pEGFP-C1/Akt体外转染骨髓间充质干细胞后对血管内皮生长因子表达的影响

目的 克隆构建绿色荧光蛋白(GFP)-Akt表达载体,观察其在鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)中的表达和定位及其对(VEGF)mRNA和蛋白表达的影响.方法 采用酶切法将Akt重组于GFP表达载体pEGFP-C1中,经酶切序列鉴定后,将该重组质粒GFP-Akt及GFP空质粒通过脂质体法转染骨髓MSCs.荧光显微镜观察其转染率及在细胞中分布.分别采用用Western blot和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测pEGFP-C1和pEGFP-C1/Akt转染MSCs后蛋白和VEGF mRNA的表达.结果 GFP-Akt基因表达载体经酶切鉴定和测序分析确认构建成功,并在鼠MSCs中表达.荧光显微镜下pEGFP-C1转染后,绿色荧光均匀分布于细胞中,而pEGFP-C1/Akt转染后,绿色荧光分布于胞质中;与未转染组比较,pEGFP-C1转染组Akt mRNA和蛋白及VEGF mRNA和蛋白表达差异无统计学意义(P＞0.05);而pEGFP-C1/Akt转染组Akt mRNA和蛋白及VEGF mRNA和蛋白表达显著增加(P＜0.05).结论 成功构建GFP-Akt融合基因表达载体在鼠MSCs中表达;并可诱导AktmRNA及蛋白和VEGF mRNA和蛋白的表达.     

SCF对体外转染pEGFP-C1/Akt的骨髓间充质干细胞中c-kit、Akt及VEGF表达的影响

目的克隆构建绿色荧光蛋白（GFP）／Akt表达载体，观察其在鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）中的表达和定位，并探讨干细胞因子（SCF）通过PI3-Akt途径对转染pEGFP-C1／Akt的MSCs中c-kit、Akt和VEGF mRNA及蛋白表达的影响。方法采用酶切法将Akt重组于GFP表达载体中，经酶切序列鉴定后，将该重组质粒GFP／Akt及GFP空质粒通过脂质体转染骨髓MSCs；荧光显微镜观察其转染及在细胞中的分布；分别采用Western blot和反转录多聚酶链反应（RT-PCR）方法检测pEGFP-C1和pEGFP-C1／Akt转染MSCs后对c-kit、Akt及VEGF mRNA和蛋白表达的影响，pEGFP-C1／Akt转染MSCs后不同浓度SCF对c-kit、Akt及VEGF mRNA和蛋白表达的影响。结果GFP／Akt基因表达载体经酶切鉴定和测序分析后确认构建成功，并在MSCs中表达。荧光显微镜下见pEGFP-C1转染后，绿色荧光均匀分布于整个细胞中；pEGFP-C1／Akt转染后，绿色荧光分布于细胞质中。与pEGFP-C1组相比较，pEGFP-C1／Akt转染组Akt及VEGF的mRNA和蛋白表达均明显增强（P〈0．05），c-kit mRNA和蛋白表达则无明显变化（P〉0．05）。加入SCF后其能增强实验组（SCF＋pEGFP-C1／Akt）和对照组（SCF＋pEGFP-C1）中c-kit、Akt及VEGF的mRNA和蛋白表达，并且随着SCF的浓度增高该作用则越明显（P〈0．05）；与对照组相比较，实验组c-kit mRNA和蛋白的表达无明显变化（P〉0．05），而Akt和VEGF mRNA和蛋白表达则明显增强（P〈0．01）。结论成功构建GFP／Akt融合基因表达载体在MSCs中表达，可诱导Akt及VEGF mRNA和蛋白的表达；SCF可能通过PI3／Akt途径刺激c-kit、Akt及VEGF mRNA和蛋白的表达。     

转基因的骨髓间充质干细胞治疗大鼠缺血皮瓣

目的探讨转染血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因的大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)同种异体移植促进缺血皮瓣的血管新生,从而提高皮瓣存活率的可能性。方法体外分离、培养、鉴定SD大鼠MSCs,PcDNA3.1(-)/VEGF165质粒转染MSCs,免疫荧光方法检测MSCs体外表达VEGF的情况,CM-DiI标记MSCs。SD大鼠随机分3组:A组[PcDNA3.1(-)/VEGF165质粒转染的MSCs移植]、B组(单纯MSCs移植)、C组(DMEM-F12培养基)。每只大鼠背侧皮下按组分别注射细胞悬液和培养基,注射后ELISA法连续检测大鼠血浆VEGF浓度,注射后第4天掀起1个蒂在尾侧的9 cm×2 cm的随意皮瓣。在术后第14天分别观察皮瓣的存活率、激光多普勒血液监测仪监测血流灌注、CD34免疫组织化学检测皮瓣毛细血管密度、荧光显微镜检测MSCs在皮瓣内的分布和存活状况。结果转染VEGF165基因的MSCs体外和体内检测均高表达VEGF165蛋白。A、B、C三组的皮瓣存活率分别为(83.1±2.6)%、(66.4±6.1)%、(51.5±7.5)%(P< 0.05);A、B、C三组的毛细血管密度(条/mm2)分别为:89.2±6.1、57.1±4.7、28.7±2.8(P< 0.05);血流灌注比值A组高于B、C两组,B组高于C组(P<0.05);转染VEGF165基因的MSCs移植SD大鼠皮瓣后,MSCs存活并参与血管新生。结论转染VEGF基因的大鼠MSCs体外培养后异体移植可促进缺血皮瓣的血管新生,提高存活率。     

VEGF基因体外转染大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究

目的:探讨脂质体介导血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因转染大鼠骨髓间充质干细胞(MSCS)应用于基因治疗的可行性、安全性。方法:体外分离、培养、鉴定MSCs,PcDNA3.1(-)/VEGF165质粒转染MSCs,转染后用免疫荧光和ELISA检测MSCs表达VEGF蛋白的情况,MTT检测MSCs对VEGF质粒转染的敏感性。结果:骨髓中分离得到MSCs,流式细胞检测显示MSCs不表达CD34和CD45,但表达CD90。透射电镜观察可见细胞浆中含大量粗面内质网和分泌颗粒。VEGF基因转染MSCs后第5天抗VEGF免疫荧光染色约90%的MSCs呈阳性,ELISA检测结果显示PcDNA3.1(-)/VEGF165质粒转染组细胞培养上清液中VEGF含量明显高于对照组,并于转染后第5天达到峰值。MTT检测结果显示VEGF质粒转染对MSCs增殖无影响。结论:MSC可作为VEGF基因转染的靶细胞用于基因治疗。     

人碱性成纤维细胞生长因子基因转染大鼠骨髓间充质干细胞的研究

目的 观察人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)基因体外转染对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)bFGF表达的影响.方法 密度梯度离心、贴壁法培养分离SD雄性大鼠MSCs,体外扩增,流式细胞仪检测MSCs表面抗原表达.利用慢病毒载体系统介导将具有人源性bFGF基因转染至第2代MSCs,在倒置荧光显微镜下观察转染后细胞形态和生长的变化,应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot法鉴定bFGF在MSCs中的表达.结果 密度梯度离心、贴壁法培养分离可获得MSCs,P3代大鼠细胞利用流式细胞仪检测CD11b/c阳性细胞表达率为(13.2±0.6)%,CD34阳性细胞表达率为(1.2±0.5)%,CD44阳性细胞表达率(97.8±0.9)%,CD90阳性细胞表达率(96.8±1.4)%.MSCs转染48 h后,绿色荧光蛋白的表达明显增强.RT-PCR证实转基因MSCs表达bFGF mRNA明显增强,Western blot检测证实转基因MSCs在49 KDr出现特异性条带,而空白和空载组的MSCs则未见阳性条带.结论 采用慢病毒介导的基因转染技术可以将bFGF基因转染至MSCs中,并有外源性bFGFmRNA和蛋白的有效表达,MSCs可作为bFGF基因治疗的载体.     

体外Akt基因转染对骨髓间充质干细胞葡萄糖转运载体-4表达和易位的影响

目的探讨葡萄糖转运载体(GLUT)-4是否参与骨髓间充质干细胞(MSCs)的葡萄糖转运以及Akt基因转染提高MSCs耐缺氧能力是否与GLUT-4易位和表达有关。方法将经Akt基因转染和未转染的MSCs均行常氧(5%CO2)和缺氧(94%N2、1%O2和5%CO2)37℃孵育8 h。放射同位素法检测氚标-脱氧葡萄糖(3H-G)的摄取量,免疫细胞化学染色、Western blot和RT-PCR分别检测GLUT-4的蛋白质和mRNA表达。结果①缺氧转染组的3H-G摄取量是缺氧非转染组的(1.39±0.13)倍(P0.05),但仍低于常氧非转染组(P0.05)。②MSCs在常氧或缺氧、Akt基因转染或无转染的条件下均可表达GLUT-4蛋白。与常氧非转染组比较,缺氧非转染组GLUT-4 mRNA和蛋白的表达水平明显降低(P0.05)。③与缺氧非转染组比较,缺氧转染组的GLUT-4 mRNA〔(1.756±0.152)倍〕和蛋白〔细胞总GLUT-4蛋白(1.653±0.312)倍,细胞膜GLUT-4蛋白(2.041±0.258)倍〕的表达水平明显提高(P0.05),且GLUT-4蛋白易位明显;但与常氧非转染组比较,其GLUT-4 mRNA和蛋白的表达水平仍较低(P0.05)。④MSCs的3H-G摄取量与细胞膜中GLUT-4蛋白的表达呈正相关(r=0.415,P=0.001)。结论GLUT-4可能参与MSCs的葡萄糖转运,Akt基因提高MSCs耐缺氧能力可能与提高GLUT-4的表达和易位有关。     

血管内皮生长因子基因转染骨髓间充质干细胞移植于梗塞心肌的实验研究

目的 探讨骨髓间充质干细胞（MSCs）移植联合血管内皮生长因子（VEGF）基因转染对大鼠梗塞心肌组织的修复重建、血管再生及梗塞后心功能的影响。方法 体外分离、培养、纯化SD大鼠的MSCs，以BrdU标记MSCs，腺病毒介导VEGF基因转染MSCs。建立大鼠急性心肌梗死模型4周后，随机分为4组（每组10只），分别行梗塞心肌内注射：转染VEGF基因的MSCs移植组（组Ⅰ）、单纯MSCs移植组（组Ⅱ）、单纯VEGF基因治疗组（组Ⅲ）和以注射无血清IMDM培养液为对照组（组Ⅳ）。移植4周后观察移植细胞的分化和新生血管的形成，并通过超声多普勒检测心功能变化。结果 组Ⅰ和组Ⅱ中，梗塞心肌处可见BrdU标记的移植细胞，cTnT染色阳性。超声心动图检查发现，组Ⅰ和组Ⅱ的左室射血分数（LVEF）的改善显著高于对照组（P均〈0．01），而组Ⅰ的LVEF改善程度要明显高于组Ⅱ；部分BrdU染色阳性的细胞可以分化成为内皮细胞，参与构成了梗塞区域的新生毛细血管。相对于对照组，组Ⅰ和组Ⅲ都有明显的血管新生（P均〈0．01）。结论 MSCs移植联合VEGF基因转染可以通过促进心肌再生和新生血管的形成来重建缺血心肌，显著改善心功能。     

重组pcDNA3.1-hBMP-2转染人骨髓基质干细胞和对其增殖及血管内皮生长因子表达的影响

目的构建人骨形成蛋白-2(hBMP-2)真核表达载体pcDNA3.1-hBMP-2,转染人骨髓基质干细胞(MSCs),探讨基因转染对其增殖和血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响. 方法利用重组DNA和基因克隆技术构建重组载体pcDNA3.1-hBMP-2;细胞培养和基因转染技术体外转染人MSCs;免疫细胞化学、原位杂交和蛋白印迹法检测细胞BMP-2的表达;通过流式细胞仪和VEGF探针原位杂交分析其对细胞增殖和VEGF表达的影响. 结果转染后细胞在mRNA水平和蛋白质水平均表达BMP-2;转染后S期细胞比例增多,提示细胞DNA的合成增加;BMP-2基因转染上调细胞VEGF的表达. 结论在脂质体介导下,pcDNA3.1-hBMP-2转染MSCs获得成功.基因转染后能促进细胞增殖并将通过使VEGF的表达增加促进血管再生,为进一步骨缺损的基因治疗及构建组织工程骨奠定了实验基础.     

无血清条件对诱导转染pEGFP-C1/Akt的骨髓间充质干细胞凋亡的影响

目的探讨无血清条件对诱导pEGFP-C1/Akt转染的骨髓间充质干细胞（MSCs）凋亡的影响。方法实验分实验组（pEGFP-C1/Akt转染MSCs）、抑制组（pEGFP-C1/Akt转染MSCs＋PI3K/Akt特异性抑制剂）和对照组（MSCs）。在无血清培养基条件下,分别在4、12、24和36h共4个时间点利用RT-PCR检测Akt及Caspase-3mRNA表达,Western blot检测Akt蛋白表达,免疫组化检测Caspase-3蛋白表达,流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果在无血清培养4、12、24和36h后,实验组的Akt mRNA和蛋白的表达均高于抑制组及对照组（P〈0.01）,Caspase-3mRNA及蛋白的表达水平和细胞凋亡率则均低于抑制组及对照组（P〈0.01）;抑制组及对照组间Akt和Caspase-3mRNA及蛋白的表达和凋亡率的差异无统计学意义（P〉0.05）。结论Akt可能通过PI3K/Akt途径抑制其下游底物Caspase-3的表达,从而抑制无血清诱导的MSCs凋亡。     

人血管内皮细胞生长因子基因转染大鼠骨髓间充质干细胞对脂肪颗粒移植存活率的影响

目的 检测大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)经人血管内皮细胞生长因子(VEGF165)基因转染后,对脂肪颗粒移植存活率的影响.方法　利用FuGENE HD介导VEGF165基因体外转染SD大鼠BMSCs,与取自SD大鼠的脂肪组织混合后移植于大鼠背部,类似方法设立未转染组及DMEM液空白对照组.检测脂肪组织存活率及再生血管密度.结果　转染组存在外源性基因和蛋白的表达,脂肪组织存活率及再生血管密度高于未转染组,且两者均高于对照组.结论　转染VEGF165基因的BMSCs具有更强的促血管再生作用,可提高游离移植脂肪的存活率.     

胫骨干骨折的手术治疗对策

目的：明确不同固定器械在胫骨干不同骨折类型固定中的特点，以指导临床应用。方法：68例胫骨干骨折，行加压钢板螺钉、交锁髓内钉、单侧外固定架固定后，作临床疗效分析。结果：加压钢板固定组42例，感染5例，骨不连1例，平均愈合时间3．8个月；交锁髓内钉固定组13例，无感染及骨不连，平均愈合时间5．4个月；单侧外固定架组13例，骨不连1例，踝关节背伸受限3例，平均愈合时间4．5个月。结论：胫骨骨折交锁髓内钉固定并发症少，功能恢复好，适用范围广，但要注意及时进行动力加压。加压钢板及外固定架固定应选择各自的最佳适应证，以达到理想的疗效。     

不同方法重建指尖离断静脉回流的疗效分析

目的：探讨不同方法重建指尖离断静脉回流的疗效。方法：2008年3月-2013年2月收治指尖离断患者80例,38例吻合指侧方静脉重建回流,术中吻合动静脉比例1：1或1：2或2：2,平均1：2;22例吻合指腹静脉重建回流,术中吻合动静脉比例1：1;20例未吻合静脉,术中仅吻合1条动脉,行侧切口或甲床放血。观察各组治疗效果。结果：吻合指侧方静脉组手指全部成活,无一例发生回流障碍;吻合指腹静脉组19例发生静脉危象,其中4例手指坏死;未吻合静脉组20例均发生回流障碍,其中6例手指坏死。58例获随访,随访时间6~28个月。吻合指侧方静脉组32例,指尖外形佳、指腹饱满;吻合指腹静脉组14例,指体轻度萎缩,指甲生长不平整;未吻合静脉组12例,指体萎缩明显。吻合指侧方静脉组指甲生长近平整,长度长于其他两组[（14.4±3.2）mm比（12.5±2.3）mm和（12.2±2.2）mm],远侧指间关节活动度大于其他两组[（63±5）°比（48±3）°和（45±7）°],两点分辨觉小于其他两组[（4.6±0.4）mm比（7.1±1.2）mm和（7.3±0.6）mm],感觉级别高于其他两组[S（3.45±0.39）级比S（2.57±0.42）级和S（2.55±0.49）级],差异均具有显著性（P〈0.05）。吻合指腹静脉组和未吻合静脉组在指甲长度、运动和感觉方面差异无统计学意义（P〉0.05）。结论：吻合指侧方静脉能有效解决指尖再植静脉回流问题,可避免回流障碍,成活率高,促进指甲生长,可恢复 DIPJ 活动度及感觉。