携带肠道病毒71型VP1基因的重组减毒沙门菌的构建和鉴定

目的 构建和鉴定能够稳定携带肠道病毒71型(EV71)VP1基因的重组减毒伤寒沙门菌,用于口服EV71 DNA疫苗的研发.方法 利用DNA重组技术,构建表达EV71 VP1蛋白的真核表达质粒VR-EV71 VP1,体外转染Vero细胞后检测目的 蛋白体外表达和抗原性,并将该质粒电转化至减毒伤寒沙门菌SL7027.结果 酶切鉴定证实构建含EV71 VP1基因的重组质粒,体外表达目的 蛋白具有较好的抗原性,并获得稳定携带该质粒的重组减毒伤寒沙门菌.结论 成功构建稳定携带肠道病毒71型VP1基因的减毒伤寒沙门菌,为下一步的疫苗研究打下了基础.     

携带肠道病毒71型VPl基因的重组减毒沙门菌的构建和鉴定

目的构建和鉴定能够稳定携带肠道病毒71型（EV71）VPl基因的重组减毒伤寒沙门菌,用于口服EV71DNA疫苗的研发。方法利用DNA重组技术,构建表达EV71VPl蛋白的真核表达质粒VR．EV7lVPl,体外转染Vero细胞后检测目的蛋白体外表达和抗原性,并将该质粒电转化至减毒伤寒沙门菌SL7027。结果酶切鉴定证实构建含EV7lVPl基因的重组质粒,体外表达目的蛋白具有较好的抗原性．并获得稳定携带该质粒的重组减毒伤寒沙门菌。结论成功构建稳定携带肠道病毒71型VPl基因的减毒伤寒沙门菌,为下一步的疫苗研究打下了基础。     

利用减毒沙门菌递送的柯萨奇病毒A16型VP1基因重组质粒的构建和鉴定

目的:构建能够稳定携带柯萨奇病毒A16型(CoxA16)VP1基因的重组减毒伤寒沙门菌并鉴定目的抗原的表达,研发利用减毒沙门菌递送的口服疫苗.方法:利用DNA重组技术,构建表达CoxA16 VP1蛋白的真核表达质粒,体外转染Vero细胞后检测VP1蛋白表达情况及抗原活性,并将该质粒通过电转化构建重组减毒伤寒沙门菌.结果:构建了表达CoxA16 VP1蛋白的重组质粒,转染vero细胞后检测到CoxA16 VP1蛋白的表达并具有抗原活性;获得能稳定携带该质粒的重组减毒伤寒沙门菌.结论:成功构建稳定携带柯萨奇病毒A16型(CoxA16)VP1基因的重组减毒伤寒沙门菌,为口服CoxA16疫苗的研究打下了基础.     

青海省分离到肠道病毒71型及其VP1区基因特征分析

目的 研究2008年青海省手足口病（Hand,Foot and Mouth Disease,HFMD）的致病病原体中肠道病毒71型（Human Enterovirus 71,HEV71）的VP1区基因特征.方法 采集青海省HFMD患者的粪便、疱疹液和咽拭子标本共335份,并进行病毒分离,然后对阳性分离株病毒进行肠道病毒血清型别的分子定型.对分离到的HEV71阳性分离株进行VP1编码区基因扩增,核苷酸序列测定和同源进化分析.结果 在335份临床标本中,共分离到45株阳性病毒分离物,其中30株鉴定为HEV71（占66.7%）,是主要病原体.对30株HEV71进行VP1区核苷酸序列测定后,分析发现它们在VP1区核苷酸水平和氨基酸水平上有一定差异,同源性分别在95.2%～100.0%和96.6%～100%之间.它们与1998年以来在我国分离的HEV71在核苷酸和氨基酸水平上的同源性都较高.与其他35株各基因型和基因亚型的HEV71代表株构建的亲缘进化树中显示,青海省HEY71分离株与C4亚型代表株聚为一簇,属于C4基因亚型C4a进化分支.结论 青海省从HFMD病例中分离到HEV71,也确认了青海省HFMD的病原体HEV71流行株的基因型为C4基因型中的C4a进化分支,并且存在多个传播链.     

抗肠道病毒EV71型外壳蛋白VP1单克隆抗体的制备和鉴定

目的 制备具有中和活性的抗肠道病毒EV71型外壳蛋白VP1的单克隆抗体.方法 人工合成SP55和SP70(分别包含VP1的第163-177,208-222位氨基酸)两段VP1的多肽,分别免疫BALB/c小鼠,常规杂交瘤技术进行细胞融合,用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)筛选阳性杂交瘤细胞并测定效价.用分泌的单抗和EV71病毒在RD细胞上进行中和试验以检验其中和活性.结果 得到2株能稳定分泌抗肠道病毒EV71型VP1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,2株单抗的中和效价分别为1:8和1:16.结论 成功制备出2株具有中和活性的抗肠道病毒EV71型VP1蛋白单克隆抗体,为其下一步应用打下基础.     

表达幽门螺杆菌NAP基因的减毒沙门菌疫苗株的建立

目的：建立表达幽门螺杆菌(H．pylori)中性粒细胞活化蛋白(Hp—NAP)的减毒沙门菌疫苗株。方法：用PCR扩增Hp—NAP基因，并克隆至原核表达质粒pTrc99A中，经PCR及酶切鉴定后测定其基因序列，并与GenBank中相关序列的同源性进行比较。以重组质粒pTrc99A—NAP转化减毒伤寒沙门菌SL3261，培养后筛选阳性菌落，抽提质粒进行PCR及酶切鉴定。表达的Hp—NAP蛋白用SDS—PAGE进行鉴定，用薄层扫描分析蛋白含量。结果：核苷酸序列测定及同源性分析证实，克隆的Hp—NAP基因与GenBank中相关序列的同源性为98％(397／402)，氨基酸序列的同源性为98％(131／133)。以重组质粒pTrc99A—NAP转化的减毒沙门菌，可表达Mr约15000的Hp—NAP蛋白，表达量约占菌体蛋白量的37．5％。结论：建立了可表达Hp—NAP基因的减毒鼠伤寒沙门疫苗株，为进一步研制Hp口眼疫苗奠定了基础。     

北京市2008年肠道病毒71型的RT-PCR鉴定及VP1区基因特征分析

目的 研究2008年北京市手足口病（Hand,foot and mouth disease,HFMD）患者中肠道病毒71型（Human enterovirus 71,HEV71）的VP1编码区基因特征.方法 采集北京市朝阳区医院和幼儿园的HFMD患者标本共285份,进行HEV71特异性RT-PCR鉴定和病毒分离,随机选取10株HEV71阳性分离株进行VP1编码区基因扩增和核苷酸序列测定和分析.结果 129份标本RT-PCR鉴定结果 为阳性,阳性率为45.26%.10株HEV71在VP1区核苷酸水平和氨基酸水平上的差异分别在94.6%～99.6%和95.9%～100%之间.北京朝阳HEV71分离株属于C4基因亚型C4a进化分支.结论 RT-PCR法可以快速、准确地鉴定HEV71.引起本次HFMD流行的HEV71为C4基因亚型C4a进化分支,并且存在多个传播链,提示自1998年起,C4亚型的HEV71在中国大陆有较广泛的传播.加强对HEV71的分子流行病学监测,了解HEV71的基因特征,对预防和控制HEV71在中国的暴发具有重要意义.     

深圳地区肠道病毒71型VP1基因变异趋势研究

目的 研究深圳地区肠道病毒71型VP1基因变异趋势.方法 用肠道病毒71型特异性引物进行RT-PCR,并对EV71的VP1进行扩增,所得的序列与肠道病毒71型A、B、C基因型代表株的核苷酸序列比较,用DNA Star、BioEdit和Mega 3.1软件进行系统进化分析.结果 35株病毒间VP1核苷酸同源性为92.1%-100%,它们与A、B基因型代表株VP1区核苷酸同源性差异较大,为81.4%-91.1%,与C4基因型代表株接近,其核苷酸同源性在93%-97.4%之间.1998-2004年深圳地区EV71主要流行株为C4b亚型,从2003年开始逐步向C4a亚型过渡,至2006年已全部变迁为C4a亚型,且从2003年至2008年,深圳地区EV71 C4a株与安徽阜阳株FY23的核苷酸的同源性分别为：94.5%-94.7%,95.7%-95.8%,96.2%,95.4%-97.5%,96.3%-99.2%,有逐年增高的趋势.2006年两株EV71和2008年EV71代表株核苷酸序列在VP1区的第66位点,均由A→C,从而导致VP1区氨基酸的第22位点由谷酰胺变为组氨酸（Q→H）.结论 深圳地区EV71流行株逐渐由C4b亚型向C4a亚型演变,2006年部分EV71及2008年EV71 VP1第66核苷酸位点发生有义突变.     

口服鼠疫F1-V重组融合基因DNA活菌疫苗的构建及免疫原性研究

目的 构建携带鼠疫耶尔森菌F1-V融合基因的重组减毒沙门菌苗,口服免疫Balb/c小鼠检测其免疫原性,为口服鼠疫活载体DNA疫苗研究打下基础.方法 将F1-V融合基因克隆到真核表达载体asd-pVAX1,进一步依次将重组质粒转化减毒沙门菌X3730、X4550得到重组沙门菌X4550(asd-pVAX1/F1-V),提取重组质粒转染COS-7细胞并做免疫组化和Western-blot检测F1-V融合蛋白在细胞中的表达.以1×109CFU/只的剂量3次口服免疫Balb/c小鼠,ELISA方法检测血清中抗体水平.结果 构建的重组减毒沙门菌转染COS-7细胞后,免疫组化和Western-blot试验证明F1-V融合蛋白在细胞中得到了瞬时表达,ELISA检测到免疫小鼠血清有特异性抗体IgG产生.结论 构建的重组沙门菌能运送DNA疫苗到体内并成功释放质粒刺激机体产生特异性免疫应答,为口服鼠疫活载体DNA疫苗的黏膜免疫研究打下了基础.     

肠道病毒71型（EV71）AH3株感染性克隆的构建与鉴定

目的 构建肠道病毒71型（Enterovirus71,EV71） AH3株的全基因序列感染性克隆.方法 通过分段扩增和酶切连接将EV71全基因组cDNA片段逐步克隆入PWSK29载体,构建含全病毒基因组序列的重组质粒.转染Vero细胞后,获得拯救病毒.经RT-PCR、酶切、测序、间接免疫荧光（IFA）等方法进行鉴定.结果 酶切鉴定结果与预期一致,序列分析显示为EV71基因;其转染Vero细胞后,可观察到典型的细胞病变;所获得的拯救子代病毒滴度（TCID50）为107.5;IFA检测可见感染细胞出现绿色荧光.结论 成功构建EV71全基因序列感染性克隆,为病毒致病机理及减毒疫苗的研究奠定基础.     

应用枯草芽孢杆菌表达系统制备肠道病毒71型VP1蛋白

目的利用枯草芽孢杆菌系统表达肠道病毒71型（EV71）病毒VPl蛋白。方法使用基因特异性引物扩增VPl开放读码框（ORF）,构建包含VP1完整开放读码框的pSac—VPl穿梭载体。根据枯草芽孢杆菌表达系统双交叉同源重组的特点,将EV71的结构抗原基因VPl整合在枯草芽孢杆菌sacA染色体,并经测序鉴定。使用VPl特异性抗体,通过蛋白印记（Western—Blot）鉴定枯草芽孢杆菌中VPl蛋白的表达情况。结果成功克隆EV71的VPl基因,长度1361bp,并将其克隆入穿梭载体pSae—Kan。测序结果显示VPl基因成功整合如sacA染色体。Western．Blot证实VPl抗原在枯草芽孢杆菌的成功表达,相对分子质量约35×10^3。结论利用枯草芽孢杆菌表达系统成功制备EV71病毒VPl抗原,为后续EV71诊断试剂、疫苗研发奠定基础。