53)％(P>0.05);分化为少突胶质细胞的比例分别为(0.90±0.50)％和(2.18±0.33)％(P>0.05);分化为星形细胞的比例为(47.67±2.10)％和(35.38±3.14)％(P<0.05)。结论 冻存的胚胎大鼠神经干细胞复苏后仍具有活跃的增殖和分化潜能,含10％血清的冻存液可以促使神经干细胞向星形细胞方向转化。     

慢病毒介导的RNA干扰技术构建人胚椎间盘髓核上皮膜蛋白-1基因低表达细胞模型

目的:构建人胚椎间盘髓核上皮膜蛋白-1基因低表达细胞模型,为进一步研究EMP-1在椎间盘退变中的作用机制提供理想的研究平台。方法:利用慢病毒载体介导的小发夹状RNA(small hairpin RNA,shRNA)转入人胚胎肾细胞(293FT)包装慢病毒,48h后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况,72h后收集病毒上清并感染人胚椎间盘髓核细胞,Western blot、RT-PCR鉴定基因干扰效果,凝胶成像分析软件对条带显色程度进行分析,得到EMP-1/GAPDH的平均值。结果:重组慢病毒滴度测定约为1×107U/ml,感染靶细胞后得到EMP-1基因低表达细胞模型,EMP-1mRNA表达水平比正常细胞下降了50%。半定量RT-PCR结果显示EMP1/GAPDH的平均值由0.46±0.03降至0.32±0.01,Westernblot结果显示EMP1/GAPDH的平均值由0.50±0.01降至0.25±0.01。结论:通过慢病毒包装技术,成功构建人胚椎间盘髓核上皮膜蛋白-1基因低表达细胞模型。     

人胚胎神经干细胞的分离培养及鉴定研究

目的：研究人胚胎神经干细胞的培养条件及体外分化情况。方法：从12周龄人胚胎脑皮质分离细胞，采用无血清培养技术，协同应用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(ECF)和重组人白血病抑制因子(rhLIF)进行培养；5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记检测细胞的增殖能力，间接免疫荧光化学法检测细胞的分化情况。结果：培养得到的大量半悬浮生长的神经干细胞球能够传代培养；BrdU标记阳性，可诱导分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。结论：人胚胎脑皮质分离细胞培养得到的细胞群具有神经干细胞的基本特征，可进一步用于基础及临床研究。     

端粒酶在大鼠胚胎神经干细胞的表达及其生物学特性

目的观察Wistar大鼠胚胎神经干细胞及其分化细胞的端粒酶活性，探讨神经干细胞维持其生物学特性的分子生物学基础及神经干细胞分化调控的内在机制。方法显微镜下分离大鼠胚胎室管膜下区细胞，在含生长因子的神经干细胞完全培养液中培养形成神经干细胞，然后在不含生长因子而含10％血清培养液中分化14～16d，应用改良的端粒重复序列扩增法(TRAP)研究神经干细胞及其分化细胞的端粒酶活性。结果Wistar大鼠胚胎神经干细胞表达较强的端粒酶活性，而分化后的细胞则不再表达端粒酶活性。结论端粒酶活性的改变可能是胚胎神经干细胞诱导分化的机制。随着端粒酶活性的逐渐下降，胚胎神经干细胞随之分化为具有一定生物学特性的细胞。