人脂肪干细胞对兔任意型皮瓣成活的影响

目的 探索人脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)对兔任意型皮瓣成活能力的影响.方法 获得健康成人的脂肪,经体外分离、培养及传代至第5代,进行流式细胞术检测和三系分化能力的鉴定.于大白兔背部对称地设计2个蒂部在头侧的任意型皮瓣(长6 cm、宽2 cm),左、右侧分别为对照组和实验组.应用DiO荧光标记ADSCs,实验组(n=10)分5点注射2×106悬浮于0.5 ml无血清的DMEM培养基中的ADSCs,对照组(n=10)同样分5点注入无血清的DMEM0.5 ml,于术后7 d分别测量皮瓣成活面积;随机作冰冻切片,在激光扫描共聚焦显微镜下观察切片荧光显影情况;随机作常规切片HE染色,光镜下观察皮瓣组织毛细血管分布密度.统计学分析ADSCs在促进任意型皮瓣成活过程中的作用.结果 与对照组相比,实验组皮瓣成活率明显提高(P<0.01),组织学检测证明实验组毛细血管增生明显增多.结论 人ADSCs具有较好的免疫相容性,局部应用可明显提高皮瓣的成活率.

Abstract：

Objective To explore the effect of the adipose derived stem cells (ADSCs)on the survival of random pattern skin flap in rabbits. Methods ADSCs were isolated from fresh human fat and expanded in vitro for five passages. Then the characterization of ADSCs were determined by their CD marker profile and their ability to differentiate into osteogenic, adipogenic and chondrogenic lineages. On the back of the rabbits, two symmetric cephalic-based random pattern skin flaps were designed (6 cm × 2cm). The right flaps were used as experimental groups with the contra-side flaps as control group. Human ADSCs were pre-labeled before seeding with fluorescent 3, 30-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO) dye. The experimental flaps evenly received 5-point injection of 2 × 106Dio-labeled ADSCs resuspended in 0.5 ml of serum-free DMEM, while only 0. 5 ml medium was injected into the control flaps.Seven days later, the survival rate of flaps was evaluated. The flaps underwent frozen section and were observed under the laser scanning confocal microscope to detect the fluorescence imaging. Flaps also underwent HE staining and were observed under light microscope to detect the vascular density. Results Compared with control group, there was a significant increase of flap survival rate in the experimental group(P <0.01). Histological analysis also demonstrated a statistically significant increase in capillary density in the experimental group. Conclusions It suggests that ADSCs have a better immune compatibility and potential for enhancing the blood supply of random pattern skin flaps.     

人脂肪干细胞对兔任意型皮瓣成活的影响

Objective To explore the effect of the adipose derived stem cells (ADSCs)on the survival of random pattern skin flap in rabbits. Methods ADSCs were isolated from fresh human fat and expanded in vitro for five passages. Then the characterization of ADSCs were determined by their CD marker profile and their ability to differentiate into osteogenic, adipogenic and chondrogenic lineages. On the back of the rabbits, two symmetric cephalic-based random pattern skin flaps were designed (6 cm × 2cm). The right flaps were used as experimental groups with the contra-side flaps as control group. Human ADSCs were pre-labeled before seeding with fluorescent 3, 30-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO) dye. The experimental flaps evenly received 5-point injection of 2 × 106Dio-labeled ADSCs resuspended in 0.5 ml of serum-free DMEM, while only 0. 5 ml medium was injected into the control flaps.Seven days later, the survival rate of flaps was evaluated. The flaps underwent frozen section and were observed under the laser scanning confocal microscope to detect the fluorescence imaging. Flaps also underwent HE staining and were observed under light microscope to detect the vascular density. Results Compared with control group, there was a significant increase of flap survival rate in the experimental group(P <0.01). Histological analysis also demonstrated a statistically significant increase in capillary density in the experimental group. Conclusions It suggests that ADSCs have a better immune compatibility and potential for enhancing the blood supply of random pattern skin flaps.     

一氧化氮对任意型皮瓣成活的影响

目的　观察一氧化氮 (nitricoxide ,NO)对任意型皮瓣成活的影响。方法　采用Wistar大鼠为实验动物 ,在其背部形成 9cm× 3cm任意型皮瓣 ,通过图像分析技术、病理切片、电镜观察、组织化学染色和血清中NO2 - NO3 - 含量的测定等手段 ,观察NO合酶抑制剂 (L NAME)和NO合成前体 (L Arg)对皮瓣成活的影响。结果　术后第 7dL Arg组皮瓣成活率明显高于其他两组 (P <0 0 1)。组织学检查发现L Arg组皮瓣毛细血管扩张及增生明显。结论　促进NO合成能扩张微血管 ,改善微循环 ,提高皮瓣存活率。     

不同培养条件对人脂肪源性干细胞生长状态的影响

目的 观察不同培养条件对人脂肪源性干细胞(hADSCs)体外生长状态的影响.方法 取腹部手术患者皮下脂肪组织,用0.1％的Ⅰ型胶原酶消化法分离出hADSCs,将获得的细胞分别在以下3组培养条件下培养:高糖DMEM培养基、高糖DMEM培养基+碱性成纤维生长因子(bFGF)、间充质干细胞培养基(MSCM).取第2代或者第3代细胞进行以下实验:细胞免疫荧光及流式细胞仪行细胞表面标志物CD31、CD34和Stro-1鉴定;绘制细胞生长曲线观察3组细胞的生长状态;采用不同的培养条件对3组细胞进行体外培养,观察细胞的增殖.结果 通过胶原酶消化法可成功地分离出hADSCs.流式细胞仪检测DMEM组CD31、CD34、Stro-1阳性率分别为0.9％、2.9％、56.7％;DMEM+ bFGF组CD31、CD34、Stro-1阳性率分别为1.3％、2.5％、73.5％;MSCM组CD31、CD34、Stro-1阳性率分别为0.7％、2.4％、84.5％.采用不同的培养条件对hADSCs进行培养,DMEM组、DMEM+ bFGF组、MSCM组细胞的倍增时间分别为93.7、64.5、49.1h,差异有统计学意义(p＜0.01).此外,各组中所培养的细胞在MSCM和高糖DMEM+ bFGF的培养条件下的增殖速率明显高于高糖DMEM培养条件(P＜0.05).结论 采用MSCM培养hADSCs可以在短期内获得大量细胞,在传统的高糖DMEM培养基中加入bFGF后也可以获得相似的效果,可以满足组织工程研究的种子细胞数量的要求.     

一氧化氮对任意型皮瓣成活影响的实验研究

目的　观察任意型皮瓣掀起后皮瓣远端组织内一氧化氮 (NO)含量的变化和外源性L 精氨酸 (L arginine ,L arg)对任意型皮瓣成活的影响。方法　采用Wistar大白鼠为实验动物 ,在其背部形成 7cm× 2cm任意型皮瓣 ,通过图像分析技术和不同时间远端皮瓣组织匀浆中NO-2 NO-3含量测定 ,观察皮瓣掀起后皮瓣组织内NO含量变化 ,和NO前体L arg对皮瓣成活的影响。结果　实验组皮瓣成活率明显高于对照 2组 (P <0 0 1) ,组织学检查发现实验组皮瓣组织炎症细胞浸润较对照 2组少 ,组织匀浆NO含量结果发现 :术后即刻各组NO含量差异无显著性意义 (P >0 0 5 ) ,术后 8、12、2 4和 72h各组存在差异有显著性意义 (分别为P <0 0 1,P <0 0 1,P <0 0 5和P <0 0 1) ,实验组明显高于对照 2组。结论　皮瓣掀起后 ,组织NO含量早期有所升高而后降低 ;应用外源性L arg可以提高皮瓣组织中NO含量和皮瓣成活率。     

脂肪来源基质细胞对超长皮瓣成活比例的影响

目的探讨脂肪来源基质细胞对超长皮瓣成活的影响。方法利用胶原酶消化sD大鼠腹股沟区的脂肪,经过分离培养传代,将获得的大量脂肪基质细胞行Dil染色,并在sD大鼠背部形成超比例任意皮瓣模型;将Dil染色后的脂肪基质细胞注射到皮瓣下治疗,并与生理盐水治疗组作对比;观察皮瓣大体情况,计算皮瓣成活率;观察病理切片毛细血管密度,荧光显微镜检测脂肪基质细胞在皮瓣内的分布和存活状况。结果术后第10天,皮瓣成活与坏死部分界线清楚,脂肪基质细胞组皮瓣成活率明显高于生理盐水组。脂肪基质细胞组和生理盐水组的皮瓣存活率分别为（67．4±5．1）％和（52．5±6．5）％,P〈0．05;毛细血管密度分别为（57．1±4．7）／mm。和（28．7±2．8）／mm2,P〈0．05;脂肪基质细胞注射入SD大鼠皮瓣后,脂肪基质细胞存活并参与新生血管的形成。结论脂肪基质细胞可明显增加超比例任意皮瓣成活面积,其存临床治疗中有潜在的应用和研究价值。     

人脂肪来源干细胞与Ⅰ型胶原支架体外复合培养的研究

目的 观察体外人脂肪来源干细胞(ADSCs)与Ⅰ型胶原支架的生物相容性.方法 0.125％Ⅰ型胶原酶体外分离人ADSCs,按每只培养瓶1×104个细胞/ml接种,80％融合时进行传代,培养至第3代,将其与Ⅰ型胶原支架体外复合培养(5×105个/cm2胶原支架),细胞计数法检测黏附率,倒置显微镜及扫描电镜观察细胞在支架上黏附生长及增殖.将ADSCs用DⅡ荧光标记并与胶原支架黏附,检测黏附率并与转染前进行比较,检测DII标记后对ADSCs的黏附能力是否有影响.结果 体外成功分离得到ADSCs,与Ⅰ型胶原支架能够很好地黏附,在支架上增殖生长状态良好,DⅡ标记前后黏附率分别为(91.9±2.3)％和(90.5±2.0)％,两样本t检验比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 ADSCs与Ⅰ型胶原支架具有良好的生物相容性,Ⅰ型胶原支架可作为脂肪组织工程较理想的生物支架材料.     

前列环素对任意型皮瓣成活影响的实验研究

为观察前列腺素（ＰＧＩ２）对皮瓣成活的影响，以大白鼠背部设计超长任意皮瓣模型，设立术前（预防组），术后（治疗组）静脉给ＰＧＩ２及生理盐水对照组，对皮瓣的血供，代谢和血液流变学等进行分析，结果表明治疗组皮瓣端血流相对值的４１．３％，对照组为２２．４５，治疗组皮瓣成活率明显高于对照组，预防组与对照相比地明显差异，提示：术后早期给予ＰＧＩ２可以改善皮瓣的血流和血液流变状态，提高皮瓣成活面积。     

前列环素对任意型皮瓣成活影响的实验研究

为观察前列环素(PGI_2)对皮瓣成活的影响,以大白鼠背部设计超长任意型皮瓣模型,设立术前(预防组)、术后(治疗组)静脉给 PGI_2及生理盐水对照组,对皮瓣的血供、代谢和血液流变学等进行分析。结果表明治疗组皮瓣远端血流相对值为41.3%,对照组为22.4%,治疗组皮瓣成活率明显高于对照组,预防组与对照组相比无明显差异。提示:术后早期给予 PGI_2可以改善皮瓣的血流和血液流变状态,提高皮瓣成活面积。     

前列环素对任意型皮瓣成活影响的实验研究

为观察前列环素（ＰＧＩ２）对皮瓣成活的影响，以大白鼠背部设计超长任意型皮瓣模型，设立术前（预防组）、术后（治疗组）静脉给ＰＧＩ２及生理盐水对照组，对皮瓣的血供、代谢和血液流变学等进行分析。结果表明治疗组皮瓣远端血流相对值为４１．３％，对照组为２２．４％，治疗组皮瓣成活率明显高于对照组，预防组与对照组相比无明显差异。提示：术后早期给予ＰＧＩ２可以改善皮瓣的血流和血液流变状态，提高皮瓣成活面积。     

脂肪来源干细胞对兔皮肤组织扩张后回缩率的影响

目的探讨在皮肤组织扩张过程中注射脂肪来源干细胞对扩张皮瓣回缩率的影响。方法取健康新西兰大白兔的脂肪,体外分离、培养并传代脂肪来源干细胞,行免疫细胞化学表面标志物及表皮细胞诱导分化鉴定,并利用EdU染色对脂肪来源干细胞进行标记;20只新西兰大白兔随机分为实验组和对照组,每组各10只;在兔背部埋置-30ml扩张器;实验组在扩张皮下注射1ml脂肪来源干细胞悬液,细胞密度为5×106^／ml;对照组仅注射1ml无血清DMEM培养基;常规组织扩张至预期容量;切取扩张组织,观察切片厚度及组织学变化;计算两组回缩率并作统计学分析;采用免疫组化染色对组织中血管内皮生长因子和内皮细胞特异性标记物（CD31）进行检测。结果与对照组相比,实验组扩张皮瓣回缩率明显降低（P〈0．05）;组织学显示,实验组扩张皮肤厚度大于对照组（P〈0．05）;免疫组化显示,实验组CD31、VEGF表达量增多,毛细血管增生明显。结论脂肪来源干细胞能够促进新生血管生成及皮肤组织再生,很大程度地减少了扩张皮肤组织的回缩率,从而提高了皮肤扩张效率。     

脂肪干细胞促进人表皮角质形成细胞创面模型愈合的研究

目的 探讨脂肪干细胞(ADSCs)促进人表皮角质形成细胞(HEKa)创面模型愈合的可能性.方法 体外培养大鼠ADSCs(rADSCs)(n=10).实验组为rADSCs与HEKa直接共培养组(n=10),对照组为在transwell培养板建立的rADSCs与HEKa间接共培养(间接组,n=8)和单纯HEKa培养组(单纯组,n=8).刮擦生长融合成片的HEKa细胞制备创面.培养24、48、72 h后,计数迁移到创面的HEKa细胞数量并计算创面愈合率,检测HEKa细胞吸收脱氧胸腺嘧啶核苷的放射活性以判定HEKa细胞的增殖活性.结果 实验组、间接组、单纯组在伤后24 h分别有(9.2±0.2)、(5.0±0.3)、(4.2±0.3)个细胞/高倍视野;48 h分别有(58.5±0.4)、(26.5±0.3)、(20.7±0.5)个细胞/高倍视野;72 h分别有(125.8±0.4)、(43.0±0.5)、(35.6±0.5)个细胞/高倍视野越过创缘进入创面,实验组均明显优于两对照组(P<0.05).三组创面愈合率在伤后72 h分别为61.0% ±3.0% 、35.0% ±2.5% 、32.0% ±2.1% ,实验组均明显优于两对照组(P<0.05).脱氧胸腺嘧啶核苷掺入培养基法表明三组HEKa细胞的放射性强度为(1440±210)、(1050±280)、(1130±390)cpm/105细胞,实验组与两对照组之间差异有统计学意义(P<0.05).结论 rADSCs通过直接接触促进HEKa细胞的分裂增殖和迁移.     

促进脂肪来源间充质干细胞成骨分化的诱导方法研究进展

脂肪来源间充质干细胞(ASCs)是一种多能成体干细胞,因安全、含量丰富、易于获取等优点而有望成为理想的骨组织工程(BTE)种子细胞。然而,相较于骨髓间充质干细胞,ASCs的成骨分化能力有限,往往需要进一步诱导。该文从优化支架、添加生物活性因子或促成骨药物、非编码RNA调控和物理刺激几个方面,对促进ASCs成骨分化的诱导方法的研究进展进行综述,以期为BTE研究提供参考。     

大鼠脂肪干细胞(rADSCs)转运VEGF基因促进随意皮瓣成活率的研究

目的:探讨人血管内皮细胞生长因子(VEGF165)基因转染大鼠脂肪干细胞(rADSCs)的稳定表达系统对皮瓣成活的影响。方法:①培养和鉴定大鼠ADSCs,脂质体介导pcDNA3.1-VEGF165质粒转染大鼠(rADSCs),经G418筛选抗性rADSCs并继续培养4周,用ELISA法检测转染后细胞培养上清中VEGF浓度。②Brdu标记被转染rADSCs后,在大鼠背部制备8.0cm×2.5cm的随意型皮瓣模型,实验组(10只大鼠)为注射pcDNA3.1-VEGF165质粒转染的rADSCs悬液到大鼠腹腔,对照组(8只大鼠)为注射2ml被空载体pcDNA3.1(-)转染的rADSCs悬液,术后7天用透明纸描记法记录皮瓣成活范围,记数坐标纸格子并换算为成活面积百分率。分别于术后3天、5天、7天在成活皮瓣的远端切取皮瓣组织标本行免疫组化染色。结果:①ELISA检测4株转染和经G418筛选抗性并继续培养2周的第二代rADSCs上清中VEGF浓度多达(4.21±0.35)pmol VEGF/1×106细胞/48h(x±s,n=4),有2株细胞培养液上清分泌VEGF较强,其余2株细胞相对较弱,均大于对照的空载体转染组和未转染组rADSCs培养液上清中的(0.49±0.15)pmol VEGF/1×106细胞/48h(x±s,n=3)和(0.62±0.86)pmol VEGF/1×106细胞/48h(x±s,n=3),均P<0.01,差异有统计学意义。分泌VEGF较强的rADSCs经Brdu标记后阳性率达到70%以上。②将获得的稳定表达VEGF165的rADSCs移植到随意型皮瓣动物模型体内,7天后实验组皮瓣的成活面积为(59.6±0.52)%,大于对照组的皮瓣成活面积(40.5±0.27)(%P<0.01)。成活皮瓣的远端组织标本切片在显微镜下可见皮下脂肪中有大量核仁深染棕黄色的细胞。结论:ADSCs可以作为载体细胞运送VEGF基因到达皮瓣远端并通过分泌VEGF提高皮瓣的成活面积。     

脂肪组织来源干细胞提高游离脂肪移植存活率的研究

目的 探讨脂肪组织来源干细胞移植在体内促进游离移植脂肪组织的再血管化,提高移植脂肪组织存活率的可行性.方法 自人体吸脂术中脂质部分分离、培养AScs,行成脂、骨和软骨分化.将ASCs以DiI标记后与人体吸脂术获得的脂肪组织混合移植于18只裸鼠背部,裸鼠背部随机注入3组移植物:ASCs组(A组)、胰岛素组(B组)及培养基对照组(C组).术后6个月观察移植物情况,通过组织观察、HE染色和免疫组化进行分析.结果 抽脂术脂质部分能获取大量的ASCs,能分化成脂肪、成骨和软骨细胞.术后6个月3组移植脂肪的湿重分别为A组(165.97±5.51)mg,B组(93.42±5.12)mg,C组(67.64±5.09)lIIg.A组移植脂肪的存活率高于B、C组(P=0.000).纤维化程度的测定,"网格点计数"3组移植物的点个数分别为A组(152.2±9.8)个/10HF,B组(743.9±20.4)个/10HF,C组(892.2±16.5)个/10HF.A组移植脂肪的纤维化及坏死程度低于B、C组(P=0.000).免疫组化证实:ASCs散在分布于部分脂肪细胞及小叶间隔中,ASCs在体内能够部分转化为血管内皮细胞.结论 脂肪组织来源干细胞移植在体内可促进游离移植脂肪组织的再血管化,提高移植脂肪组织的存活率并改善了移植物的质地.AsCs辅助移植可能是一种较为理想的细胞疗法.     

XIAP修饰的脂肪间充质干细胞在心肌梗死治疗中的作用

目的 探讨XIAP修饰的脂肪间充质干细胞(ADMSCs)是否具有更强的活力,能否更好地恢复心功能,及基因修饰干细胞治疗模式的可行性.方法 10周的雄性SD大鼠,体质量200 ～ 300 g,取其腹股沟处脂肪组织,提取脂肪间充质干细胞行体外培养扩增.应用电转染的方法将XIAP表达质粒导入脂肪干细胞内,进行基因修饰.另取61只SD大鼠,年龄和体质量同前,顺序编号,按照随机数字表法完全随机分为对照组(18只)、ADMSCs组(18只)、XIAP修饰ADMSCs组(18只)和未处理组(7只).结扎大鼠冠状动脉左前降支,选取梗死中央及边缘区共5个注射点,按分组每点注射生理盐水、ADMSCs悬液或经XIAP修饰的ADMSCs悬液或不做任何处理.结果 注射4周后,同对照组相比,ADMSCs组的左心室射血分数明显改善[(0.57 ±0.05)对(0.53±0.03),P＜0.05],心肌梗死面积百分比显著减小[(5.17±2.03)对(10.62±3.50),P＜0.05];与ADMSCs组相比,XIAP修饰的ADMSCs对心肌梗死的治疗作用更为明显,射血分数0.64±0.03,心肌梗死面积百分比3.26±0.95,P＜0.05.结论 ADMSCs能有效恢复梗死后心功能;XIAP修饰的ADMSCs在移植区的生存效率更高,能更好的恢复心功能.     

大鼠脂肪基质干细胞的培养及其向成骨细胞分化的研究

目的：研究大鼠脂肪基质干细胞（adipose—derived stem cells，ADSCs）分离培养的方法，探讨大鼠脂肪基质干细胞在体外向成骨细胞分化的能力。方法：取成年Sprague—Dawley大鼠腹股沟处脂肪组织，胶原酶消化分离．接种于自制基础培养基巾分离传代。于基础培养基中传至第二代时改换诱导培养基，诱导向成骨细胞分化，培养2-4周．用碱性磷酸酶染色和Von Kossa染色鉴定成骨细胞分化能力。结果：大鼠脂肪中能够分离培养出生长旺盛的脂肪基质下细胞：经向成骨细胞诱导培养后，碱性磷酸酶染色和Von Kossa染色阳性，证实细胞能够分化为成骨细胞。结论：大鼠脂肪组织可分离培养出脂肪基质干细胞，生物学特性与骨髓基质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）相似，能够向成骨细胞分化，有望成为组织工程的种子细胞来源。     

Effects of melatonin on the proliferation and differentiation of rat adipose-derived stem cells

Background:

Osteogenesis driven by adipose-derived stem cells (ADSCs) is regulated by physiological and pathological factors. Accumulating evidence from in vitro and in vivo experiments suggests that melatonin may have an influence on bone formation. However, little is known about the effects of melatonin on osteogenesis, which thus remains to be elucidated. This study was performed to determine whether melatonin at physiological concentrations (0.01-10 nM) could affect the in vitro proliferation and osteogenic differentiation of rat ADSCs.

Materials and Methods:

ADSCs were isolated from the fat of adult rats. After cell expansion in culture media and through three passages, osteogenesis was induced in a monolayer culture using osteogenic medium with or without melatonin at physiological concentrations (0.01-10 nM). After four weeks, the cultures were examined for mineralization by Alizarin Red S and von Kossa staining and for alkaline phosphatase (ALP) activity using an ALP kit. Cell viability and apoptosis were also assayed by 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTT) assay and flow cytometry, respectively.

Results:

The results indicated that at physiological concentrations, melatonin suppressed proliferation and differentiation of ADSCs. These data indicate that ADSCs exposed to melatonin, had a lower ALP activity in contrast to the cells exposed to osteogenic medium alone. Similarly, mineral deposition (calcium level) also decreased in the presence of melatonin. Flow cytometry confirmed that cell growth had decreased and that the numbers of apoptotic cells had increased.

Conclusion:

These results suggest that the physiological concentration of melatonin has a negative effect on ADSC osteogenesis.