成年大鼠骨髓基质细胞体外诱导分化为NSE阳性细胞

目的：　研究成年大鼠骨髓基质细胞 (MSCs)在体外分化为NSE阳性细胞的方法。方法：　采用 β -巯基乙醇预诱导MSCs24h,再诱导5h。神经细胞特异性烯醇化酶 (NSE)免疫细胞化学染色鉴定、计数诱导前后的细胞。结果：　诱导后MSCs形态改变,胞体呈锥形,突起交织成网。免疫细胞化学染色NSE表达率达到 (6 3.7±4.5) %。结论：　β -巯基乙醇可以诱导成年大鼠MSCs在体外分化成为NSE阳性细胞。     

丹参诱导人脐血间充质干细胞分化为神经样细胞

目的探讨丹参注射液对人脐血单个核细胞来源的间充质干细胞(MSCs)向神经细胞分化的诱导作用。方法利用FACScan流式细胞仪检测MSCs表面抗原CD29、CD44、CD59、CD33,用丹参注射液诱导人脐血原代细胞和脐血来源的间充质干细胞向神经细胞方向分化,并与神经生长因子(NGF)和神经常苷脂(GM1)的诱导作用比较,用免疫细胞化学方法对分化和未分化细胞进行鉴定。结果人脐血原代细胞中MSCs的表耐标记CD29、CD44、CD59阳性率分别为10.7%、37.27%和66.67%,而造血细胞的表面标记CD33阳性率仅为0.33%。人脐血传代细胞(第5代)MSCs的表面标记CD29、CD44、CD59的阳性率分别为40.2%、70.5%和95.4%。原代培养的贴壁细胞形态呈大小不等圆形和条形,用丹参诱导可表达神经细胞的标记。传代培养的间充质干细胞,可维持在未分化状态稳定增殖。用丹参可诱导这种细胞向神经样细胞分化,表达神经干细胞标记nestin,神经元的标记β-Ⅲ类神经微管(β-TubulinⅢ)、神经微丝(NF)和神经胶质细胞的标记胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。与NGF和GMI的诱导作用比较,细胞形态类似,表达相同的神经细胞标记,丹参的诱导速度较快,诱导后细胞表达神经元标记的比例较高。结论人脐血是MSCs的来源之一,丹参可诱导人脐血干细胞分化为神经样细胞,丹参可作为神经诱导剂,人脐血干细胞可作为神经干细胞的来源。     

脊髓性肌萎缩症患儿骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞的实验研究

目的：脊髓性肌萎缩症(SMA)是一组常染色体隐性遗传性疾病,由于SMN基因的缺失或突变,导致脊髓前角细胞变性坏死,引起肢体近端肌肉无力和肌萎缩。该病至今无有效治疗,干细胞治疗可望给患者带来福音。该研究拟探讨SMA患者骨髓间质干细胞（MSCs）能否分化为神经元样细胞,从而为SMA的干细胞治疗提供实验依据。方法：用PCR-RFLP的方法对SMA患者进行基因诊断;分离和纯化患者的（MSCs）,在bFGF预诱导后,再用黄芩甙诱导MSCs分化为神经元样细胞;用神经元标志物NSE和NF鉴定诱导的神经元样细胞。上述研究均与对照者进行对比。结果：PCR-RFLP证实所选患者SMN1基因外显子7缺失,而对照者无缺失;SMA患者和对照者的MSCs形态相同,增殖速度相似;两组MSCs经黄芩甙诱导6 d后,大多数细胞转变为类似于神经元的形态,有长的突起,相互之间连接呈网状。免疫荧光染色鉴定两组分化后的神经元样细胞,NSE和NF均为阳性。结论：SMN1基因缺失不影响MSCs的增殖和分化,SMA患者的MSCs能够分化为神经元样细胞。［中国当代儿科杂志,2007,9（5）：453-456］     

营养不良对幼鼠癫癎持续状态后海马神经发生影响的研究

目的　探讨发育期营养不良伴发癫持续状态对海马神经发生的影响。方法　采用5 溴脱氧尿苷 (BrdU)标记新生细胞 ,β微管蛋白Ⅲ ( βⅢtubulin ,TuJ1)和胶质原纤维酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein ,GFAP)分别标记早期神经元和胶质细胞的单、双标免疫组织化学染色 ,观察幼鼠海马的神经发生。结果　营养良好 (N)组和营养不良 (M)组幼鼠癫发作的潜伏时间差异无显著性 [( 12 4± 2 6)min与 ( 11 9± 2 9)min ,P >0 0 5 ]。组织学染色示各组幼鼠海马部位均无明显的神经元丢失。各组幼鼠齿状回BrdU阳性细胞数 ,营养不良 +惊厥组 (MS组 ,3 74± 18)和营养良好 +惊厥组 (NS组 ,3 12± 2 4)分别明显高于营养不良组 (M组 ,3 0 3± 2 0 )和营养良好组 (N组 ,2 69± 18) (P均 <0 0 1) ,而M组和MS组分别明显高于N组和NS组 (P均 <0 0 1)。BrdU阳性细胞中 ,约有 60 %的BrdU阳性细胞同时表达神经元特异性标记物TuJ1,5 %～ 10 %的BrdU阳性细胞同时表达神经胶质特异性标记物GFAP。结论　早期营养不良没有改变幼鼠在海藻酸致过程中惊厥的易感性和行为表现。营养不良和癫持续状态均可促进幼鼠海马齿状回新生细胞的增殖 ,营养不良伴发癫持续状态时这种增殖将进一步加强 ,而且大多数新生细胞分化为早期     

脐血间充质干细胞成功培养的相关因素探讨

目的探讨影响人脐血间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)成功培养的相关因素,以期提高其培养成功率。方法脐血依胎龄分为3组:40周胎龄组(n＝11);36周胎龄组(n =6);32周及其以下胎龄组(n=5)。采用相对适宜的条件培养,观察能成功培养出MSCs的比率,探讨脐血MSCs培养与胎龄、脐血单个核细胞数量(mononuclear cells,MNCs)、脐血容量之间的相关关系,以及各因素之间可能存在的相关关系。通过检测脐血MSCs的生长曲线、细胞群体倍增时间、成纤维细胞集落形成数目(fibroblast colony forming unit,CFU-F)、表面标志的表达来观察脐血MSCs细胞的生物学特性。结果脐血MSCs培养成功率达54．5％。MSCs培养成功与否与接种于培养瓶内脐血MNCs数量密切相关,脐血MNCs接种数量在1．25×108／L以上者培养成功率达83．3％。单位体积内脐血MNCs含量与胎龄呈负相关。小胎龄者脐血MSCs成集落能力(CFU-F数目)高于大胎龄。流式细胞术检测显示,在原代培养细胞增殖期末间充质干细胞的重要表面标志CD29有62．1％的表达,传1代细胞表达CD29、CD105分别为78．3％和85．0％;造血系统的表面标志CD34、CD45则始终在3．0％以下。结论脐血MNCs的接种数量在1．25×108／L以上可以提高培养的成功率。相同容量内脐血MNCs与胎龄呈负相关,且脐血MSCs样细胞集落形成能力(CFU-F计数)小胎龄者高于大胎龄,可能是小胎龄脐血MSCs相对容易培养成功的原因之一。     

人脐带血间充质干细胞体外诱导分化为神经元样细胞的可行性

目的探讨人脐带血来源间充质干细胞(MSCs)在体外诱导分化为神经元样细胞的可行性及条件。方法采用Fi- coll-Paque(1.077 g/mL)分离液密度梯度分离人脐带血中MSCs,体外扩增纯化后,二甲基亚砜、巯基乙醇及丁羟茴醚等试剂诱导其向神经细胞分化,显微镜下观察,细胞免疫化学法鉴定。结果诱导后脐血MSCs具有典型神经元形态细胞,免疫细胞化学显示神经丝蛋白(NF-M)染色呈强阳性,占(81．86±4．06)％;Nestin染色呈阳性细胞占(39．99±4．60)％;GFAP染色阴性。结论人脐带血MSCs在体外培养及诱导条件下可定向分化为神经元样细胞。     

痰液诱导在儿童急性下呼吸道感染性疾病研究中应用和临床意义

为探讨痰液诱导方法在儿童急性下呼吸道感染性疾病中的应用和有关炎症细胞及细胞因子检测的临床意义,对44例急性下呼吸道感染的儿童应用5％的高渗盐水超声雾化吸入,诱导痰液,对痰液中的细胞进行计数和分类;运用RT-PCR方法检测痰液中的细胞因子IL-5、IL-8、TNF-α的mRNA表达,以正常健康儿童的痰液标本为正常对照。结果急性下呼吸道感染组痰液细胞总数为(8.7±2.4)×10~6/L,其中,中性粒细胞(7.4±2.6)×10~6/L、上皮细胞(2.1±0.87)×10~6/L、淋巴细胞(0.81±0.25)×10~6/L;对照组痰液细胞总数为(2.3±0.8)×10~6/L,中性粒细胞(0.8±0.3)×10~6/L,上皮细胞为(1.1±0.2)×10~6/L,淋巴细胞为(0.17±0.10)×10~6/L,两组相比差异有显著性(P<0.01),而两组痰液中上皮细胞、嗜酸粒细胞计数差异无显著(P>0.05)。急性下呼吸道感染组痰液中IL-5、IL-8、TNF-α mRNA阳性表达率分别为45.5％、27.3％,18.2％;对照组痰液中分别为12.5％、8.3％、4.2％,两组相比差异有显著性(P<0.01、P<0.05、P<0.05)。提示痰液诱导在儿童急性下呼吸道感染性疾病的研究中,能够直接反映与气道感染性炎症有关的细胞因子分泌状况,并具有简单、易行、无创伤性、安全、可重复性等特点,具有一定的临床应用价值。     

体外扩增脐血间充质干细胞的生物学特性和诱导分化能力的研究

目的 从脐血中分离单个核细胞(MNCs)，体外培养扩增间充质干细胞(MSCs)并研究其生物学特性和诱导分化潜能。方法 取35份足月顺产新生儿脐血，密度梯度离心法分离出其中的MNCs，采用含胎牛血清的DMEM培养基体外培养扩增MSCs。显微镜下观察MSCs的形态、细胞化学染色，流式细胞仪测定MSCs的细胞免疫表型，体外诱导分化实验检测MSCs分化成骨细胞、脂肪细胞和神经细胞的能力。结果 从12份脐血中可培养出MSCs，形态上与从其他来源的MSCs类似，可传至20代而无形态上的变化。细胞化学染色示碱性磷酸酶(ALP)阴性，非特异性酯酶——α-丁酸萘酚酯酶(alpha-naphthol butyrjc acid esterase，NBE)阳性。其表达CD29、CD44和CD105，特别是人类MSCs标记SH-2和SH-3阳性，而CD3、CD14、CD19、CD34和CD45阴性，说明它们并非来自造血细胞。这些MSCs在适当诱导分化剂的作用下，2周左右可以诱导分化形成骨细胞，20天左右可以诱导分化形成脂肪细胞。脐血MSCs预诱导12h后，胞体发生收缩，细胞边缘有细的突起。正式诱导5h后大多数细胞呈现典型的神经元样。结论 胎儿脐血MNCs可分离培养出MSCs。这些MSCs具有与其他来源MSCs类似的表型及分化潜能。     

rhG-CSF 抑制脐血CD3AK细胞和其培养上清液诱导K562细胞凋亡的研究

目的　探讨重组粒细胞集落刺激因子 (rhG CSF ,G CSF)对脐血CD3 AK细胞及其培养上清液诱导K562 细胞凋亡的影响。方法　用细胞形态学观察 ,DNA琼脂糖电泳 ,原位末端标记法对K562 ;CD3 AK细胞诱导的K562 ;CD3 AK细胞与大小剂量的G CSF共同诱导的K562 ;CD3 AK细胞培养上清液 (culturalsupernatants,CS)诱导的K562 ;CS与大小剂量的G CSF共同诱导的K562 进行检测分析。结果K562 自然凋亡率为 (3.5± 1.0 ) % ;CD3 AK细胞诱导的K562 凋亡率为 (2 7.4± 4.9) % ;CD3 AK细胞与大小剂量G CSF共同诱导的K562 细胞凋亡率分别为 (7.4± 3.0 ) %、(12 .9± 3.1) % (F =10 7.94,P <0 .0 1)。CS诱导的K562 细胞凋亡率为 (33.1± 5 .2 ) % ;CS与大小剂量的G CSF共同诱导的K562 细胞凋亡率分别为 (6 .4± 2 .3) % ;(14.8± 2 .5 ) % (F =183.36 ,P <0 .0 1)。结论　G CSF能部分或全部逆转脐血CD3 AK细胞和其培养上清液诱导的K562 细胞的凋亡。     

体外扩增脐血间充质干细胞的生物学特性和

目的从脐血中分离单个核细胞(MNCs),体外培养扩增间充质干细胞(MSCs)并研究其生物学特性和诱导分化潜能.方法取35份足月顺产新生儿脐血,密度梯度离心法分离出其中的MNCs,采用含胎牛血清的DMEM培养基体外培养扩增MSCs.显微镜下观察MSCs的形态、细胞化学染色,流式细胞仪测定MSCs的细胞免疫表型,体外诱导分化实验检测MSCs分化成骨细胞、脂肪细胞和神经细胞的能力.结果从12份脐血中可培养出MSCs,形态上与从其他来源的MSCs类似,可传至20代而无形态上的变化.细胞化学染色示碱性磷酸酶(ALP)阴性,非特异性酯酶--α-丁酸萘酚酯酶(alpha-naphthol butyric acid esterase,NBE)阳性.其表达CD29、CD44和CD105,特别是人类MSCs标记SH-2 和 SH-3 阳性,而CD3、CD14、CD19、CD34和CD45阴性,说明它们并非来自造血细胞.这些MSCs在适当诱导分化剂的作用下,2周左右可以诱导分化形成骨细胞, 20天左右可以诱导分化形成脂肪细胞.脐血MSCs预诱导12 h后,胞体发生收缩,细胞边缘有细的突起.正式诱导5 h后大多数细胞呈现典型的神经元样.结论胎儿脐血MNCs可分离培养出MSCs.这些MSCs具有与其他来源MSCs类似的表型及分化潜能.     

MiR-124-1促进大鼠骨髓间充质干细胞神经分化的实验研究

目的：探讨miR-124-1在大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）神经分化中的作用。方法：构建大鼠miR-124-1慢病毒载体及Anti-rno-miR-124* Inhibitor载体,体外感染大鼠MSCs,筛选最适感染复数（MOI）。实验分为对照组（未行感/转染组）、miR-124-1+组（感染miR-124-1慢病毒）及miR-124-1-组（转染Anti-rno-miR-124* Inhibitor）。采用β-巯基乙醇诱导MSCs分化为神经细胞。倒置荧光显微镜下观察感染后荧光表达情况,MTT法检测感/转染后各组细胞存活率;免疫细胞化学法、RT-PCR法、Western blot法检测各组诱导6 d后神经细胞标记物β3微管蛋白（β3 tubulin）、神经微管结合蛋白（MAP-2）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达变化。结果：倒置荧光显微镜下观察大鼠miR-124-1慢病毒感染成功,MOI值为30。miR-124-1+组慢病毒载体感染MSCs 2 d后,实时定量PCR显示miR-124-1的表达显著上调（P<0.01）;Anti-rno-miR-124* Inhibitor载体转染24 h后,细胞存活率下降,实时荧光定量PCR显示转染后miR-124-1的表达显著下降（P<0.01）。β-巯基乙醇可诱导MSCs分化为神经细胞,miR-124-1+组诱导6 d后细胞的β3 tubulin、MAP-2表达率显著高于其他两组（P<0.01）,miR-124-1-组β3 tubulin、MAP-2的表达率显著低于对照组（P<0.01）;各组GFAP表达率均较低（<1%）。结论：miR-124可能促进大鼠MSCs的神经分化。     

NF-κB在黄芩甙诱导大鼠骨髓基质细胞分化为神经细胞中的作用(英文)

目的：研究核因子-κB(NF-κB)在中药单体黄芩甙体外诱导骨髓基质细胞分化为神经细胞的作用。方法：实验分为黄芩甙组和对照组。黄芩甙组采用黄芩甙作为主要诱导剂,诱导成年大鼠骨髓基质细胞6d。对照组仅用无血清培养基诱导。采用间接免疫荧光染色检测神经细胞标记蛋白和NF-κB亚基P65的表达。结果：黄芩甙诱导6d,骨髓基质细胞形成较典型的神经细胞形态,同时表达多种神经细胞标记蛋白;对照组未见神经细胞标记蛋白表达。而且,对照组诱导6d,P65信号出现核移位,胞浆中信号明显减弱到(18.4±3.0)％,黄芩甙组P65信号(84.8±3.0)％主要仍在胞浆。结论：黄芩甙可以抑制NF-κB的活化,在骨髓基质细胞诱导分化为神经细胞过程中可能起到一定的作用。 [中国当代儿科杂志,2003,5(1):1-4]     

大鼠骨髓间充质干细胞体外向肠神经细胞分化及胶质细胞源神经营养因子表达的变化

目的 探讨大鼠骨髓间充质干细胞向肠神经分化的条件及胶质细胞源神经营养因子(glial cellline-derived neurotrophic factor,GDNF)及其受体RET基因表达的变化.方法 体外培养大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs),传至第四代,进行诱导分化.以10ng/ml GDNF和10%FBS的稀释胎肠培养基(fetal gut culture medium,FCCM)以及仅含有10 ng/ml GDNF的L-DMEM诱导7 d,对照组为含10%FBS的L-DMEM完全培养液,免疫组化的方法鉴定细胞的神经特异性烯醇化酶(neural specific enolase,NSE)、血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide,VIP)及一氧化氮合酶(nit ric oxide synthase,nNOS)的表达.RT-PCR检测GDNF及RET mRNA的变化,Westem Blot方法检测GDNF蛋白的表达情况.结果 BMSCs能在体外成功培养及纯化,诱导7 d后,实验组均可见NSE、VIP及nNOS的表达,两实验组的阳性率有统计学差异,而对照组为阴性.RT-PCR检测示,BMSCs向肠神经细胞诱导后,GDNF表达显著增强,并促使RET基因表达Western Blot结果提示,诱导后的细胞GDNF在蛋白水平上表达增强.结论 GDNF联合FCCM可诱导BMSCs分化为肠神经细胞,在向神经细胞分化的过程中,能促进GDNF表达的增强,并促使RET基因的表达,GDNF-RET信号通路在肠神经分化过程中可能发挥着重要作用.     

DSCAM在大鼠骨髓间质干细胞分化为神经细胞中的表达变化

目的：研究唐氏综合征细胞粘附分子（DSCAM）在大鼠骨髓间质干细胞（MSCs）分化为神经细胞中的作用。方法：在建立黄芩苷诱导大鼠MSCs分化为神经细胞的基础上,采用免疫细胞化学法、Western blot法等检测DSCAM的表达变化;同时采用RNA干扰技术,观察DSCAM-siRNA转染MSCs后诱导分化情况。结果：诱导前大鼠MSCs不表达DSCAM;预诱导液诱导24 h,MSCs开始少量表达DSCAM（1.71±0.67）%;黄芩甙诱导 6 h,部分表达DSCAM（15.79±4.24）%;诱导后3 d,DSCAM表达最高（53.16±5.94）%;诱导后 6 d,DSCAM表达明显下降（28.99±6.72）%。DSCAM-siRNA转染MSCs,DSCAM表达显著下降。而且,诱导前MSCs不表达神经细胞特异性标记蛋白β-III-tubulin;诱导6 h,β-III-tubulin表达为（1.40±0.79）%,诱导3 d达到（41.59±3.17）%,诱导 6 d 为（59.11±4.76）%。但是, DSCAM-siRNA转染MSCs,诱导3 d,6 d,β-III-tubulin蛋白的表达显著下降,分别为（28.57±2.91）%和（43.90±12.31）%。结论：DSCAM可能在MSCs分化为神经细胞中起到重要的作用。［中国当代儿科杂志,2009,11（6）：486-489］     

黄芩苷预处理对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的保护作用

目的：神经元凋亡是缺氧缺血性脑损伤(HIBD)过程中重要的病理改变,有研究证明地塞米松预处理对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤起有效的保护作用,而中药黄芩苷的部分药理作用与地塞米松类似。该文旨在探讨黄芩苷对新生大鼠HIBD神经凋亡的影响。方法：健康6日龄SD新生大鼠被随机分为空白对照组、HIBD组、黄芩苷后处理组、黄芩苷预处理组、地塞米松后处理组、地塞米松预处理组。在6日龄行预处理,7日龄制作新生大鼠HIBD模型,10日龄时处死,取脑组织标本。用干湿法检测各组脑组织含水量,用TUNEL法测定细胞凋亡数,观察脑组织形态学改变。结果：HIBD组动物脑组织含水量,细胞凋亡数较空白对照组均明显升高。黄芩苷、地塞米松预处理组脑组织含水量分别为(87.4±0.7)%,(87.3±0.5)%,较HIBD组(88.9±1.7)%下降,且具有统计学意义(P<0.05),细胞凋亡数分别为102±47;75±26,较HIBD组的251±28显著减少(P<0.05),而黄芩苷、地塞米松后处理组以上指标未见明显改善(P>0.05)。空白对照组脑组织结构正常,HIBD组可见明显的神经元丢失变性,而黄芩苷、地塞米松预处理组神经元损伤明显减轻,黄芩苷、地塞米松后处理组神经元损伤未见减轻。结论：黄芩苷及地塞米松预处理对新生大鼠HIBD产生保护作用,能减少神经元凋亡,而后处理无效。     

戊四氮致痫大鼠不同脑区神经元特异性烯醇酶的表达及意义

目的研究神经元特异性烯醇酶(NSE)的改变.探讨戊四氮(PTZ)致癎大鼠癫癎(EP)后脑组织的损坏情况。方法SD大鼠50只,随机分为对照组(A组,n=10)及实验组(n=40)。A组注射生理盐水,实验组腹腔注射PTZ50mg/(kg·次)。根据EP发作分级,0-1级7只,为B组,立即取脑;2级以上33只,于EP发作后0h(C组,n=10)、6h(D组,n=11)、24h(E组,n=10)、72h(F组.n=2)取脑。取躯干血后分别取海马、中脑、纹状体和额叶皮质。采用酶标法测血清和各脑区NSE值;以S-P免疫组织化学染色法染色,观察各组大鼠海马NSE表达。结果EP后各脑区和血清NSE均明显高于对照组;既使无EP大发作.但有兴奋症状的大鼠上述区域和血清NSE亦高于对照组。动态观察EP后不同时间段,发现中脑NSE在EP后6h达到高值.余脑区EP后即达高值,后出现下降,提示额叶、海马和纹状体神经损伤在前,而中脑神经损伤在后。免疫组织化学染色显示EP大发作后海马NSE表达明显增加,EP后72h与对照组相似。结论EP发生后NSE明显升高,尤其是海马区,表明EP可造成大脑神经细胞的损坏。     

热休克预处理对实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠模型的保护作用

目的：观察热休克预处理对实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）热休克蛋白70(HSP70)表达及神经细胞凋亡的影响,探讨其对EAE模型的保护作用。方法：将36 只Wistar大鼠随机分为对照组(CON), EAE组和热休克预处理组 (HSP)。EAE组,采用Wistar大鼠制作EAE模型;HSP组给予热休克预处理;CON组不行特殊处理。观察临床症状,进行神经功能评分。于免疫后14～17 d处死动物,取脊髓行苏木精-伊红染色,HSP70免疫组化及神经细胞的凋亡的检测。结果：HSP能明显改善EAE临床症状,降低临床评分,延缓发病（P<0.05）, 增加脊髓HSP70阳性细胞表达（21.08±0.87 vs 10.17±0.51, P<0.01）,抑制神经细胞凋亡（21.92±1.00）% vs （58.92±1.67）%, P<0.01。结论： 热休克预处理对EAE大鼠具有一定的神经保护作用, 其保护机制可能与增加HSP70表达而导致神经细胞凋亡减少有关。［中国当代儿科杂志,2007,9（6）：563-566］