Notch-2在大鼠牙髓炎中的时空分布及其意义

目的:研究单纯开髓导致大鼠牙髓炎进程中Notch-2在牙髓损伤修复中的作用.方法:通过开髓建立大鼠牙髓炎模型,用免疫组织化学染色方法研究Notch-2的时空表达变化及其意义.结果:牙髓损伤早期(3 d),牙髓间充质细胞和牙髓成纤维细胞中Notch-2均呈弱阳性表达,成牙本质细胞为阴性表达.牙髓损伤中期(5 d),靠近损伤区的成牙本质细胞深层细胞Notch-2阳性表达达到高峰;同时,新生毛细血管内皮细胞呈强阳性表达.牙髓损伤晚期(7 d),Notch-2在牙髓间充质细胞、血管内皮细胞中表达均减弱,而在成牙本质细胞阳性表达达到高峰.牙髓损伤末期(14 d),Notch-2仅在成牙本质细胞下层细胞中尚有微弱表达,而其余牙髓细胞均为阴性表达.对照组正常牙髓组织Notch-2表达为阴性.结论:Notch-2在牙髓损伤应激情况下在牙髓间充质细胞和成牙本质细胞中上调表达,对于启动牙髓自我修复、诱导牙髓间充质细胞功能性分化以及抑制受损成牙本质细胞凋亡、维系和调动其相对正常的生理功能可能具有重要作用.     

基质细胞衍生因子1在人炎症牙髓组织中表达的实验研究

目的:研究基质细胞衍生因子1(Stromal cell-derived factor-1,SDF-1)及其受体CXCR4在人炎性牙髓组织中的表达,探讨SDF-1/CXCR4轴在牙髓炎症发生发展中的可能作用。方法:采用免疫组织化学染色的方法检测SDF-1和CXCR4阳性细胞在健康、炎症牙髓组织中的分布情况。以实时荧光定量RT-PCR方法检测SDF-1mRNA在健康和炎症牙髓中的表达。结果:炎性牙髓中SDF-1、CXCR4主要分布于炎性细胞、成牙本质细胞和微血管内皮细胞。而正常组牙髓少见SDF-1、CXCR4阳性细胞。炎性牙髓中SDF-1mRNA的表达较健康牙髓显著增强。结论:与正常牙髓相比,炎性牙髓组织中SDF-1、CXCR4阳性细胞明显增多。炎性牙髓中SDF-1表达水平明显上调。SDF-1/CXCR4轴可能参与了牙髓炎症损伤和修复过程。     

Toll样受体4在大鼠炎症牙髓表达的免疫组化研究

目的研究内毒素(LPS)诱导大鼠牙髓炎模型中Toll样受体4(TLR4)的表达特点,以探讨TLR4在牙髓炎症中的可能作用,推测它在牙髓炎发生发展中的意义。方法通过对LPS诱导的大鼠磨牙牙髓炎组织切片,同时采用免疫组化方法检测大鼠牙髓炎中TLR4的表达情况。结果 1 d组:成牙本质细胞呈中度阳性表达,牙髓成纤维细胞为中度至强阳性表达;3⁷ d组:成牙本质细胞、牙髓成纤维细胞阳性表达减弱;2周组:坏死区扩大呈均质弱阳性表达,成牙本质细胞、牙髓成纤维细胞及内皮细胞减少,呈阳性,修复牙本质呈弱阳性表达;3周组:大部分坏死牙髓组织呈均质弱阳性表达。结论 TLR4在大鼠牙髓炎发生、发展呈动态表达,TLR4可能参与调节牙髓炎发生、发展及修复过程。     

热休克蛋白70在大鼠牙髓炎中的免疫组化研究

目的　研究内毒素 (LPS)诱导大鼠牙髓炎模型中诱导型热休克蛋白 (HSP) 70在不同时间动态表达及定位情况 ;推测其在牙髓炎发生、发展中的意义。方法　通过对LPS诱导的大鼠磨牙实验性牙髓炎组织进行连续切片 ,同时行超敏免疫组化分析。结果　 1d组、3d组HSP70在成纤维细胞、血管壁及内皮细胞中均呈强阳性表达 ,成牙本质细胞呈中度阳性表达 ,随后表达逐渐减弱 ,至 2周修复期为弱阳性表达。 2周以后 ,成牙本质细胞 ,前期牙本质细胞层仍有阳性表达。 3周、4周以后 ,成牙本质细胞、牙髓成纤维细胞、修复性牙本质呈弱阳性表达。 5周以后 ,牙髓组织变性、坏死 ,呈均质弱阳性染色。结论　HSP70在牙髓炎早期能够保护牙髓细胞 ,限制炎症发展 ,在损伤晚期则可能参与牙齿矿化修复过程。     

LIM矿化蛋白1在大鼠牙髓损伤修复中的时空表达

目的:探讨LIM矿化蛋白1(LIM mineralization protein 1,LMP-1)在大鼠磨牙牙髓损伤修复中的表达.方法:建立大鼠磨牙牙髓损伤修复动物模型,用免疫组织化学染色方法观察LMP-1在大鼠牙髓损伤修复中的表达,并用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件及单因素方差分析比较各组间的差异.结果:在正常大鼠牙髓组织中LMP-1表达阴性;在大鼠牙髓损伤后1d,LMP-1表达于成牙本质细胞及部分牙髓成纤维细胞;术后3 d,LMP-1表达于坏死牙髓下方的细胞增殖层;术后7d,LMP-1显著表达于增殖活跃的牙髓细胞及部分成牙本质细胞中.结论:LMP-1在牙髓损伤修复过程中呈时空特异性表达,可能参与成牙本质细胞及牙髓细胞的增殖、分化及修复性牙本质的形成.     

Notch 1信号蛋白在早期牙髓损伤修复中表达的免疫组化研究

目的 :通过建立大鼠牙髓损伤动物模型 ,观察Notch1信号蛋白在牙髓损伤修复过程中的表达。方法 :在大鼠第一磨牙牙合面开髓 ,分别对损伤后 2h、12h、2 4h、3d、7d及正常大鼠牙髓标本进行HE染色、免疫组化染色 ,检测各组标本中Notch1信号的表达。结果 :Notch1信号蛋白在正常成年大鼠牙髓组织中无表达 ,在牙髓损伤后表达上调。牙髓损伤 12h ,Notch1在成牙本质细胞层、部分牙髓细胞间质中呈弱阳性表达。损伤后 1～ 3d ,Notch1在成牙本质细胞层、部分牙髓细胞间质及接近损伤部位的牙髓细胞中呈阳性着色。损伤后 7d ,Notch1的表达位于成牙本质细胞层和穿髓孔下方的细胞增殖层。结论 :Notch1信号蛋白在大鼠牙髓损伤后早期阶段表达逐渐上调 ,随后在成牙本质细胞区及富细胞区牙髓细胞中表达增强 ,并沉积于穿髓点附近的细胞增殖层。提示它可能在牙髓损伤的早期自身修复和牙本质矿化中起作用     

早期牙髓损伤修复中牙本质涎磷蛋白表达的免疫组化研究

目的：衬步探讨牙本质涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein,DSPP)在早期早贿损伤修复中的作用。方法：制备大鼠牙髓损伤模型,分别对损伤后6h,12h,1d,2d,3d,7d及正常大鼠牙髓标本进行HE和免疫组织化学染色,检测各实验组标本中DSPP的表达。结果：正常大鼠牙髓中仅在成牙本质细胞层有DSPP的阳性着色;牙髓损伤后6h,12h,DSPP在成牙本质细胞层的染色明显减弱;损伤后1-3d,梁色较正常牙增强。此时,牙尖及富细胞区的牙髓细胞也有了性着色;损伤后7d,染色与正常对照无明显差异。结论：DSPP在牙髓损伤的早期阶段表达下调;随后在成牙本质细胞及富细胞区牙髓细胞中表达增强;7d时表达趋于正常。提示：它可能在牙髓损伤早期的自身修复中起作用。     

大鼠磨牙牙髓组织在程度不同的机械性损伤刺激后HSP70的表达及意义的研究

目的 检测大鼠磨牙在程度不同的机械性钻磨损伤刺激(浅磨、深磨、穿髓)后热休克蛋白70(HSP70)的动态表达。方法 采用"二步法"免疫组化法观察HSP70在正常组、浅磨组、深磨24h组、穿髓24h组、穿髓3d组和穿髓7d组牙髓组织中的表达情况。结果 浅磨组和正常组HSP70在牙髓组织中有个别标本弱阳性着色,与后4组相比P<0.01;深磨24h组可见成牙本质细胞、成纤维细胞阳性表达,血管内皮细胞弱阳性表达;穿髓24h组和3d组表现为急性炎症反应,HSP70在成牙本质细胞、血管内皮细胞、中性粒细胞中均呈强阳性表达,成纤维细胞呈阳性表达;至穿髓7d时为弱阳性表达。结论 在程度不同的钻磨刺激下,HSP70在鼠牙髓组织中的表达有强弱不同的动态变化;HSP70在牙髓损伤修复过程中可能是主要介导牙齿矿化修复的细胞因子之一。     

DCN与BGN在发育期小鼠牙髓牙本质复合体形成中的作用研究

目的:研究富含亮氨酸的蛋白多糖类物质:核心蛋白聚糖(DCN)及双糖蛋白聚糖(BGN)在小鼠牙髓牙本质复合体不同发育时期的分布特点,探讨其在牙髓牙本质复合体形成过程中的作用.方法:取出生后第5 d、10 d、15 d、25 d的BALB/℃小鼠36只,引颈处死,解剖分离含下颌第一磨牙区的下颌骨,新鲜配制4%多聚甲醛固定24 h,甲酸-甲酸钠复合脱钙液脱钙1～3周,石蜡包埋,近远中向5μm连续切片.免疫组化PV两步法,观察各发育时期第一磨牙牙本质、成牙本质细胞及牙髓细胞中DCN、BGN的组织学分布特点.结果:牙本质形成初期,BGN在前期牙本质与成牙本质细胞强阳性表达.随后,前期牙本质与成牙本质细胞染色开始减弱,而牙髓细胞阳性表达呈逐渐增强趋势.第5 d,DCN在前期牙本质中强阳性表达,而在牙本质、成牙本质细胞中一直为阴性;第13 d,牙髓细胞开始呈弱阳性表达,随着牙齿发育而逐渐增强.在观察期间,两者在前期牙本质中持续阳性表达,并且随着牙本质的发育成熟,其染色逐渐减低.结论:DCN与BGN在牙体组织和牙发育过程中特定阶段聚集在特定的部位,二者可能在细胞与细胞、细胞与基质相互作用中发挥特异作用并参与牙本质的矿化过程.     

Toll样受体4在人成牙本质细胞和牙髓组织中的表达

目的 探讨人牙髓组织和成牙本质细胞中Toll样受体4（TLR4）的表达与分布特点，及其在牙髓组织天然免疫防御中的可能作用。方法从新鲜拔除的人第三磨牙获取牙髓组织和成牙本质细胞，扫描电镜观察牙髓摘除后髓腔壁成牙本质细胞形态和附着情况；RT—PCR检测人牙髓组织以及成牙本质细胞中TLR4mRNA的表达情况：采用免疫印迹技术和免疫组织化学方法检测TLR4蛋白的表达与定位。结果扫描电镜观察牙髓摘除后成牙本质细胞大部存留在髓室壁上，细胞形态良好：RT-PCR结果发现健康牙髓、成牙本质细胞均可表达TLR4mRNA，产物大小为278bp；免疫印迹法检测正常牙髓、成牙本质细胞在相对分子质量89000附近出现蛋白条带；免疫组化显示牙髓组织中的成牙本质细胞、血管内皮细胞TLR4免疫反应阳性。正常牙髓中牙髓成纤维细胞不表达TLR4。结论成牙本质细胞通过表达TLR4参与牙髓牙本质复合体的先天免疫反应，TLR4在牙髓抵御外来病原微生物入侵的宿主免疫防御中起重要作用。     

基质金属蛋白酶抑制剂—1、—2在人牙髓组织和细胞中表达的免疫组化研究

目的 探讨基质金属蛋白酶抑制剂（TIMP-1、-2）在人正常、炎症牙髓组织及体外培养的人牙髓成纤维细胞中的表达及其意义。方法 采用免疫组织化学方法,观察TIMP-1、-2在体外培养的牙髓成纤维细胞和正常、炎症牙髓组织中的表达。结果 TIMP-1、-2在体外培养的人牙髓成纤维细胞呈阳性表达;TIMP-1在正常及炎症牙髓的成牙本质细胞及牙髓细胞表达阳性;TIMP-2在正常牙髓的成牙本质细胞及血管内皮细胞呈阳性表达,在炎症组织表达减弱,炎症区淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞TIMP-1、-2均未见阳性表达。结论 TIMP-1、-2在人牙髓成纤维细胞及牙髓组织均有表达,为进一步研究TIMP在牙髓组织 的作用机理提供实验依据。     

骨髓间充质干细胞参与牙髓损伤修复的体内实验研究

目的:观察体内的骨髓间充质干细胞(BMMSCs)能否参与牙髓损伤的局部修复,初步探讨骨髓间充质干细胞在牙髓损伤修复中的作用。方法:构建绿色荧光蛋白转基因大鼠骨髓间充质干细胞(GFP-BMMSCs)嵌合SD大鼠模型,30 d后,通过流式细胞术检测外周血单核细胞和骨髓间充质干细胞中荧光细胞的比例,冰冻切片观察心、肝、肾组织中是否有荧光细胞的分布,检测模型是否构建成功。然后利用该模型,通过制备牙本质缺损构建牙髓损伤模型,分别于牙本质缺损后5、10、15 d取材,切片,HE及免疫荧光染色,观察牙髓的病理变化以及GFP-BMMSCs在牙髓组织中的分布情况和变化。结果:HE染色可见牙本质缺损组初期有牙髓充血,后期牙髓炎症逐渐恢复并有修复性牙本质形成。免疫荧光染色可见牙髓组织中有荧光细胞的分布,牙本质缺损组比正常组中可见更多的荧光细胞,且随着牙髓炎症的恢复,荧光细胞减少。结论:牙髓损伤时,骨髓间充质干细胞可以迁移到损伤的牙髓处参与其损伤的修复。     

重建牙本质-牙髓复合体样结构的实验研究

目的 采用组织工程学的方法重建牙本质-牙髓复合体样结构。方法以大鼠牙髓干细胞为种子细胞，将羟基磷灰石-磷酸三钙（HA-TCP）复合支架材料接种至裸鼠背部皮下，8周后取材进行组织学及免疫组织化学检测。结果移植物组织学切片可见支架材料孔隙内有3层组织结构，由外向内分别为矿化牙本质、前期牙本质及牙髓组织，其中牙本质小管明显，牙髓组织外层细胞密集，部分出现极化，呈现出成牙本质细胞样细胞特征。免疫组织化学染色证实人牙本质特异性蛋白、DMP1在前期牙本质区及成牙本质细胞样细胞为阳性表达。结论采用牙髓干细胞为种子细胞、HA-TCP为支架材料可成功构建牙本质-牙髓复合体样结构，为进一步进行牙齿组织工程再造奠定基础。     

转化生长因子-β受体Ⅰ型及Ⅱ型在人年轻恒牙中的表达

目的　探讨转化生长因子 - β受体Ⅰ、Ⅱ (TGF βRⅠ、Ⅱ )在人年轻恒牙牙本质 -牙髓复合体中的表达及其生物学作用。方法　应用免疫组化方法检测TGF βRⅠ、Ⅱ在人年轻恒牙牙本质 -牙髓复合体中的表达。 结果　TGF βRⅠ、Ⅱ在年轻恒牙牙本质 -牙髓复合体中的表达呈现空间分布特异性 ,在成牙本质细胞中呈强阳性表达 ,其他牙髓细胞呈弱阳性表达。结论　TGF βRⅠ、Ⅱ在年轻恒牙牙本质 -牙髓复合体的修复过程中发挥重要作用。     

大鼠磨牙钻磨后牙髓中肌动蛋白表达的研究

目的：探讨肌动蛋白在大鼠正常牙髓及钻磨刺激后牙髓中的分布变化。方法：建立大鼠磨牙牙髓损伤模型，用免疫组化方法观察正常牙髓及钻磨后2h～14d牙髓中肌动蛋白的分布情况。结果：正常组成牙本质细胞及血管内皮细胞阳性；钻磨刺激2h组，穿髓点附近的成牙本质细胞转为阴性，血管内皮细胞及管周细胞强阳性；8h--5d各组可见强阳性血管在牙髓中分布并始终位于炎症发展的前沿区。结论：肌动蛋白对维持成牙本质细胞排列方式及正常生理功能有重要作用；其在血管内皮细胞及管周细胞的表达上调可能与牙髓损伤的早期修复有关。     

转录因子Klf4在人牙髓组织和牙髓成纤维细胞中的表达研究

目的研究转录因子Klf4在人牙髓组织和体外培养的牙髓成纤维细胞中的表达特点。方法采用免疫荧光技术检测Klf4和增殖标记物ki67在人牙髓组织及体外培养的牙髓成纤维细胞中的表达情况;利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测Klf4在人牙髓细胞和矿化诱导14 d的表达情况。结果人牙髓中,Klf4主要表达在成牙本质样细胞和血管内皮细胞中;在体外培养的牙髓成纤维细胞中,与诱导前相比,Klf4在矿化诱导14 d时的表达明显增强。结论 Klf4在成牙本质细胞中呈特异性表达,可能与成牙本质细胞分化相关。     

基质细胞衍生因子1α及其受体CXCR4在人牙髓细胞中的表达

目的 研究体外培养人牙髓细胞(human dental pulp cells,HDPC)上CXCR4的表达情况,检测大肠杆菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)刺激后HDPC培养上清液中基质细胞衍生因子1α(stromal cell-derived factor-1α,SDF-1α)的表达水平,探讨人工重组SDF-1α(recombinant human SDF-1α,rhSDF-1α)对HDPC增殖及迁移的影响.方法 采用免疫细胞化学及间接免疫荧光技术检测HDPC上CXCR4的表达.用不同浓度LPS(0.1、1、10、100 mg/L)和TNF-α(1、10、100μg/L)刺激HDPC 48 h后,ELISA法检测HDPC培养上清液中SDF-1α含量的变化.同时甲基噻唑基四唑(MTT)法及体外趋化实验观察不同浓度rhSDF-1α对HDPC增殖及迁移的影响.结果 正常HDPC胞膜表达CXCR4且其培养上清液分泌SDF-1α,浓度约为(4513.55±962.92)ng/L.在用LPS和TNF-α刺激HDPC后,SDF-1α的表达水平均显著降低(P＜0.05).50、100和200μg/L的rhSDF-1α可促进HDPC的增殖(P＜0.05),50和100μg/L rhSDF-1α作用9 h可显著趋化HDPC的迁移(P＜0.01).结论 CXCR4在HDPC上表达且SDF-1α能促进HDPC的增殖及迁移;SDF-1-CXCR4轴可能在牙髓组织损伤修复中发挥重要作用.     

碱性成纤维细胞生长因子及其受体在人牙髓中的表达

目的:探讨碱性成纤维细胞生长因子及其受体在人牙髓中表达和意义。方法:用免疫组化方法检测碱性成纤维细胞生长因子及其受体在人牙髓中的表达。结果:碱性成纤维细胞生长因子在成牙本质细胞层强阳性表达, 在牙髓其它细胞和血管内皮细胞阳性表达;碱性成纤维细胞生长因子受体在成牙本质细胞层弱阳性表达,牙髓其它细胞为阴性。结论:碱性成纤维细胞生长因子及其受体在反应性及修复性牙本质形成过程中可能起重要作用。     

Notch信号通路在牙髓和牙周细胞矿化及组织损伤修复中的调控作用研究

目的 探讨Notch信号通路在人牙髓细胞(dental pulp cells, DPCs)和牙周韧带细胞(periodontal ligament cells, PDLCs)向成牙本质/成骨样细胞分化及组织损伤修复中的调控作用.方法 酶消化法分离培养DPCs和PDLCs,实时荧光定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测Notch信号通路相关基因Notch1、Notch2、DLL1和DLL3 mRNA在DPCs和PDLCs矿化诱导过程中表达水平变化;建立大鼠牙髓和牙周联合损伤动物模型,观察4周后牙髓牙本质复合体及牙周附着装置修复情况,免疫组织荧光染色检测Notch1在牙髓和牙周联合损伤修复动物体内模型的表达和分布.结果 DPCs和PDLCs经矿化诱导,Notch1、Notch2、DLL1 mRNA表达均上调,与对照组间的差异有统计学意义(P<0.05);DLL3 mRNA表达上调,与对照组间差异无统计学意义(P>0.05).免疫荧光示Notch1蛋白在损伤处的新生牙髓及牙周韧带组织细胞浆强表达,而在正常牙髓及牙周韧带组织基本无表达.结论 在DPCs和PDLCs诱导成牙本质/成骨分化的过程中,Notch1、Notch2、DLL1呈现相似的表达变化趋势上调,Notch1信号在牙髓及牙周损伤修复的新生组织明显激活,提示Notch信号通路参与DPCs和PDLCs成牙本质/成骨分化,且在牙髓牙本质复合体和牙周附着装置的损伤修复中起重要的调控作用.     

基质细胞趋化因子-1对人牙周膜干细胞趋化因子受体——CXC亚家族受体4表达的影响研究

目的:证实人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs)表达趋化因子受体——CXC亚家族受体4(cysteine X cysteine receptor 4,CXCR4)及探究趋化因子基质细胞趋化因子-1(stromalcell-derived factor1,SDF-1)和阻断剂AMD3100(商品名:普乐沙福)对CXCR4表达的影响,从而为探究牙周膜干细胞生物学效应的影响提供理论基础。方法:采用消化组织块法联合有限稀释法分离纯化得到hPDLSCs,取第3代hPDLSCs随机分为3组:阴性对照组、SDF-1组(200μg/L SDF-1),SDF-1+AMD3100组(200μg/L SDF-1+10 mg/L AMD3100)。利用Western blot检测CXCR4在hPDLSCs上的表达及在SDF-1、AMD3100作用下CXCR4表达的变化。结果:1.筛选后的hPDLSCs可被诱导分化为成骨细胞和成脂细胞,证实其具有多向分化潜能;利用流式细胞仪检测其细胞表型鉴定其符合牙周膜干细胞的免疫表型。2.Western blot检测结果显示hPDLSCs上表达CXCR4,且应用SDF-1后上调CXCR4的表达,SDF-1+AMD3100组无明显变化。结论:1.hPDLSCs可从新鲜离体牙的牙周膜中培养获得,经有限稀释法纯化后鉴定为间充质来源。2.hPDLSCs上表达CXCR4,SDF-1通过上调hPDLSCs上CXCR4的表达,AMD3100可阻断SDF-1与其受体CXCR4结合。