冻存时间对复苏后胚胎大鼠神经干细胞体外诱导向多巴胺能神经元分化的影响

目的:观察应用10%牛血清白蛋白 20%二甲基亚砜联合低温保护剂冷冻保存不同时间的胚胎大鼠中脑神经干细胞复苏后,其体外诱导分化成多巴胺能神经元的能力。方法:实验于2004-02/2005-10在中山大学附属第一医院完成。①应用克隆细胞法在含细胞因子表皮生长因子及碱性成纤维细胞生长因子的无血清培养液中单细胞克隆培养胚胎大鼠中脑神经干细胞。②经传代扩增后,培养于含10%牛血清白蛋白和20%二甲基亚砜的神经干细胞冻存液中,在液氮中分别冷冻保存6,12,及18个月后,重新复苏培养于神经干细胞培养液中,并在含白细胞介素1α、白细胞介素11、白血病抑制因子、胶质细胞源性神经营养因子的诱导分化液中诱导向多巴胺能神经元分化。③分化细胞分别进行免疫细胞化学鉴定和流式细胞仪检测。结果:①胚胎大鼠中脑神经干细胞单细胞克隆系经冷冻复苏后,除少数细胞贴壁死亡外,多数细胞生长良好并克隆形成新的神经干细胞球。②神经干细胞球经诱导分化后,免疫细胞化学染色显示分化细胞中含有胶质纤维酸性蛋白、微管相关蛋白2及酪氨酸羟化酶染色阳性细胞。③流式细胞仪检测冻存6,12,18个月及未冻存组神经干细胞诱导分化的酪氨酸羟化酶染色阳性细胞的分化率分别为(15.3±3.4)%,(16.2±1.8)%,(15.6±2.2)%,(16.7±2.8)%,方差分析显示各组间差异无显著性(F=1.799,P>0.05)。结论:冷冻保存18个月的胚胎大鼠中脑神经干细胞不影响其体外诱导分化成多巴胺能神经元的能力。     

胚胎干细胞向多巴胺能神经元的诱导分化调控

中脑多巴胺能神经元在自主运动、情绪行为及认知方面发挥了重要作用,这类神经元的缺失是帕金森病（Parkinson’s disease,PD）的发病基础。胚胎干细胞（embryonic stem cell,ESC）可在体外无限增殖并向多巴胺能神经元分化,被认为是PD细胞替代治疗的重要细胞来源,从而成为近几年来的研究热点。本文就多巴胺能神经元的体内发育调控和诱导非人类及人类ESC向多巴胺能神经元分化主要方法的研究进展作一介绍,并讨论其中存在的问题。     

诱导时间对体外培养大鼠神经干细胞向多巴胺能神经元分化的影响

背景:近年来通过筛选不同细胞因子的诱导分化作用发现,某些特定的细胞因子配伍可明显诱导中脑神经干细胞体外定向分化成多巴胺能神经元,研究还发现神经干细胞体外诱导分化的多巴胺能神经元可以有效应用于移植治疗帕金森病,为提高其体内移植的疗效,目前迫切需要深入研究神经干细胞诱导分化的生物学特性.目的:探讨大鼠神经干细胞在分化液中诱导不同时间后,其体外分化成多巴胺能神经元的效应.设计:单一样本观察.单位:中山大学附属第一医院神经外科.材料:实验于2007-05/10在中山大学附属第一医院完成,选择清洁级孕14 d的健康SD大鼠6只,体质量350-400 g,由中山大学动物实验中心提供(许可证号码SCXK(粤)2007-0034).实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.方法:①在含表皮生长因子及碱性成纤维细胞生长因子的无血清培养液中培养胚胎大鼠中脑神经干细胞.②经传代扩增后,在含白细胞介素1α、白细胞介素11、白血病抑制因子、胶质细胞源性神经营养因子的诱导分化液中向多巴胺能神经元分化.③诱导分化2,4,6,8,10 d后,流式细胞仪检测分化细胞中酪氨酸羟化酶阳性细胞的比值.主要观察指标:①大鼠神经干细胞诱导分化后细胞形态的变化.②诱导不同时间的大鼠神经干细胞分化成酪氨酸羟化酶阳性细胞的比值.结果:在诱导分化液中大鼠中脑神经干细胞球呈贴壁生长,球形结构开始塌陷,球内细胞从球体中央逐渐向四周分化扩展出较多形态各异的细胞,分化6 d后,多数细胞已生长出一两个长突起及多个短突起.免疫细胞化学显示分化的细胞中含有酪氨酸羟化酶染色阳性细胞,流式细胞仪检测诱导分化2,4,6,8,10 d的分化细胞中酪氨酸羟化酶染色阳性细胞的比例分别为(3.2±0,9)%,(6.8±1.6)%,(16.7±2.6)%.(14.8±1.8)%,(12.2±2.5)%,各组间差异有显著性意义(F=26.449.P＜0.05).结论:诱导时间对大鼠中脑神经干细胞体外分化成多巴胺能神经元的能力存在影响,诱导6 d的神经干细胞分化成多巴胺能神经元的比例最高.     

大鼠胚胎神经干细胞体外分化时间的特异性

背景：目前对于神经干细胞体外培养过程中神经干细胞自身分化特性的变化研究的较少。目的：观察大鼠胚胎神经干细胞体外分化的时间特异性。方法：利用无血清悬浮培养的方法分离培养大鼠胚胎皮质神经干细胞,取不同培养时间的神经干细胞进行诱导分化,检测其分化特性的改变。结果与结论：体外培养的神经干细胞早期分化以神经元为主,随着培养时间的增加,分化成神经元的比例下降,神经胶质细胞的比例增加,而神经干细胞分化成少突胶质细胞的潜能与培养时间无明显相关。提示体外培养的神经干细胞其分化成神经元的潜能随着培养时间的增加而降低,而分化成神经胶质细胞的潜能随培养时间的增加而增加,神经干细胞分化为少突胶质细胞的潜能无时间相关性。     

胚胎大鼠脊髓神经干细胞体外培养向胆碱能神经元的分化

目的在一定条件下对胚胎大鼠脊髓神经干细胞进行体外培养与诱导,观察其向胆碱能神经元的分化情况,并进行鉴定。方法选取孕龄17 d的Wistar大鼠5只,利用胚胎大鼠进行脊髓源神经干细胞分离与培养,并进行神经上皮干细胞蛋白(Nestin)的细胞免疫荧光鉴定。对神经干细胞进行胆碱能神经元定向诱导分化,对照组为单纯诱导培养基,其余各组以诱导培养基为基础,添加生长因子,分为维甲酸(RA)组、音猬因子(SHH)组、SHH+神经营养因子-3(NT-3)组、SHH+RA组,每组1只。细胞诱导分化14 d后,进行细胞免疫荧光染色,观察各组胆碱乙酰转移酶(ChAT)阳性细胞比率与细胞分化情况。结果经诱导分化后,神经干细胞向胆碱能神经元进行分化。培养14 d,大部分神经细胞从神经干细胞球中央迁出,神经细胞间突起发生交错,呈现出网状结构。经免疫荧光检测,可观察到细胞胞质呈现出红色荧光。对照组未发现Ch AT阳性细胞,SHH、RA诱导组可观察到少量的Ch AT阳性细胞,SHH+NT-3组和SHH+RA组则可以观察到较多的Ch AT阳性细胞。经统计学比较,SHH+NT-3组和SHH+RA组Ch AT阳性细胞比率均显著高于对照组、RA组、SHH组,差异均具有统计学意义(P 0.05),且SHH+NT-3组和SHH+RA组组间比较,对照组、RA组、SHH组两两比较,差异均无统计学意义(P 0.05)。结论在添加一定生长因子的条件下对胚胎大鼠脊髓神经干细胞进行体外培养,可以诱导其向胆碱能神经元分化。     

脉冲强磁场诱导体外新生大鼠神经干细胞向神经元方向分化

目的探讨脉冲强磁场对体外新生大鼠神经干细胞（NSCs）向神经元方向分化的作用。 方法体外分离培养新生3d内的SD大鼠脑室下区的NCSs,无血清培养14d后,随机分为实验组和对照组。实验组置于脉冲强磁场条件下用前期探索的促增殖参数（0.1Hz、4T、8次）进行干预,每次脉冲放电20ms。对照组置于相同条件下但不做干预处理。干预后第1天,采用10%胎牛血清诱导贴壁分化,显微镜下观察不同时间段细胞形态学变化;贴壁分化后第7天,通过免疫荧光染色、蛋白免疫印迹法（Western Blot）及实时定量聚合酶链反应技术(RT-PCR)检测NCSs分化后第7天神经元βⅢ微管蛋白（TUJ1）及星形胶质细胞相关特异性标志神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达。 结果干预后,免疫荧光染色示实验组TUJ1阳性细胞数为（33.4±5.1）%,较对照组［（26.5±7.0）%］明显增多(P<0.05),实验组的GFAP阳性细胞率［（23.9±5.0）%］较对照组［（36.2±2.2）%］明显减少 (P<0.05)。RT-PCR检测显示,实验组TUJ1的mRNA表达量是对照组的（1.682±0.086）倍,GFAP的mRNA相对表达量是对照组的（0.590±0.157）倍,且组间差异有统计学意义(P<0.05)。Western Blot检测结果与RT-PCR检测一致,实验组TUJ1蛋白表达较对照组增多,GFAP蛋白表达较对照组减少。 结论脉冲强磁场具有促进NCSs向神经元分化,并抑制其向星形胶质细胞分化的作用。     

体外诱导脂肪基质干细胞向多巴胺能神经元的分化

背景:鉴于脂肪干细胞具有来源丰富、取材简便、易分离纯化和扩增、可进行自体移植并有多项分化潜能等特点,有学者认为其可作为治疗帕金森病的种子细胞来源。目的:观察大鼠脂肪基质干细胞体外向多巴胺能神经元诱导分化及分泌功能。方法:利用胶原酶消化法获得SD大鼠脂肪干细胞,体外培养至第3代时用碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和抗坏血酸联合诱导作为实验组,以单纯加入体积分数5%血清为对照组。结果与结论:实验组诱导3d后,免疫荧光法和免疫组织化学法均可检测到诱导后的细胞表达酪氨酸羟化酶。实验组分化出多巴胺能神经元比例显著高于对照组(P<0.01)。ELISA法检测实验组连续诱导3d上清中有多巴胺分泌,诱导的第一二天中多巴胺浓度呈上升趋势,第3天有所下降。说明脂肪干细胞具有向多巴胺能神经元分化的能力。     

不同胎龄大鼠神经干细胞体外诱导向多巴胺能神经元分化的比较

背景:胚胎来源干细胞的分化潜能不仅受到诱导条件影响,也受来源胚胎胚龄的影响.目的:实验拟观察不同胎龄大鼠中脑神经干细胞体外诱导向多巴胺能神经元分化能力.设计:随机对照观察.单位:中山大学附属第一医院神经外科.材料:实验于2007-03/2007-09在中山大学附属第一医院实验室完成.成年孕SD大鼠30只,体质量350～400 g,由中山大学动物实验中心提供.许可证号码为SCXK(粤)2007-0034.实验过程中对动物处置符合动温桌硌П曜?DMEM/F12无血清培养液、B27添加剂、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、体积分数为0.1的胎牛血清为英国Gibco公司产晶;白细胞介素1α,白细胞介素11、胶质细胞源性神经营养因子购自美国R&D公司:白血病抑制因子购自英国PEPROTECH公司:酪氨酸羟化酶抗体购自美国Santa Cruz公司;巢蛋白抗体、微管相关蛋白2抗体及胶质纤维酸性蛋白抗体为美国CHEMICON公司产品.方法:①分别于大鼠孕10,12,14,16,18天摸球法随机选取6只,麻醉后处死孕鼠,无菌条件下剖腹取胚胎,分离中脑腹侧脑组织进行神经干细胞培养.在含表皮生长因子及碱性成纤维细胞生长因子的无血清培养液中分别培养不同胎龄大鼠脑神经干细胞,经传代扩增后,在含白细胞介素1α、白细胞介素11、白血病抑制因子、胶质细胞源性神经营养因子的诱导分化液中向多巴胺能神经元分化.②诱导分化6 d后观察分化细胞生长情况并进行免疫细胞化学鉴定:酪氨酸羟化酶染色标记后通过流式细胞仪检测分化的多巴胺能神经元比率.主要观察指标:①不同胎龄大鼠神经干细胞诱导分化后生长情况及免疫细胞化学鉴定结果.②神经干细胞诱导分化后酪氨酸羟化酶染色阳性细胞的比率.结果:①孕10,12,14,16,18 d胚胎大鼠中脑神经干细胞球在诱导分化液中贴壁生长,球内细胞从球体中央逐渐向外呈放射状生长,分化6天的细胞多数有1～2个长突起或有多个短突起.神经球经巢蛋白免疫细胞化学染色,大部分细胞胞浆染色呈阳性.②孕10,12,14,16,18 d胚胎大鼠中脑神经干细胞在诱导分化液中培养6 d后.流式细胞仪检测其诱导分化成酪氨酸羟化酶阳性细胞的比率分别为(10.3±2.5)%,(21.6±3.4)%,(16.7±2.8)%,(14.2±3.2)%,(8.9±1.8)%,各组间比较差异均有显著性意义(P<0.05),其中孕12 d大鼠中脑神经干细胞诱导分化成多巴胺能神经元比例最高.结论:不同胎龄大鼠中脑的神经干细胞体外诱导向多巴胺能神经元分化的能力不同,以孕12 d诱导分化成多巴胺能神经元比例最高.     

抗坏血酸诱导新生鼠神经干细胞向多巴胺能神经元的分化

背景:针对帕金森病进行细胞移植治疗的研究进程中,除寻求合适的细胞系外,如何将各种有分化潜能的细胞诱导为含量丰富、有功能的多巴胺能神经元尤为关键.目的:观察不同浓度抗坏血酸对神经干细胞向多巴胺能神经元分化的影响.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-01/12在广西医科大学科学实验中心完成.材料:清洁级新生24 h内SD大鼠30只,由广西医科大学实验动物中心提供.抗坏血酸为Sigma产品.方法:取新生鼠脑组织,组织块胰蛋白酶消化法体外分离培养神经干细胞,传至第2代以5×108L-1密度接种.设立4组:空白对照组不给予抗坏血酸,仅加入含体积分数为10%的胎牛血清、2%B27的DMEM/F12培养基;剩余3组在此基础上分别加入50,100,200 μmol/L抗坏血酸进行诱导,10 d后终止诱导.主要观察指标:RT-PCR检测诱导后细胞酪氨酸羟化酶基因mRNA的表达,免疫细胞化学染色鉴定神经干细胞,检测神经干细胞向多巴胺能神经元分化率.结果:各浓度抗坏血酸诱导组均得到795 bp的扩增片断,即均表达酪氨酸羟化酶mRNA.神经球具有自我更新和表达巢蛋白的能力,诱导分化后的细胞能表达神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞特异性抗原.与空白对照组比较,50,100,200 μ mol/L抗坏血酸诱导组酪氨酸羟化酶阳性细胞率均明显升高(P<0.05);且100,200 μ mol/L抗坏血酸诱导组升高幅度明显高于50 μ mol/L(P<0.05),100,200 μ mol/L抗坏血酸诱导组间比较无明显差异(P>0.05).结论:从新生鼠脑组织分离出的神经干细胞在体外具有自我更新、多向分化潜能及表达巢蛋白的能力.50～200 μ mol/L抗坏血酸均能促进神经干细胞向多巴胺能神经元分化,抗坏血酸浓度从100 μmol/L增加至200 μmol/L时酪氨酸羟化酶阳性细胞率无明显变化.     

维甲酸诱导胚胎大鼠脑海马神经干细胞向神经元的分化

背景:目前认为直接进行神经干细胞移植后细胞虽能存活,但是只分化成神经胶质细胞,并不能分化成有功能的神经元.目的:探讨维甲酸诱导对胚胎大鼠脑海马神经干细胞向神经元分化的作用.设计、时间及地点:细胞学体外实验,于2008-09/2009-02在辽宁医学院科技实验楼完成.材料:胚龄13.5 d的SD大鼠由辽宁医学院实验动物中心提供.方法:分离胎鼠脑海马组织,胰蛋白酶消化法体外培养获得神经干细胞.将原代和传代细胞以1×107L-1接种到培养孔中,分别进行常规贴壁分化培养和维甲酸诱导分化培养.主要观察指标:神经干细胞的鉴定,光镜及免疫组化检测神经干细胞诱导分化结果.结果:免疫组织化学检测结果显示,原代和传代后得到的神经干细胞团均呈巢蛋白阳性.常规贴壁分化培养7 d后,神经元多呈椭圆型和近似三角形,胞体大,细胞边缘清楚,胞体上有多个突起;而维甲酸诱导分化培养后,神经元数量增加,形态清楚,但细胞胞体上突起较少.与常规贴壁分化培养比较,维甲酸诱导分化培养后神经干细胞向神经元分化率明显升高(P<0.01),神经干细胞向神经胶质细胞分化率明显降低(P<0.01).结论:从大鼠胚胎脑海马组织中分离得到可自我复制和多向分化的神经干细胞,维甲酸体外诱导后可以增加其向神经元方向分化的比例.     

神经干细胞诱导分化为多巴胺能神经元与胚胎中脑多巴胺能神经元移植治疗帕金森病效果比较

目的:目前对于体外诱导分化的多巴胺能神经元的生物学功能、体内存活状况,以及与胚胎中脑多巴胺能神经元移植治疗帕金森病大鼠的疗效比较方面尚缺乏深入的研究.观察神经干细胞诱导分化的多巴胺能神经元移植治疗帕金森病大鼠的作用,并与胚胎中脑多巴胺能神经元组织移植治疗帕金森病大鼠的疗效进行比较.方法:实验于2006-06/2007-09在中山大学附属第一医院完成.①实验材料:健康成年雄性SD大鼠及孕14～15 d的SD大鼠由中山大学动物实验中心提供,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:在含表皮生长因子及碱性成纤维细胞生长因子的无血清培养液中培养胚胎大鼠中脑神经干细胞.经传代扩增后,在含白细胞介素1a、白细胞介素11、白血病抑制因子、胶质细胞源性神经营养因子的诱导分化液中向多巴胺能神经元分化,并进行免疫细胞化学鉴定和流式细胞仪检测.参考Sauer和Lee等方法制备帕金森病大鼠模型,并将造模成功大鼠随机分组,每组9只:分化细胞组向每一坐标点注入1×1011 L-1神经干细胞诱导分化的多巴胺能神经元;胚胎中脑组注入 1×1011 L -1胚胎中脑多巴胺能神经元;手术对照组注入DMEM/F12细胞培养液.③实验评估:移植术后10、20、40、60 d诱发大鼠不对称旋转行为以观察治疗效果,并对移植区进行酪氨酸羟化酶免疫组织化学检测以了解移植细胞体内存活的情况.结果:①大鼠神经干细胞球在诱导分化液中呈贴壁生长,球内细胞从球体中央逐渐向四周分化扩展出形态各异的细胞.免疫细胞化学染色显示,分化细胞中含有酪氨酸羟化酶染色阳性细胞.流式细胞仪检测诱导分化6 d的细胞中酪氨酸羟化酶染色阳性细胞的比率为(16.7±2.8)%.②移植后20 d分化细胞组大鼠的不对称旋转行为开始明显下降(P < 0.05).移植后40 d和60 d,分化细胞组大鼠的旋转圈数与胚胎中脑组比较差异不显著(P > 0.05).③分化细胞组和胚胎中脑组大鼠纹状体移植区有酪氨酸羟化酶染色阳性细胞,多数细胞位于移植针道边缘.结论:神经干细胞诱导分化的多巴胺能神经元与胚胎中脑多巴胺能神经元移植治疗帕金森病大鼠具有相同的疗效.     

应用胎鼠脑源性神经干细胞条件培养液诱导胚胎干细胞的分化

目的:为克服类胚体和视黄酸诱导体系的不足,实验使用胎鼠脑源性神经干细胞条件培养液定向诱导分化胚胎干细胞,观察是否可以获得大量具有高度增殖和进一步分化能力的神经干/祖细胞。方法:实验于2005-06/2006-09在中山大学干细胞与组织工程中心实验室完成。①取孕12.5d的C57BL/6J小鼠胚胎脑组织,放入含有神经干细胞培养液(含B27、肝素5mg/L、碱性成纤维细胞生长因子20μg/L、表皮生长因子20μg/L、100U/mL青霉素、0.1g/L链霉素的DMEM/F12)的离心管内,接种后37℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中饱和湿度培养。3～5d后可见团状细胞球出现,即为原代的神经干细胞。取P5～10代神经干细胞消化成单细胞悬液,以5×104/cm2密度接种于神经干细胞培养液中,4～5d离心后收集上清液,即为胎鼠脑源性神经干细胞条件培养液。②P30代SC1002鼠胚胎干细胞消化成单个细胞后,移入上述制备的条件培养液中,5d后消化细胞,再重新接种于条件培养液中培养5d。常规消化后接种于神经干细胞培养液中,培养4～5d,即得到胚胎干细胞来源的神经干/祖细胞。对照组用神经干细胞培养液代替条件培养液。③所得细胞进行特异性抗原免疫细胞化学染色,并计数免疫染色阳性细胞率。RT-PCR检测标志性基因的表达。结果:①胚胎干细胞分化为神经干/祖细胞的比例:当消化成单个细胞的胚胎干细胞接种到神经干细胞条件培养液后,24h内聚集成细胞球并悬浮生长。免疫细胞化学检测少部分细胞表达nestin,在随后的培养过程中nestin阳性细胞逐渐增多。第4天细胞球周围的细胞几乎全部呈nestin阳性。当消化后重新接种于神经干细胞条件培养液中,可见部分细胞贴壁生长,10d后再常规消化接种于神经干细胞培养液中,呈典型的双极外形,nestin及RC2检测均呈阳性。RT-PCR检测显示Oct-4不再表达,而sox2,sox3,nestin,fabp7及bHLH转录因子均有显著表达。另一方面,当单个胚胎干细胞直接培养在神经干细胞培养液中,大量细胞死亡,仅10%存活,存活细胞表达Oct-4和nestin。②胚胎干细胞来源的神经干/祖细胞向神经元和胶质细胞的分化:经过10～12d的诱导分化,微管相关蛋白2和胶质纤维酸性蛋白细胞阳性率分别为(27.6±9.2)%和(29.7±11.6)%。结论:不需要共培养或添加诱导因子,应用胎鼠脑源性神经干细胞条件培养液成功地将胚胎干细胞定向诱导分化为大量高纯度的神经前体细胞,并进一步得到神经元和神经胶质细胞。     

通心络对大鼠胚胎神经干细胞源性神经细胞谱系的影响

目的：前期体内动物模型实验说明，通心络可能具有影响神经干细胞增殖及向各种神经细胞分化的作用。实验拟观察通心络对大鼠胚胎神经干细胞源性神经细胞谱系的影响以及时效、量效的关系。 方法：实验于2007—06／10在南方医科大学机能学实验室完成。①实验材料：孕12～14dSD大鼠由南方医科大学实验动物中心提供，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。通心络，主要成分为人参、水蛭、全蝎、土鳖虫、蜈蚣、蝉蜕、赤芍、冰片等，由石家庄以岭药业股份有限公司生产，国药准字Z19980015。通心络含药血清的制备：按大剂量组1g／（d·kg）、小剂量组0．5g／（d·kg）分别予大鼠通心络混悬液灌胃，7d后抽血离心，吸取血清，过滤消毒，分装，-70℃冻存备用。②实验方法：自孕12～14d大鼠胚胎中分离培养神经干细胞，取第3代细胞分别给予大、小剂量组通心络含药血清干预。以添加普通血清干预的为对照。③实验评估：于培养1，3，7d通过免疫荧光染色观察各种类型神经细胞所占比例。 结果：①神经干细胞经通心络含药血清干预后1d，仅在大剂量组海马齿状回有极少数细胞呈BrdU（＋）GFAP（＋），其余细胞都呈BrdU（＋）Nestin（＋），小剂量组和对照组均为BrdU（＋）Nestin（＋）细胞。②经通心络含药血清干预后3d，大剂量组、小剂量组和对照组Nestin（＋）、13tubulin（＋）、GFAP（＋）细胞比例差异有显著性意义（P〈0．01），GalC（＋）细胞比例差异无统计学意义（P〉0.05）。③大鼠胚胎神经干细胞经通心络含药血清干预后：各组Nestin（＋）细胞比例先降后升：13tubulin（＋）细胞比例大剂量组持续上升，小剂量组和对照组先升后降；GFAP（＋）细胞比例大剂量组先升后降，小剂量组和对照组持续上升，GalC（＋）细胞比例大、小剂量?     

通心络对大鼠胚胎神经干细胞源性神经细胞谱系的影响

目的:前期体内动物模型实验说明,通心络可能具有影响神经干细胞增殖及向各种神经细胞分化的作用.实验拟观察通心络对大鼠胚胎神经干细胞源性神经细胞谱系的影响以及时效、量效的关系.方法:实验于2007-06/10在南方医科大学机能学实验室完成.①实验材料:孕12～14 d SD大鼠由南方医科大学实验动物中心提供,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.通心络,主要成分为人参、水蛭、全蝎、土鳖虫、蜈蚣、蝉蜕、赤芍、冰片等,由石家庄以岭药业股份有限公司生产,国药准字Z19980015.通心络含药血清的制备:按大剂量组1 g/(d·kg)、小剂量组0.5 g/(d·kg)分别予大鼠通心络混悬液灌胃,7 d后抽血离心,吸取血清,过滤消毒,分装,-70 ℃冻存备用.②实验方法:自孕12～14 d大鼠胚胎中分离培养神经干细胞,取第3代细胞分别给予大、小剂量组通心络含药血清干预.以添加普通血清干预的为对照.③实验评估:于培养1,3,7 d通过免疫荧光染色观察各种类型神经细胞所占比例.结果:①神经干细胞经通心络含药血清干预后1 d,仅在大剂量组海马齿状回有极少数细胞呈BrdU( )GFAP( ),其余细胞都呈BrdU( )Nestin( ),小剂量组和对照组均为BrdU( )Nestin( )细胞.②经通心络含药血清干预后3d,大剂量组、小剂量组和对照组Nestin( )、βtubulin( )、GFAP( )细胞比例差异有显著性意义(P < 0.01),GalC( )细胞比例差异无统计学意义(P > 0.05).③大鼠胚胎神经干细胞经通心络含药血清干预后:各组Nestin( )细胞比例先降后升;βtubulin( )细胞比例大剂量组持续上升,小剂量组和对照组先升后降;GFAP( )细胞比例大剂量组先升后降,小剂量组和对照组持续上升,GalC( )细胞比例大、小剂量组均较平稳,对照组7 d时明显上升.结论:通心络有促进大鼠胚胎神经干细胞增殖及向神经元分化的效应,并存在时效、量效关系,剂量越大效应越明显及持久.     

大鼠神经干细胞与"癫痫样细胞"体外共培养后的分化发育料

背景:在癫痫微环境神经干细胞能否被诱导分化为异常放电的"癫痫神经元"?癫痫微环境包括两种情况:一是"无镁"细胞外液,二是与癫痫细胞共培养.其中前者比后者的致癫痫作用强.目的:模型模拟体内癫痫微环境,将大鼠海马神经干细胞和正常海马神经元以及"癫痫神经元"体外共培养,观察干细胞的分化发育情况.设计:重复测量观察.单位:哈尔滨医科大学附属第一医院.材料:实验于2005-08/2007-04在哈尔滨医科大学病原学教研室及药理学教研室完成,选用150只新生Wistar大鼠,雌雄不拘,由哈尔滨医科大学附属第二医院实验动物中心提供,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.兔抗鼠突触素抗体购自美国LabVision公司.携带增强型绿色荧光蛋白标记基因的血清型2型腺相关病毒购自北京本元正阳公司.Axopatch 200B放大器为美国Axon公司产品.5111A示波器为美国Tektronix公司产品.方法:①分离大鼠海马神经元,采用"无镁"外液处理神经元建立"癫痫神经元"模型.常规方法培养大鼠海马神经干细胞,将绿色荧光蛋白标记的神经干细胞分别与正常海马神经元、"癫痫神经元"共培养14 d.②应用膜片钳记录与两种神经元共培养后细胞突触后电位:利用免疫荧光检测神经干细胞突触素抗体染色情况:将神经干细胞分化的神经元放入"无镁"外液,应用膜片钳记录其突触后电位.主要观察指标:①海马神经干细胞与两种神经元共培养14 d后突触后电位、突触素抗体染色结果.②分化后神经元在.无镁"外液中突触后电位及"癫痫样放电"情况.结果:①神经干细胞与正常海马神经元共培养后,膜片钳记录到60%(6/10)神经干细胞14次/5min兴奋性突触后电位;与"瘴痫神经元"共培养后记录到12次/5 min兴奋性突触后电位.②神经干细胞分别与正常海马神经元及"癫痫神经元"共培养后,免疫荧光检测均显示80%(12/15)表达绿色荧光蛋白的干细胞突触索抗体染色阳性.③60%(9/15)干细胞分化的神经元在"无镁"外液中出现14次/5 min时程约10 s的兴奋性突触后电位,未记录到"癫痫样放电".结论:大鼠海马神经干细胞与"癫痫神经元"体外共培养后可形成功能性突触,未转变成"癫痫神经元".     

新生大鼠全大脑组织分离诱导分化神经干细胞的体外实验

背景：神经干细胞的供体一股以胎鼠和成年鼠为主，利用细胞培养技术分离步骤较繁琐。目的：以新生大鼠为神经干细胞供体，拟建立一种较为简便、细胞获得率较高的分离培养方法。设计、时间及地点：以细胞为对象观察性实验，于2006—10／2007—03在重庆医科大学完成。材料：新生1～3d的Wistar大鼠全大脑。方法：以胰蛋白酶消化、无血清、悬浮培养原代细胞，并加含体积分数为0．10胎牛血清的DMEM／F12培养液诱导其分化。主要观察指标：应用相差显微镜观察神经干细胞的生长特点及分化后的细胞形态学变化。应用间接免疫细胞化学染色法鉴定神经千细胞及其分化后神经元和胶质细胞标志蛋白的表达。以BrdU标记神经干细胞，观察其增殖情况。结果：新生大鼠脑组织分离的细胞具有连续传代和增殖的能力，能稳定表达神经干细胞特异性巢蛋白。诱导分化后的细胞能表达神经元细胞、旱形胶质细胞、少突胶质细胞的特异性蛋白。结论：从新生大鼠脑组织分离培养出的神经干细胞获得率高，保持了干细胞的未分化属性，具有自我更新和多项分化潜能。