登革2型病毒ZS01/01株E蛋白在真核细胞中的分泌表达研究

目的 对登革2型病毒(DENV-2)ZS01/01株E蛋白在哺乳动物细胞及昆虫细胞中的分泌表达进行研究.方法 RT-PCR扩增DENV-2 prM/E基因,通过融合PCR在prM基因前添加来自乙型脑炎病毒的信号肽序列,并将E基因羧基末端20%区域缺失或替换为乙型脑炎病毒SA14-14-2株E基因相应序列,将上述基因元件分别克隆入哺乳动物细胞表达载体pcDNA5/FRT及昆虫细胞表达载体pAcUW51-M中,将重组质粒转染293T细胞或S19细胞,利用间接免疫荧光(Immunofluoreseence assay,IFA)及Western Blot检测E蛋白的表达与分泌.结果 各重组质粒分别转染293T细胞或Sf9细胞后,E蛋白在细胞内均有效表达,而仅有携带乙脑信号肽且缺失或替换E基因羧基末端20%区域的重组质粒转染293T细胞后,上清中可检测到明显的E蛋白分泌.结论 信号肽及E基因羧基末端20%区域对登革病毒E蛋白的分泌至关重要,宿主细胞对其亦有一定影响.     

登革2型病毒ZSO1／01株E蛋白在真核细胞中的分泌表达研究

目的对登革2型病毒（DENV-2）ZSO1／01株E蛋白在哺乳动物细胞及昆虫细胞中的分泌表达进行研究。方法RT．PCR扩增DENV-2prM／E基因,通过融合PCR在prM基因前添加来自乙型脑炎病毒的信号肽序列,并将E基因羧基末端20％区域缺失或替换为乙型脑炎病毒SA14-2株E基因相应序列,将上述基因元件分别克隆人哺乳动物细胞表达载体pcDNA5／FRT及昆虫细胞表达载体pAcUW51-M中,将重组质粒转染293T细胞或Sf9细胞,利用间接免疫荧光（Immunofluoreseence assay,IFA）及Western Blot检测E蛋白的表达与分泌。结果各重组质粒分别转染293T细胞或Sit）细胞后,E蛋白在细胞内均有效表达,而仅有携带乙脑信号肽且缺失或替换E基因羧基末端20％区域的重组质粒转染293T细胞后,上清中可检测到明显的E蛋白分泌。结论信号肽及E基因羧基末端20％区域对登革病毒E蛋白的分泌至关重要,宿主细胞对其亦有一定影响。     

登革Ⅰ型病毒E蛋白在293T细胞中的分泌表达

目的 分泌表达登革Ⅰ型病毒prM/E基因,为研究该蛋白的免疫学功能和特性奠定基础.方法 用RT-PCR法获得登革Ⅰ型病毒广州分离株全长prM/E基因,在prM基因前添加乙型脑炎病毒的信号肽或同时替换E基因羧基末端的20%为乙脑病毒E基因相应的部分,分别将其克隆入真核表达载体pcDNAS/FRT中,获得三种重组质粒DlprME-pc5,D1JsprME-pc5,D1JsprM80E20JE-pc5.用脂质体法分别将重组质粒DNA转入293T细胞,通过免疫荧光、Western印迹检测外源基因在真核细胞中的分泌表达.结果 用免疫荧光法检测到分别转染了三种重组质粒的293T细胞的胞质中均有登革Ⅰ型病毒蛋白的表达.Western印迹检测转染了D1prME-pc5重组质粒的293T细胞上清中没有特异蛋白条带,转染了经基因改造的重组质粒D1JsprME-pc5和D1JsprM80E20JE-pc5的细胞上清中均存在登革Ⅰ型病毒的特异蛋白条带.结论 转染了三种重组质粒的293T细胞均可表达登革Ⅰ型病毒prM/E蛋白,只有在prM基因前添加了信号肽的重组质粒转染后蛋白才获得分泌表达.     

蜱传脑炎病毒prM-E蛋白的真核表达及其在荧光素酶免疫共沉淀技术中的应用?

为了探索一种新型的血清学技术的荧光素酶免疫共沉淀技术（LIPS）,本研究利用真核表达系统制备了蜱传脑炎病毒结构蛋白prM?E与荧光素酶融合蛋白,并评价了其在LIPS系统中的检测效果。首先以蜱传脑炎病毒RNA为模板,采用RT?PCR技术扩增prM?E抗原基因,连接到pNLF1?secN质粒上构建真核表达载体pNLF?prM?E,使prM?E蛋白与荧光素酶串联融合表达,并将该质粒转染到Cos7细胞中。结果显示,转染重组质粒pNLF?prM?E的细胞上清中可检测到荧光素酶的高表达;进而用间接免疫荧光试验（ IFA）检测到转染的细胞与蜱传脑炎病毒抗体特异性结合;在此基础上,用LIPS方法对蜱传脑炎病毒感染患者血清进行检测,从20份患者血清中检出19份阳性,7份对照血清均为阴性。结果表明该重组抗原具有良好的特异性和灵敏性,可以用于LIPS系统中的候选检测抗原。     

圣路易斯脑炎病毒样颗粒的真核表达、纯化与鉴定

目的 利用293T细胞表达、纯化圣路易斯脑炎病毒样颗粒（Virus like particles,VLPs）,为研制圣路易斯脑炎病毒免疫诊断试剂奠定基础.方法 构建含圣路易斯脑炎病毒PrM和E基因的重组质粒pcDNA5/FRT-SJME,瞬时转染293T细胞,表达并纯化重组蛋白,通过透射电镜、间接免疫荧光试验、Western-Blot和ELISA对其进行鉴定.结果 表达的重组蛋白形成50 nm的球型颗粒,能与抗圣路易斯脑炎病毒抗体产生特异性反应,与部分黄病毒属阳性血清发生交叉反应.结论 已成功在哺乳动物细胞中表达并纯化了圣路易斯脑炎病毒样颗粒,其具有良好的抗原性和完整的颗粒形态,为进一步研制圣路易斯脑炎病毒感染的免疫诊断试剂奠定了基础.     

登革2型病毒ZS01/01株病毒样颗粒免疫原性研究

目的 研究登革2型病毒（Dengue virus type 2,DENV-2）病毒样颗粒（virus-Like particles,VLPs）的免疫原性.方法 利用已构建的DENV-2 ZS01/01株病毒样颗粒的表达质粒转染293T细胞,对分泌型VLPs进行大量培养并通过蔗糖密度梯度离心法对其进行纯化.纯化的VLPs经Western Blot及透射电镜观察等方法鉴定后免疫BALB/c小鼠.利用ELISA及中和试验等方法对体液免疫反应进行检测,ELISPOT法测定细胞免疫水平.结果 登革2型病毒样颗粒表达质粒转染哺乳动物细胞所得上清经蔗糖密度梯度离心后,电镜下可观察到类似于天然登革病毒的大小在45～55nm之间的病毒样颗粒.体液及细胞免疫检测结果显示登革2型VLPs可以刺激小鼠产生较高水平的登革E蛋白特异性抗体及一定水平的中和抗体,免疫小鼠脾淋巴细胞经体外刺激后IFN-γ水平显著升高.结论 登革2型病毒病毒样颗粒免疫BALB/c小鼠后可引起一定水平的细胞免疫及体液免疫反应,该研究结果为四价登革病毒样颗粒疫苗的研制奠定了基础.     

含HIV-1 Tat基因重组反转录病毒表达载体构建与表达Tat蛋白功能检测

目的 构建含HIV-1 Tat基因重组反转录病毒表达载体及评价表达Tat蛋白的功能。方法 使用HindⅢ将HIV-1 Tatl0l蛋白编码基因从pEN质粒中切出，插入到表达质粒IZRSpBMN-Z中，构建成重组反转录病毒表达质粒IZRS-Tat101。采用磷酸钙转染法将重组质粒LZRS-Tat101转染进含反转录病毒env、gal和pol编码基因的包装细胞phoenix(φNX)中，嘌呤霉素筛选获得稳定细胞系。免疫组化(IHC)染色检查Tat在临时转染和稳定转染φNX细胞中的表达水平。收集临时转染和稳定转染包装细胞分泌的病毒上清，并分别感染293细胞，Western blot检测Tat在293中表达。与此同时，收集感染293细胞培养上清，加入到HL3T1细胞(HeLa-HIV-1-LTR／CAT报告基因)中，共培养72h后收集细胞，提取蛋白作CAT活性检测。结果 ①含Tat101基因重组反转录病毒表达质粒转染包装细胞后，Tat在临时转染φNX中表达水平显著高于在稳定转染中的水平；②临时转染病毒感染293细胞，Tat在感染细胞中得到了表达，且分泌至上清中的Tat蛋白能够激活靶细胞HL3T1中HIV-1的LTR启动子，使得其下游的CAT基因得到表达。结论 重组LZRS-Tat101反转录病毒能够在其感染靶细胞中表达Tat蛋白，且表达蛋白具有转录激活功能。     

PEX慢病毒载体构建及其在293FT细胞中的分泌表达

目的 构建含人MMP-9信号肽-MMP-2-PEX片段的重组慢病毒,并在293FT细胞中分泌表达PEX蛋白.方法 利用RT-PCR、基因重组等技术,构建含MMP-9信号肽-MMP-2-PEX片段的重组慢病毒表达载体pBPLV-signal-PEX,在脂质体介导下与包装质粒(pLP1、pLP2)、包膜质粒(pLP/VSVG)共转染293FT细胞,包装产生慢病毒并进行滴度测定.慢病毒感染2931;3"细胞后,Western印迹法检测293FI"细胞培养上清中PEX的表达.结果 酶切和DNA测序表明慢病毒表达载pBPLV-signal-PEX构建正确,四质粒共转染293FT细胞成功获得慢病毒;慢病毒感染293FT细胞后,在细胞培养卜清中可检测到PEX蛋白的表达.结论 成功构建了含人PEX的重组慢病毒,在体外有效感染293fT细胞并持续分泌表达目的 蛋白,为进一步研究PEX在肿瘤侵袭与转移中的作用提供实验基础.     

登革病毒在白纹伊蚊细胞内免疫的研究

目的 研究白纹伊蚊对登革病毒产生细胞内免疫现象的分子机制。方法 扩增与克隆登革病毒NGC株的前膜蛋白基因prM，将prM基因以3种不同表达形式重组入昆虫表达载体pBh-spEGFP，以3种重组质粒分别转染白纹伊蚊C6／36细胞，测定转染后的细胞对登革病毒感染的免疫效果。结果 构建了包含prM基因的3种昆虫表达载体，Western blot和荧光显微镜观察证明在C6／36细胞中成功表达了prM-EGFP融合蛋白。MTT实验和空斑形成实验反映了C6／36细胞对登革病毒产生了细胞内免疫。结论 3种重组质粒均可诱导细胞内免疫现象，说明无论是否表达prM蛋白，只要有prM基因转录就可引起细胞内免疫现象；prM基因正义和反义转录形式均可诱导细胞内免疫；其形成机制可能是通过RNA干扰作用而产生。     

外源性组织型纤溶酶原激活物信号肽突变体增强蛋白质在哺乳细胞中的表达及分泌

目的 比较不同tPA信号肽突变体对目的蛋白表达和分泌水平的影响,优化并筛选通用性外源信号肽序列.方法 通过定点突变技术将人类组织型纤溶酶原激活物（tPA）的信号肽第22位氨基酸由脯氨酸（P）突变为丙氨酸（tPA22P/A）或甘氨酸（tPA22P/G）,并将突变前后的3种信号肽序列分别插入HIV-1 p24基因的N末端,构建不同的p24蛋白表达载体,这些重组表达载体体外瞬时转染人胚肾HEK293T细胞,转染72 h后,通过SDS-PAGE与western blot检测并比较各组培养上清和细胞中p24蛋白的表达水平.结果 成功构建了3个p24蛋白的真核表达载体P24T.tPA、P24T.tPA22P/A和P24T.tPA22P/G,经序列测定证实基因序列和方向与预期相符;重组载体转染293T细胞72 h后均检测到分泌性p24的表达.与P24T.tPA组相比,P24T.tPA22P/A转染组培养上清中和细胞内p24蛋白表达水平分别提高62%和29%,P24T.tPA22P/G转染组分别提高8%和6%.结论 tPA信号肽22位由脯氨酸突变为丙氨酸或甘氨酸,这就提高了目的蛋白的表达和分泌水平,为优化外源蛋白在哺乳细胞中的表达和分泌提供了实验基础.     

乙型脑炎病毒prM蛋白单克隆抗体的制备

目的 克隆日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)前膜蛋白(prM)编码基因,原核表达、纯化prM蛋白,以纯化产物为免疫原制备单克隆抗体(mAb);方法从感染JEV病毒的鼠脑中克隆编码JEV prM蛋白的基因并将其克隆入原核表达载体pET32a,转化大肠埃希菌BL21(DE3)LvsS后以IPTG诱导表达.表达产物经Ni-NTA纯化后进行SDS-PAGE分析.用纯化的蛋白免疫BALB/c小鼠,经细胞融合和亚克隆后筛选出能分泌识别prM蛋白的mAb的杂交瘤细胞株.用Western Blot和免疫组化方法检测单克隆抗体的特异性.结果 从鼠脑中克隆出约500 bp的JEV prM基因,将其克隆入原核表达载体中,在大肠埃希菌中获得了较好表达.纯化的prM蛋白免疫BALB/c小鼠,经传统细胞融合及筛选方法制备出单克隆抗体,抗体滴度为105.ELISA、Western Blot和免疫组化检测结果证实该株单抗具有较好的特异性.结论 成功的表达和纯化了日本乙型脑炎病毒的prM蛋白,并完成了单克隆抗体的制备,为乙型脑炎病毒感染的早期诊断及预防的研究奠定了良好的基础.     

Secretion of noninfectious dengue virus-like particles and identification of amino acids in the stem region involved in intracellular retention of envelope protein

DNA plasmids that express flavivirus premembrane/membrane (prM/M) and envelope (E) proteins in the form of virus-like particles (VLPs) have an excellent potential as DNA vaccine candidates against virus infection. The plasmid-expressed VLPs are also useful as safe, noninfectious antigens in serodiagnostic assays. We have constructed plasmids containing the prM/M and E gene regions for DENV-1, -3, and -4 that express and secrete VLPs when electroporated into Chinese hamster ovary cells. Constructs containing the full-length DENV-1 E protein gene did not secrete VLPs into tissue culture fluid effectively. However, a 16-fold increase in ELISA titers of DENV-1 VLPs was achieved after replacing the carboxy-terminal 20% region of DENV-1 E protein gene with the corresponding sequence of Japanese encephalitis virus (JEV). DENV-3 plasmids containing either the full-length DENV-3 E protein gene or the 20% JEV sequence replacement secreted VLPs to similarly high levels. Whereas DENV-4 VLPs were secreted to high levels by plasmids containing the full-length DENV-4 E protein gene but not by the chimeric plasmid containing 20% JEV E replacement. Domain substitutions by replacing prM/M protein stem-anchor region with the corresponding prM/M stem-anchor region of JEV or DENV-2 in the chimeric DENV-4 construct failed to promote the secretion of DENV-4 VLPs. Using the DENV-2 chimeric plasmid with carboxy-terminal 10% of JEV E gene, the sequence responsible for intracellular localization of E protein was mapped onto the E-H1 alpha-helix domain of DENV-2 E protein. Substitution of three amino acids from the DENV-2 sequence to the corresponding amino acids in the JEV sequence (I398L, M401A, and M412L) in the E-H1 was sufficient to promote extracellular secretion and resulted in detectable titers of DENV-2 VLP secretion.     

中国基因3型乙型脑炎病毒E基因分子特征

目的 以减毒活疫苗(SA14-14-2株)为对照,分析我国分离的基因3型乙脑病毒E基因区段核苷酸及氨基酸序列分子特征.方法 从GenBank中获取相应乙脑病毒株E基因区段核苷酸序列,通过Clustal X(1.81)、DNAStar、GENEDOC(3.2)等生物学软件进行核苷酸和氨基酸位点差异分析.以蜱传脑炎病毒可溶性蛋白晶体结构为模板进行乙脑病毒E蛋白氨基酸位点分析.结果 我国不同地域、不同宿主分离的基因3型乙脑病毒与SA14-14-2株核苷酸同源性分别在96%和95%以上,氨基酸同源性在95%和94%以上.在同一地域、同一宿主类型分离的毒株之间核苷酸和氨基酸同源性非常高.在E基因区段存在10处共同的氨基酸位点差异,在结构域Ⅰ(E160)、结构域Ⅱ(E123和E227)和两个未在结构域中的氨基酸位点(E441和E487)等5个位点在部分基因3型乙脑病毒中存在差异.结论 我国分离的基因3型乙脑病毒与减毒活疫苗株(SA14-14-2株)E基因区段同源性高,存在5处基因3型乙脑病毒特异的氨基酸位点差异,但现行减毒活疫苗株理论上可以保护我国分离的基因3型乙脑病毒野毒株.     

Enhancing biosynthesis and secretion of premembrane and envelope proteins by the chimeric plasmid of dengue virus type 2 and Japanese encephalitis virus

We have constructed a series of plasmids encoding premembrane (prM) and envelope (E) protein genes of dengue virus type 2 (DEN-2). These plasmids included an authentic DEN-2 prM-E construct (pCBD2-14-6), and two chimeric constructs, 90% DEN-2 E-10% Japanese encephalitis (JE) virus E (pCB9D2-1J-4-3) and 80% DEN-2 E-20% JE E (pCB8D2-2J-2-9-1). Monoclonal antibody (MAb) reactivity indicated that all three plasmids expressed authentic DEN-2 virus E protein epitopes representative of flavivirus domains 1, 2, and 3. However, only the pCB8D2-2J-2-9-1 construct secreted high levels of prM, M (membrane), and E proteins into the culture fluid of plasmid-transformed COS-1 cells. The major portion of the prM and E proteins expressed by COS-1 cells transformed by pCBD2-14-6 or pCB9D2-4-3 plasmids remained membrane-bound. The results supported the notion that an unidentified membrane retention sequence is located between E-397 and E-436 of DEN-2 virus E protein. Replacing the carboxyl-terminal 20% of DEN-2 E (397-450) with the corresponding JE sequence had no effect on anti-DEN-2 MAb reactivity, indicating that this region is antigenically inert, although it is required for antigen secretion. Plasmid pCBD2-2J-2-9-1, which expressed secreted forms of prM/M and E that have the potential to form subviral particles, was superior to other constructs in stimulating an antibody response. Ninety percent neutralization titers ranging from 1:40 to >1:1000 were observed in seven of nine serum specimens from pCB8D2-2J-2-9-1-immunized mice. Eleven of twelve 2-day-old neonatal mice, derived from a pCB8D2-2J-2-9-1 immunized female mouse, survived intraperitoneal challenge of DEN-2 New Guinea C virus.     

Novel anti-dengue monoclonal antibody recognizing conformational structure of the prM-E heterodimeric complex of dengue virus

An interaction between the premembrane (prM) and envelope (E) glycoproteins as prM-E heterodimer is required for proper folding and transport of E during the formation and release of new flaviviral progeny. More evidence, however, is needed to confirm this interaction of prM and E during dengue virus replication. In this study, 2E11, a mouse monoclonal antibody (Mab) that specifically recognizes dengue prM-E heterodimeric complex in either intracellular or secreted dengue virions, was generated and characterized. In immunofluorescence and immuno-pull down assays, the Mab 2E11 recognized an epitope present in 293T transfectants that co-expressed prM and the full-length form of E in cis and in trans, but it failed to react with prM or E protein expressed individually. The reactivity of Mab 2E11 was diminished in transfected cells that co-express prM together with a truncated form of E lacking the 84-residue stretch at the C-terminal transmembrane region, presumably essential for prM and E interaction. The Mab 2E11 described in this study is a novel Mab with a unique capability in detecting the conformational structure of prM-E heterodimeric complex of dengue virus. It will be a new biological tool for identification and characterization of dengue prM-E heterodimer as well as virus maturation and export.     

乙脑病毒SA14-14-2株复制子载体的构建及鉴定

目的 构建乙脑病毒SA14-14-2株复制子载体,为进一步研究以乙脑病毒为载体的新型疫苗奠定基础.方法 (1)构建了两个乙脑病毒复制子:一个为完全缺失PrM/E基因(命名为Full △prM/E Replicon);一个保留E基因C端213 bp(命名为Partial △prM/E Replicon),并代之以多克隆位点.(2)将复制子RNA转染BHK-21细胞,于24、48、72、96 h采用Real-time PCR验证复制子的自主复制能力.(3)于复制子多克隆位点处插入YFP报告基因,并将含报告基因的复制子RNA转染BHK-21细胞,采用荧光显微镜观察及流式细胞仪检测验证YFP的表达.结果 (1)两个复制子RNA转染BHK-21细胞后,RNA有随时间增加而不断增多的趋势.(2)含报告基因的复制子RNA转染BHK-21细胞后,荧光信号持续增强,表达YFP的阳性细胞率也逐渐增多.结论 构建的乙脑病毒SA14-14-2株复制子载体Full △prM/E Replicon及Partial △prM/E Replicon具有自主复制能力及对外源蛋白的表达能力.