套式聚合酶链反应单管法检测单纯疱疹病毒

应用聚合酶链反应方法，套式ＰＣＲ双管法及套式ＰＣＲ单法分别检测１３０份散发性脑炎患者脑脊液中单纯疱疹病毒的ＤＮＡ，阳性率依次为１８．５％（２４／１３０）、２９．２％（３８／１３０）、２９．２％（３８／１３０）；６０份非中枢神经系统感当者ＣＳＦ标本的检测阳性率分别为０、３．３％（２／６０）、０。结果显示：套式ＰＣＲ虽然提高了检测的敏感性，但假阳性也大大增加。改良的套式ＰＣＲ单管法则大大减少了污染机会     

聚合酶链反应检测单纯疱疹病毒的临床应用价值

目的 通过对162例皮肤性病门诊患者的检测,探讨用聚合酶链反应(PCR)检测单纯疱疹病毒的临床应用价值.方法 用PCR、酶联免疫吸附试验(ELISA)、培养法对本院皮肤性病门诊122例已确诊的单纯疱疹病毒感染患者的血液和分泌物或疱液进行检测,求得3种方法的阳性检出率结果.结果 122例患者分泌物或疱液中检测阳性率PCR法为86.7%,ELISA为45.7%,培养法为65.6%;在血液标本中的阳性检出率PCR法为31.3%,ELISA为58.2%,培养法为59.8%.结论 在分泌物中PCR的检出率明显高于其他两种方法,说明PCR特异性好、敏感性强、与临床符合率高.且比培养法大大节省了时间,为单纯疱疹病毒的诊断和监别赢得了时间,是一种可推广的好方法.同时提示血液标本不适合用PCR检测.     

通用引物聚合酶链反应一次检测4种疱疹病毒DNA

为了能一次分型检测４种疱疹病毒ＤＮＡ，防止漏诊，故采用在疱疹病毒高度同源序列ＤＮＡ聚合酶基因中设计一对通用引物的方法，对４种疱疹病毒（单纯疱疹病毒Ｉ型，ＩＩ型，爱泼斯坦巴尔病毒，人巨细胞病毒）ＤＮＡ进行扩增，继而用凝胶电泳和限制性内切ＢａｍＨＩ或ＳｍａＩ酶切扩增产物进行鉴别，建立了能一次性分型检测上述４种病毒的聚合酶链反应（ＰＣＲ）法，敏感性和特异性试验表明，灵敏度可测到ｉｆｇＤＮＡ相当于６个病毒     

通用引物聚合酶链反应一次检测4种疱疹病毒DNA

为了能一次性分型检测４种疱疹病毒ＤＮＡ，防止漏诊，故采用在疱疹病毒高度同源序列ＤＮＡ聚合酶基因中设计一对通用引物的方法，对４种疱疹病毒（单纯疱疹病毒Ⅰ型、Ⅱ型、爱泼斯坦巴尔病毒、人巨细胞病毒）ＤＮＡ进行扩增，继而用凝胶电泳和限制性内切酶ＢａｍＨＩ或ＳｍａＩ酶切扩增产物进行鉴别，建立了能一次性分型检测上述４种病毒的聚合酶链反应（ＰＣＲ）法。敏感性和特异性试验表明，灵敏度可测到１ｆｇＤＮＡ，相当于６个病毒颗粒，且引物仅对４种疱疹病毒扩增。用建立的ＰＣＲ法和酶切分型法检测病毒性脑炎患者脑脊液和慢性宫颈炎患者宫颈分泌物中的疱疹病毒，取得较好结果。该法的建立为疱疹病毒感染的临床早期准确诊断、判定药物疗效和流行病学研究等提供了有效的手段。     

荧光定量聚合酶链反应对生殖器疱疹病毒感染的检测

目的 探讨荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）在诊断生殖器疱疹病毒感染中的应用。方法 本研究共分两组，检测组即就诊的疑似生殖器疱疹患者347例，对照组12例。分别用FQ-PCR方法检测两组送检标本中的单纯疱疹病毒（HSV）DNA。结果 347例疑似生殖器疱疹患者送检标本中，HSVDNA阳性139例，阳性率为40．1％（139／347），其中阳性标本中有皮损组织液75例、男性尿道拭子31例、女性宫颈分泌物33例，各类标本的阳性率依次为91．5％（75／82）、21．1％（31／147）、28．0％（33／118）。HSVDNA阳性人群中性别差异无统计学意义（P〉O．05，X^2检验）。12例对照标本中没有检出HSVDNA。结论 分泌物中检出的HSVDNA能直观地反映患者当前病毒感染状况，在有皮损组织的患者中，HSVDNA的检出率更高，FQ-PCR能准确、快速地对生殖器疱疹病毒感染做出诊断。     

逆转录-半套式-聚合酶链反应单管法检测血清中HCV RNA

目的探讨建立一种更简便,更特异灵敏的逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)单管法.方法采用蜡隔将RT和PCR扩增2个独立的反应体系在1个Eppendoff(Ep)管中分隔开来,设计内外引物,优化反应体系及条件,使整个检测反应经高温启动继而连续封闭地完成.结果在60例血透析患者血清中,33例(55%)抗-HCV-IgG阳性和27例抗-HCV-IgG阴性血清用单管RT-PCR分别检出28例(85%)和3例(9%)HCV RNA阳性,并对3份阳性PCR产物作核酸序列测定.本方法的检测灵敏度为102拷贝/ml.结论 RT-PCR单管法在保持高灵敏度的前提下,提高了特异性,具有简单高效,杜绝外源性污染等优点.     

Modified nested polymerase chain reaction in one tube for detection of Enterovirus

A method of a modified nest-type polymerase chain reaction (MN-PCR), made in one tube, was elaborated that enhances the sensitivity and cuts the risk of cross-contamination in enteroviruses (EV) detection. The method, as described in detail above, was used to detect EV RNA in 76.9% and 31.25% of examined autopsy samples (13 liquor and 16 cardiac-tissue samples, respectively). It enabled the detection of EV RNA in 6.25% of samples that used to be negative, when tested by MN-PCR in 2 tubes. MN-PCR with one tube is a reliable, sensitive and specific diagnostic tool; it can be recommended for the routine diagnostics of enterovirus infection.     

聚合酶链反应扩增伤寒患者粒细胞中伤寒沙门菌DNA

目的建立适用于临床应用的血中伤寒沙门菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉ）ＤＮＡ扩增的方法。方法分离患者粒细胞，采用裂解法制备模板ＤＮＡ，单管套式聚合酶链反应扩增Ｓ．ｔｙｐｈｉ鞭毛基因。结果６例血培养阴性而临床拟诊伤寒及２３例由血培养确诊的伤寒患者粒细胞均获得了３４３ｂｐ的扩增产物，其他３４例发热待查患者粒细胞无扩增产物出现。连续１１０稀释Ｓ．ｔｙｐｈｉＤＮＡ，最低可检测到４０ｆｇＤＮＡ（约１０个菌）。扩增产物的ＤＮＡ序列测定结果也证实了３４３ｂｐ的扩增产物是Ｓ．ｔｙｐｈｉ鞭毛基因。结论该方法是一项简便、省时、灵敏和特异的实验室诊断伤寒的新技术，尤其对培养阴性的伤寒患者可提供早期、快速的实验室诊断，套式扩增反应在同一反应管中完成，能有效避免标本间的污染。     

套式聚合酶链反应在母婴传播巨细胞病毒研究中的应用

本文建立了套式ＰＣＲ技术加限制酶分析方法，对１０５份母脐血配对进行套式ＰＣＲ，病毒分离，特异性ＩｇＭ及ＩｇＡ测定。结果母血ＨＣＭＶ ＤＮＡ阳性６份，脐血３份，母－脐传播率为３／６。三对被证实为母婴传播ＨＣＭＶ套式的标本中，二对套式ＰＣＲ、病毒分离、特异性ＩｇＭ及ＩｇＡ均阳性。一对套式ＰＣＲ病毒分离、特异性ＩｇＡ阳性，但特异性ＩｇＭ阴性，提示：套式ＰＣＲ是一种敏感、特异、简便快速，能早期诊断ＨＣＭＶ     

套式聚合酶链反应检测巨细胞病毒的初步研究

目的建立套式聚合酶链反应（ＰＣＲ）加限制性酶切分析方法检测人巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）。方法在ＨＣＭＶ直接早期蛋白ＥｃｏＲＩＪＤＮＡ片段内，自行设计两对引物，建立套式ＰＣＲ检测ＨＣＭＶＤＮＡ，同时结合病毒分离检测临床标本。结果２３例新生儿肝炎综合征患儿中，１０例病毒分离及套式ＰＣＲ均阳性；１例病毒分离阴性，但套式ＰＣＲ阳性。对５８例妊娠早期孕妇血标本进行检测，套式ＰＣＲ阳性率为９％，病毒分离阳性率则为７％。结论套式ＰＣＲ加限制性酶切分析是一种临床检测ＨＣＭＶ的快速有效手段，值得临床推广。     

巢式聚合酶链反应技术在流感嗜血杆菌b型检测中的应用

目的评价巢式聚合酶链反应（nested—PCR）技术在b型流感嗜血杆菌（Hib）检测中的应用价值，估计氨苄西林耐药Hi中b型的比率。方法对2000-2003年北京、上海、广州细菌监测项目中，呼吸道感染儿童鼻咽部分离培养的899株Hi，用E试验法检测氨苄西林耐药情况后，用nested-PCR与玻片凝集法对氨苄西林耐药菌株进行b型检测。结果检出74株氨苄西林耐药Hi。nested—PCR与玻片凝集法检测Hib的结果一致，74株氨苄西林耐药Hi中有2株为Hib，约占2．7％。结论nested—PCR b型荚膜检测方法可作为玻片凝集法的一个重要补充。3地4年内呼吸道感染的儿童鼻咽部携带的氨苄西林耐药Hi中，Hib的比率处于相对较低的水平。     

巢式聚合酶链式反应检测脑脊液标本中病原体的方法评价

目的探讨巢式聚合酶链式反应(PCR)检测脑脊液标本中病原体的可行性,为疾病的快速临床诊断提供参考。方法源自细菌16S rRNA基因序列设计的巢式PCR技术方法,包括2对引物,2次PCR扩增,第1对引物首次PCR扩增脑脊液标本提取的核酸DNA,第2对引物再次PCR扩增,其DNA模板为第1轮PCR扩增产物。将第2轮PCR扩增产物进行测序,对序列进行比对分析,从而确定感染的病原体。使用DNA微量分光光度测定布鲁氏菌纯菌核酸DNA,将DNA进行倍比稀释,用于巢式PCR敏感性测试。结果巢式PCR能够检测的最低限约为1个核酸DNA拷贝数。应用巢式PCR检测40份临床患者的脑脊液标本,扩增结果表明有37份标本获得约1 460 bp的预期扩增条带(不同细菌扩增片段有差异),测序比对结果显示,检出脑膜炎奈瑟菌7份、产碱假单胞菌1份、草假单胞菌22份、嗜麦芽窄食单胞菌2份、肺炎链球菌1份、未知细菌性病原体4份、未检出3份。结论巢式PCR能够快速检测与鉴定脑脊液标本中的细菌性病原体。     

B-cell clonality determination using an immunoglobulin kappa light chain polymerase chain reaction method

To augment the detection of clonality in B-cell malignancies, we designed a consensus primer kappa light chain gene (Igkappa) polymerase chain reaction (PCR) assay in combination with a consensus primer immunoglobulin heavy chain gene (IgH) PCR assay. Its efficacy was then evaluated in a series of 86 paraffin tissue samples comprising neoplastic and reactive lymphoproliferations. Analysis after PCR was accomplished by 10% native polyacrylamide gel electrophoresis after heteroduplex pretreatment of PCR products and by a post-PCR chip-based capillary electrophoresis analytic method. Overall, 49 of 68 (72%) of mature B-cell neoplasms yielded discrete Igkappa gel bands within the predicted size range with no clonotypic Igkappa products observed among reactive lymphoid or T-cell proliferations. The application of Igkappa PCR improved overall sensitivity from 81% with IgH PCR alone to 90% with combined Igkappa/IgH PCR, with this effect being most notable in germinal center-related lymphomas. Sequencing of positive Igkappa rearrangements revealed that most rearrangements involved members of the Vkappa1 (40%) and Vkappa2 (34%) gene families along with Jkappa1 (26%), Jkappa2 (23%), and Jkappa4 (51%) gene segments. Involvement of Vkappa pseudogenes was identified in 24% of cases with Vkappa-KDE rearrangements. Our results demonstrate the efficacy of Igkappa PCR in improving the detection rate of clonality in B-cell neoplasms and further introduce a novel post-PCR chip-based capillary electrophoresis analytic method for rapid PCR fragment size evaluation.     

Amplification of human genomic DNA sequences with polymerase chain reaction using a single oligonucleotide primer

We present two examples of exponential nucleic acid amplification with the polymerase chain reaction (PCR) in the presence of only one amplification primer. Cloning and sequencing of the PCR products generated by amplification of human genomic DNA revealed that the amplified sequence contained only one primer and its complement, at the two ends of the PCR product. Although these experiments were performed with primers derived from the sequence of the prostate specific antigen (PSA) gene and the normal epithelial cell-specific 1 gene (NES1), the amplified sequences were novel and had no homology with either PSA or NES1 DNA. While both PSA and NES1 genes reside on chromosome 19q13.3-q13.4, the amplified sequences were found by mapping to reside on chromosome 5q12 and 5p15.1-p15.3, respectively. When we examined the mechanism of amplification by PCR using one primer in these two cases, we found that there was a high homology between the PSA primer or the NES1 primer and the two regions flanking the amplified sequence of chromosome 5q12 or 5p15. This indicated that the single PSA or NES1 primer could anneal on both strands of the DNA of that region, and mediate the exponential amplification. Since this phenomenon occurred to us twice with a limited number of different PCR reactions performed in our laboratory (< 20), we believe that it may represent a common artifact of PCR. Moreover, it appears that the palindromic primer binding sites can anneal to each other forming DNA cruciforms.     

逆转录套式聚合酶链反应检测庚型肝炎病毒

目的建立敏感、特异的逆转录套式聚合酶链反应（ＲＴ－ｎｅｓｔｅｄ－ＰＣＲ）方法，以检测中国人庚型肝炎病毒（ＨＧＶ）感染。方法根据中国人感染ＨＧＶ者ＮＳ５区部分核苷酸序列分析结果，设计套式ＰＣＲ引物，用于ＨＧＶＲＮＡ的检测，并与用国外报道引物所作的一次ＰＣＲ和套式ＰＣＲ检测结果进行比较。结果共检测标本１３３份。以国外报道引物作一次ＰＣＲ和套式ＰＣＲ检出率分别为８．３％和１１．３％，作者建立的套式ＰＣＲ检出率为１８．０％，对部分ＰＣＲ产物进行序列分析证实为ＨＧＶ特异性基因。结论建立的方法可在中国人群中显著提高ＨＧＶＲＮＡ检出率。