重组hIL-10在毕赤酵母X-33的表达及其生物活性鉴定

目的:用毕赤酵母表达hIL-10并探索合适的表达条件,为IL-10生物制品研发及临床应用奠定基础。方法:以0.5%甲醇诱导酵母X-33表达rhIL-10,用SDS-PAGE和Western blot分析鉴定rhIL-10,比较不同温度、不同pH值和有无PMSF条件下rhIL-10的表达水平。用ELISA法测定培养液rhIL-10含量,用Bradford法测定培养液总蛋白含量,计算rhIL-10占总蛋白的比例。以淋巴细胞转化试验分析rhIL-10的生物学活性。结果:SDS-PAGE后可见42 kD左右蛋白条带;Western blot也检测到42kD左右特异性蛋白质条带。pH值为6.0、温度在28℃并加入抑制剂时rhIL-10表达量最高值为20 mg/L,同时段培养液中总蛋白质含量为50 mg/L,rhIL-10占总蛋白比例为40%。在外周血淋巴细胞转化试验中,rhIL-10抑制了淋巴细胞的增殖。结论:hIL-10能在毕赤酵母高效表达,表达产物有较好生物活性;发酵条件对rhIL-10的表达水平影响大,改善发酵条件能促进rhIL-10的表达。     

鸡IL-18在毕赤酵母中的表达与活性分析

目的:在毕赤酵母中表达鸡白介素18,并鉴定其活性.方法:应用PCR技术从重组质粒pMD18-T-ChIL-18中扩增出鸡IL-18成熟肽基因,亚克隆于毕赤酵母表达载体pPICZαA上,构建重组质粒pPICZαA-ChIL-18.经酶切、PCR和测序鉴定正确后,电转化入毕赤酵母菌X-33,筛选多拷贝单克隆进行诱导表达.表达产物纯化后用Western blot、ELISA和淋巴细胞转化试验分析其生物学活性.结果:重组菌正确表达了具有免疫原性的鸡IL-18,经分析该rchIL-18具有诱导淋巴细胞分泌γ干扰素和刺激淋巴细胞增殖的活性.结论:成功的在毕赤酵母中表达了具有生物活性的鸡IL-18.     

人ZP3 186S突变蛋白在毕赤酵母X33细胞中的表达

目的:利用毕赤酵母表达人ZP3186S蛋白(23～348氨基酸),为临床相关疾病的诊断提供实验材料。方法:经PCR获得编码人ZP3(23～348氨基酸)的基因,构建表达载体pPICZα-hZP3。将ZP3186位点精氨酸突变为丝氨酸构建pPICZα-hZP3186S质粒。转染毕赤酵母X33细胞,用高浓度Zeocin筛选转染细胞,甲醇诱导目的蛋白分泌,通过SDS-PAGE和Western blot鉴定人ZP3186S蛋白。结果:pPICZα-hZP3186S表达质粒经测序正确,并在毕赤酵母X33中能够高效表达。结论:毕赤酵母能够分泌性表达重组人ZP3186S蛋白(23～348氨基酸),进一步研究其生物学活性为研制不孕症诊断试剂和免疫避孕疫苗提供实验材料。     

复合干扰素在毕赤酵母中的分泌表达、纯化及活性分析

目的 在毕赤酵母中高效分泌表达复合干扰素。方法 根据毕赤酵母密码子偏性合成了复合干扰素基因，克隆至分泌型酵母表达载体pMKX9K，线性化后转化毕赤酵母GS115，筛选高表达菌株。诱导后的培养上清经过离子交换，疏水层析，凝胶过滤三步层析纯化，用细胞病变抑制法测定其活性，并结合Iowry法蛋白定量计算其比活性。结果 SDS-PAGE分析显示，重组蛋白以可溶性分子的形式存在于上清液中，经纯化后纯度达到96％，其N端氨基酸序列与理论值一致，比活与干复津相当。结论 复合干扰素在毕赤酵母中获得高效分泌表达，为获得大量基因工程产品奠定了基础。     

人Delta-like1ext-Fc融合蛋白毕赤酵母表达载体的构建及表达

目的:构建人Delta-like1ext-Fc融合蛋白毕赤酵母表达载体PIC-hDll1ext -Fc,并在毕赤酵母GS115中表达.方法:以pEF-BOSneo-hdll1ext-Fc为模板PCR扩增人Delta-like1胞外段.通过DNA重组构建毕赤酵母表达载体PIC-hDll1ext.-Fc.用MD平板筛选重组子,G418筛选高拷贝转化子,经甲醇诱导表达后,SDS-PAGE、Western blot分析表达蛋白.结果:hDll1基因的胞外段被有效地扩增.序列分析表明,所构建的含hDll1ext-Fc融合基因的质粒与设计相同,融合蛋白hDll1extFc得到正确表达.结论:成功地扩增了人Delta-likel胞外段,构建了hDll1ext-Fc融合基因的毕赤酵母表达载体PIC-hDll1extFc,并在毕赤酵母中正确表达,为进一步研究奠定了实验基础.     

重组人白细胞介素10在毕赤酵母中的表达及生物学活性测定

目的在毕赤酵母中分泌表达具有生物学活性的重组人白细胞介素10(rhIL-10),用于IL-10的生理功能研究和动物试验。方法通过PCR扩增IL-10基因,插入到重组质粒α/pUC18的α因子信号序列的XhoⅠ和EcoRⅠ酶切位点处,再将融合基因αIL-10重组到表达质粒pPIC9K的BamHⅠ和EcoRⅠ之间,SalⅠ酶切线性化重组质粒IL-10/pPIC9K,电穿孔转化毕赤酵母,营养缺陷型培养基MD和G418筛选含高拷贝表达盒的酵母转化子,PCR鉴定是否含有目的基因IL-10,甲醇诱导rhIL-10的表达,SDS-PAGE和Westernblot鉴定目的蛋白,用ELISA定量测定及MC/9细胞分析IL-10生物学活性。结果成功构建了重组表达质粒IL-10/pPIC9K,获得了4个含IL-10基因的高拷贝毕赤酵母转化子,甲醇诱导后,在摇瓶水平的IL-10表达量为(0.627±0.09)mg/L,比活性为1.5×105U/mg。结论毕赤酵母分泌表达的IL-10具有良好的生物学活性。     

二硫键稳定的人源性抗bFGF双链抗体的酵母表达及鉴定

目的为提高小分子抗体表达量,利用酵母表达系统表达二硫键稳定的人源性抗bFGF双链抗体(ds-Diabody)并研究其生物学活性。方法将ds-Diabody基因构建到酵母表达载体中获得重组质粒pPICZαA-ds-Diabody,经BglⅡ线性化电转至毕赤酵母GS115中,甲醇诱导表达。表达产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定,并进行镍离子亲和层析和阴离子交换层析纯化。间接ELISA检测其抗原结合活性,CCK8法和划痕实验检验其肿瘤抑制作用。结果成功构建人源性抗bFGF ds-Diabody酵母表达载体,并获得4株高表达酵母工程菌,经1%甲醇诱导96 h表达量即可恒定,表达量可达158 mg/L。SDS-PAGE及Western blot结果显示,目的蛋白大小约Mr35 000左右。通过两步纯化方案,目的蛋白的纯度可达95%以上。ELISA结果显示纯化的ds-Diabody可与bFGF特异性结合。CCK8结果显示,纯化的ds-Diabody可剂量依赖性地抑制人肺癌细胞株A549的增殖,最大抑制率为43.4%。划痕实验表明ds-Diabody可以抑制肿瘤细胞的迁移。结论研究结果表明人源性抗bFGF ds-Diabody在毕赤酵母中可获得高效表达,且具有很好的生物学活性。     

BPIm23重组抗菌蛋白在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达

目的：采用巴斯德毕赤酵母表达系统表达分泌型功能性rBPIm23抗菌蛋白。方法：利用构建的pUC18-synBPI414质粒和PBV220-BPIm120质粒，按分子克隆方法构建pPICZa-synBPIm600重组表达载体；用线性化pVICZa-synBPIm600质粒电转化Pichia pastoris GS115，筛选抗性转化子，进行PCR和Mut表型鉴定；用甲醇诱导目的蛋白rBPIm23的表达；用离子交换层析纯化rBPIm23，并进行SDS-PAGE分析、Western blot鉴定和用BCA法定量。结果：①成功构建了pPICZa-synBPIm600重组表达载体；②获得稳定整合目的基因的GS115菌株；③表达产物相对分子量约为23kD，可与抗BPI抗体特异性结合；④培养上清液中目的蛋白表达量约为2.9mg／L。结论：BPIm23重组抗菌蛋白在毕赤酵母GS115中得到分泌表达。     

利用α-溶血素系统分泌表达重组人白介素-6

目的 构建基于大肠杆菌α-溶血素(HlyA)分泌机制的原核胞外分泌表达载体系统,将重组人白介素6(rhIL-6)分泌至胞外培养基中.方法 利用分子克隆手段,从引起人泌尿道感染的大肠杆菌UPEC J96菌株染色体上获得了α-溶血素(HlyA)系统的分泌功能基因,与外源基因片段hIL-6一起克隆至pQE30骨架载体,构建了胞外分泌表达质粒pIsQ,转化E. coliTop10,诱导表达后通过Western blot检测培养上清中hIL-6的表达.结果 获得了与设计完全一致的pISU载体,Western blot结果显示,可以在pISQ/E. coli Top10培养液上清中检测到与His-hIL6-HlyAs融合蛋白相对分子质量大小一致的特异条带.结论 大肠杆菌HlyA分泌系统操纵子能够在染色体和质粒间传递,rhIL-6能够通过该系统被特异地分泌至胞外培养基中,以可溶形式存在,为后续生物学研究奠定了基础.     

小鼠B16黑色素瘤细胞酪氨酸酶基因的克隆及在毕赤酵母中的表达

目的:克隆酪氨酸酶基因(TYR), 并在毕赤酵母中表达和纯化其融合蛋白, 体外测定纯化的TYR活性.方法:利用RT-PCR技术, 从小鼠B16黑色素瘤细胞中克隆全长TYR, 克隆至pMD18-T载体, 进行双链核苷酸序列测定.构建TYR毕赤酵母表达质粒pPICZaA- TYR并导入毕赤酵母Pichia pastoris GS115, 表达的重组蛋白用SDS-PAGE和Western blot进行分析, 采用Co2 离子亲和层析柱纯化TYR并采用TYR多巴速率氧化法体外测定纯化的TYR活性.结果:克隆了TYR基因.构建了重组表达质粒pPICZaA-TYR.SDS-PAGE和Western blot分析显示, 在相对分子质量(Mr)为约53 000处出现1条特异性蛋白带, 且能与兔抗TYR抗体发生反应.结论:克隆TYR基因片段与基因库所登录的序列相一致, 并在毕赤酵母中获得表达和纯化并在体外测定了纯化的TYR活性.     

雷公藤内酯醇对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞IL-18及其受体表达的影响

目的:研究雷公藤内酯醇(TP)对佛波酯(PMA)刺激的关节滑膜成纤维细胞(RASF) 白细胞介素18(IL-18)及其受体(IL-18R)表达的影响, 并对其机制进行探讨.方法:RASF先用TP(0～100 μg/L) 预处理2 h, 再用PMA (50 μg/L)刺激.收集上清用 ELISA 法检测上清IL-18水平.利用人IL-18能特异诱导人髓系单核细胞KG-1产生IFN-γ的特性检测上清中IL-18生物学活性.收集处理的RASF, 用Western blot 和荧光定量RT-PCR检测IL-18和IL-18R的蛋白和mRNA表达.NF-κB的活性用类ELISA法检测. 结果:TP能有效抑制PMA刺激的RASF的IL-18生物学活性.TP能够抑制PMA刺激的RASF的IL-18和IL-18R的蛋白和mRNA表达.TP还抑制PMA刺激的RASF 的NF-κB 活性.TP对PMA刺激的RASF 的抑制效应呈剂量相关性.结论:TP能有效抑制PMA刺激的RASF 的IL-18和IL-18R的表达.这些结果说明了TP对RA治疗作用的机制.     

穿心莲内酯对人PBMC/PBM表达IL-18相关细胞因子的影响

目的:研究穿心莲内酯对外周血单核细胞表达IL-18相关细胞因子的影响。方法:不同浓度穿心莲内酯处理LPS刺激的PBMC(Peripheral Blood Mononuclear Cells,外周血单个核细胞)和LPS+IFNγ-/IL-4激活的磁珠分选PBM(PeripheralBlood Monocytes,外周血单核细胞),利用real-time RT-PCR法检测IL-18、IL-18BP、IL-18Rα、IL-18Rβ基因转录水平,ELISA法检测PBM上清中的IL-18、IL-18BP和IL-1β、IL-1Rα。结果:穿心莲内酯呈剂量和时间依赖地调节PBMC IL-18和IL-18BP的表达。穿心莲内酯处理使LPS刺激的PBMC IL-18BP转录增加,IL-18BP/IL-18比值升高;使LPS+IFNγ-激活的PBM表达IL-18BP/IL-18比值从9.60倍升高至214倍;IL-4激活的PBM表达IL-1Rα/IL-1β比值从9 200降低至6 520。结论:穿心莲内酯可调节激活的外周血单核细胞IL-18相关基因转录和表达,抑制炎症时IL-18的高表达。     

狼疮肾炎患者IL-18/IL-18BP的表达及免疫抑制治疗对其的影响

目的：观察狼疮肾炎（Lupus nephritis，LN）病人血清白细胞介素18（Interleukin 18，IL-18）和白细胞介素18结合蛋白（Interleukin 18 binding protein, IL-18BP）的水平及外周血单个核细胞（PBMC）中IL-18和IL-18BP mRNA的表达水平与疾病的关系，及免疫抑制治疗对其的影响。方法：酶联免疫吸附法（ELISA）法检测25例活动性LN病人采用环磷酰胺和糖皮质激素治疗前后及25例正常对照者的血清IL-18和1L-18BP水平，同时逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）法测定外周血PBMC中IL-18和IL-18BP mRNA的表达水平。结果：活动性患者治疗前血清IL-18、IL-18BP及PBMC中IL-18和IL-18BP mRNA的表达水平均较正常对照组明显升高（P〈0．01）。游离IL-18水平明显增高，血清游离IL-18水平与患者肾脏病理活动指数（AI）及24小时尿蛋白定量呈正相关，与补体C3水平呈负相关，与患者GFR水平无明显相关。采用免疫抑制剂治疗后IL-18和IL-18BP在蛋白及mRNA水平均下降，血清游离IL-18水平明显下降（P〈0．01）。结论：狼疮肾炎患者血清游离IL-18水平升高并与疾病活动性相关，IL-18／IL-18BP失衡参与了狼疮肾脏病理过程，增加内外源性IL-18BP可能为IN的治疗提供新的途径。     

Trisomy 18 and 18p- features in a case of isochromosome 18q [46,XY,i(18q)]: prenatal diagnosis and autopsy report

This paper reports the prenatal diagnosis and autopsy findings of a case of true isochromosome 18q [46,XY,i(18q)] with severe cephalic malformations. Comparison is made with other cases of i(18q).     

Partial 18q trisomy and 18p monosomy resulting from a maternal pericentric inversion,inv(18)(p11.2q21.3)

A 7-year-old boy with dysmorphic features was found to have a recombinant chromosome 18, rec(18), resulting from meiotic recombination of a maternal pericentric inversion, inv(18) (p11.2q21.3), as defined by high-resolution banding. He was trisomic for the long arm (q21.3-qter) and monosomic for the short arm (p11.2-pter) of chromosome 18. His clinical features were compared with those in other rec(18) cases, and also those in monosomy 18p, trisomy 18qter and full trisomy 18 syndromes. The risk of recombinant formation for inv(18) carriers was also discussed.     

乙型肝炎肝硬化患者外周血骨桥蛋白与IL-18水平变化的临床意义

目的：探讨慢性乙型肝炎、肝硬化患者外周血细胞因子骨桥蛋白与IL-18水平变化的临床意义。方法：应用ELISA法对102例慢性乙型肝炎、34例乙型肝炎肝硬化、95例HBV携带者及20名健康献血者（对照组）外周血细胞因子骨桥蛋白与IL-18表达水平进行了测定。结果：慢性乙型肝炎、肝硬化患者组外周血骨桥蛋白及IL-18表达水平明显高于对照组（P〈0.05）;肝硬化患者组骨桥蛋白、IL-18水平明显高于慢性乙型肝炎组（P〈0.05）;慢性乙型肝炎重型组骨桥蛋白、IL-18水平明显高于慢性乙型肝炎轻型组（P〈0.05）;慢性乙型肝炎患者血清总胆红素水平与骨桥蛋白和IL-18表达水平呈正相关关系（r=0.71,P〈0.05;r=0.78,P〈0.05）。结论：乙肝病毒感染性慢性肝脏疾病发生发展与细胞因子骨桥蛋白及IL-18水平变化相关,慢性乙型肝炎、肝炎后肝硬化患者外周血骨桥蛋白与IL-18表达水平呈正相关关系（r=0.74,P〈0.05）。