IFNα A-HBV preS 融合蛋白在大肠杆菌中的表达及生物学活性的初步鉴定

本实验利用重组ＩＦＮαＡ－ＨＢＶｐｒｅＳ融合基因ｐｌｙ５质粒在大肠杆菌ＤＨ５α中表达ＩＦＮαＡ－ＨＢＶｐｒｅＳ融合蛋白。该融合基因产物的分子量为３９ｋＤ左右，融合蛋白的表达率为１１．８％。对该融合蛋白的初步鉴定表明：该融合蛋白既具有ＨＢＶｐｒｅＳ蛋白的免疫原性，又具备ＩＦＮα的生物学活性。     

IFNαA—HBV preS融合蛋白在大肠杆菌中的表达及生物…

本实验利用重组ＩＦＮαＡ－ＨＢＶｐｒｅＳ融合基因ｐｌｙ５质粒大大肠杆菌ＤＨ５α中表达ＩＦＮαＡ－ＨＢＶｐｒｅＳ融合蛋白，该融合基因产物的分子量为３９ｋＤ左右，融合蛋白的表达率为１１．８％，对该融合蛋白的初步鉴定表明，该融合蛋白既具有ＨＢＶｐｒｅＳ蛋白的免疫原性，又具备ＩＦＮα的生物学活性。     

表皮生长因子与假单胞菌外毒素融合蛋白在大肠杆菌中的表达 …

目的和方法：应用基因工程技术，将ＥＧＦＣＤＮＡ克隆到ＰＬＹ５／ＩＬ２－ＰＥ４０载体的ＥｃｏＲⅠ、ＳｍａⅠ位点之间ＩＬ２基因位置上，再将重组融合基因亚克隆到表达载体ＰＢＶ２２０的ＥｃｏＲⅠ、ＰｓｔⅠ位点上，以探索ＥＧＦ－ＰＥ４０融合基因在大肠杆菌ＤＨ５ａ中的进行表达及其生理功能。结果：ＳＤＳ－聚丙烯胺凝胶电泳和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ表明：ＥＧＦ－ＰＥ４０融合蛋白获得表达，并且具有ＥＧＦ和ＰＥ４０的免     

外周血单个核细胞中乙型肝炎病毒前S/S基因变异的研究

目的研究外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）中乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）包膜抗原基因变异的意义。方法收集１９例慢性乙肝患者的ＰＢＭＣ和配对血清,用ＰＣＲ扩增ＰＢＭＣ及血清中ＨＢＶ包膜基因片段（Ｓ,ｐｒｅＳ１,ｐｒｅＳ２）,并对其中各５例ＰＢＭＣ及配对血清中的ｐｒｅＳ１和ｐｒｅＳ２基因片段,分别进行核苷酸序列分析。结果Ｓ、ｐｒｅＳ１和ｐｒｅＳ２片段在血清和ＰＢＭＣ中的检出率,分别为１００％、９４７％、１００％和０、２６３％、２６３％。与ＨＢＶＡＤＲ序列比较,１０份标本ＨＢＶＤＮＡ核苷酸序列分析,发现２份ｐｒｅＳ１和３份ｐｒｅＳ２的核苷酸序列,没有发生改变;８份ｐｒｅＳ１和７份ｐｒｅＳ２的核苷酸序列,均发生了一个至多个位点的点突变。结论ＰＢＭＣ中存在的包膜基因不完整,因而不会形成完整的ＨＢＶ病毒颗粒,故不支持ＨＢＶ可潜伏于ＰＢＭＣ并发展成为体内ＨＢＶ再感染的来源。ｐｒｅＳ１点突变编码的氨基酸位点,集中在ａａ２１～４７区域,可能会影响ＨＢＶ的吸附和穿入,及组织亲嗜性的改变。ＨＢＶ亚基因片段在ＰＢＭＣ中,是否会影响细胞的功能,有待进一步研究。     

表皮生长因子与假单胞菌外毒素融合蛋白在大肠杆菌中的表达研究

目的和方法：应用基因工程技术，将ＥＧＦｃＤＮＡ克隆到ｐＬＹ５／ＩＬ２－ＰＥ４０载体的ＥｃｏＲⅠ、ＳｍａⅠ位点之间ＩＬ２基因位置上，再将重组融合基因亚克隆到表达载体ｐＢＶ２２０的ＥｃｏＲⅠ、ＰｓｔⅠ位点上，以探索ＥＧＦ－ＰＥ４０融合基因在大肠杆菌ＤＨ５ａ中的进行表达及其生理功能。结果：ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ表明：ＥＧＦ－ＰＥ４０融合蛋白获得表达，并且具有ＥＧＦ和ＰＥ４０的免疫学活性。结论：这为进一步研究该融合的蛋白功能和肿瘤治疗打下基础     

恶性疟原虫疫苗研究VⅡ.PfCMR基因与人白细胞介素—2基因…

用限制性内切酶ＥｃｏＲＩ和Ｓａｌｌ将恶性疟原虫复合抗原基因ＰｆＣＭＲ从质粒ＰＷＲ４５０－１／ＰｆＣＭＲ中切下，插入质粒ＰＢＶ２２０／ＩＬ－２中人白细胞介素－２（ＩＬ－２）基因的ＥｃｏＲＩ位点，重组质粒转化大肠杆菌ＤＨ５ａ，通过ＰＣＲ扩增和酶切鉴定，筛选出自向插入的重组载体ＰＢＶ２２０／ＰｆＣＭＲ－ＩＬ－２。为表达ＰｆＣＭＲ－ＩＬ－２融合蛋白打下基础。     

恶性疟原虫疫苗研究VIPfCMR基因与人白细胞介素-2基因的连接与克隆

用限制性内切酶ＥｃｏＲＩ和ＳａｌＩ将恶性疟原虫复合抗原基因ＰｆＣＭＲ从质粒ｐＷＲ４５０－１／ＰｆＣＭＲ中切下，插入质粒ｐＢＶ２２０／ＩＬ－２中人白细胞介素－２（ＩＬ－２）基因的ＥｃｏＲＩ位点。重组质粒转化大肠杆菌ＤＨ５ａ，通过ＰＣＲ扩增和酶切鉴定，筛选出正向插入的重组载体ｐＢＶ２２０／ＰｆＣＭＲ－ＩＬ－２。为表达ＰｆＣＭＲ－ＩＬ－２融合蛋白打下基础。     

肝硬变内HBV DNA及其五种抗原的表达及意义

取２２５例人肝硬变活检组织石蜡切片，检测了ＨＢＶＤＮＡ及其５种抗原。分别用免疫组化ＡＢＣ法检测ＨＢｘＡｇ、ｐｒｅ－Ｓ＿１和ｐｒｅ－Ｓ＿２抗原；用ＰＡＰ法检测ＨＢｓＡｇ和ＨＢｃＡｇ；用原位杂交方法检测ＨＢＶＤＮＡ；用免疫组化、原位杂交双标记方法检测ＨＢＶＤＮＡ和ＨＢｓＡｇ、ＨＢｘＡｇ或ＨＢｃＡｇ。结果显示，阳性检出率ＨＢｓＡｇ为７０．０％（１２８／１８３例），ｐｒｅ－Ｓ＿１抗原为６４．４％（８５／１３２例）、ｐｒｅ－Ｓ＿２抗原为６１．４％（８１／１３２例），ＨＢｘＡｇ为７５．３％（１１３／１５０例），ＨＢｃＡｇ为２２．４％（３９／１７４例），ＨＢＶＤＮＡ为６２．４％（５８／９３例）。双标阳性检出率ＨＢＶＤＮＡ和ＨＢｓＡｇ为３７．３％（１９／５１例），ＨＢＶＤＮＡ和ＨＢｘ－Ａｇ为８６．３％（４４／５１例），ＨＢＶＤＮＡ和ＨＢｃＡｇ为３９．２％（２０／５１例）。ＨＢＶＤＮＡ和ＨＢＶ５种抗原阳性病例中８０％以上均伴有肝细胞不典型增生。这一结果表明，在我国肝硬变的发生发展与ＨＢＶ慢性感染有密切的关系。     

慢性乙型肝炎表面抗原携带者前S1/S2基因的相似株现象

为了解慢性ＨＢＶ携带者体内ＨＢＶ病毒的状况，以选择ＨＢＶ前Ｓ１／Ｓ２为研究区段，应用半巢式ＰＣＲ法从３例慢性ＨＢＶ携带者血清中扩增出ＨＢＶ前Ｓ１／Ｓ２基因，分别将其克隆于噬菌体Ｍ１３ｍｐ１８、Ｍ１３ｍｐ１９，每例随机筛选１０个阳性克隆，进行序列分析及遗传距离分析，结果发现：３例病人各克隆分别与同源性最好的ＨＢＶ野生株相比，存在着明显的碱基替代、缺失和插入。此类病人体内的ＨＢＶ株同源性差，克隆间最大的遗传距离为０．１２５。慢性ＨＢＶ携带者体内的ＨＢＶ株呈“相似株”分布。     

IL_2－HBVPre－S融合基因的克隆、表达及生物学活性初步鉴定

ＩＬ＿２－ＨＢＶＰｒｅ－Ｓ融合基因的克隆、表达及生物学活性初步鉴定杨晓峰，马文煜，姜绍谆，逮好英（第四军医大学微生物学教研室，西安７１００３２）ＩＬ２是最早发现的淋巴因子之一，它通过与激活的Ｔ淋巴细胞表面特异性受体的相互作用，在激活的Ｔ淋巴克隆中起着...     

HBV与HCV融合DNA疫苗的构建及其体液免疫应答

目的 构建含乙型肝炎病毒（HBV）表面抗原基因（S区基因）与丙型肝炎病毒（HCV）核心抗原基因（C区基因）的嵌合真核表达载体,观察preS1和preS2基因对HBV表面抗原及HCV核心抗原体液免疫的影响。方法 用PCR方法,分别扩增HBV S区基因和HCV C区基因。将S区基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1,酶切鉴定后,大量提取质粒并免疫Balb/c小鼠,用ELISA法检测抗HBs和抗HCV抗体。结果 成功地扩增出目的基因片段,克隆后酶切鉴定结果正确,序列分析与文献报告相一致。免疫后检测到抗HBs和抗HCV抗体。preS1与preS2基因对构建的融合DNA疫苗的体液免疫应答有一定的抑制作用。抗HBs抗体的产生低于只含S基因的真核表达载体;preS1基因对抗HCV抗体的产生具有抑制作用,而preS2无影响。结论 不同长度的HBV S区基因可影响抗HBs和抗HCV抗体的产生。     

乙型肝炎病毒前S2基因克隆及真核表达载体的构建

目的:克隆乙型肝炎病毒前S2基因,构建其真核表达质粒.方法:以乙型肝炎患者血清HBV DNA为模板,设计引物扩增全长前S2基因,再将目的基因插入到真核载体pcDNA3.1(+)中,经PCR、酶切和DNA测序确认.结果:从患者血清抽提的DNA中扩增得到约860bp大小的目的片段,经回收、纯化、酶切后转化大肠杆菌DH5α,...     

HBV preS2S-rhGM-CSF融合基因表达质粒的构建和表达

目的：研究GM-CSF和preS2对乙肝DNA疫苗的免疫增强作用。方法：采用PCR方法，扩增HBV preS2 S基因约846 bp的片段和rhGM-CSF(包括甘氨酸接头)基因450bp的片段。通过T-A克隆技术和基因定向克隆，构建融合基因的真核表达质粒pcDNA3．1-S2S-rhGM-CSF，并在HepG2细胞中表达。结果：经酶切、PCR及DNA测序鉴定，融合基因表达质粒HBV preS2S-rhGM-CSF成功地构建。将其转染HepG2细胞后，目的基因的转录通过RT-PCR得到证实，而且表达的融合蛋白能与抗-HBs、抗-preS2和抗-GM-CSF单克隆抗体(mAb)均产生特异性反应。结论：融合基因表达载体pcDNA3．1-S2S-rhGM-CSF的成功构建并表达，为进一步研究乙肝DNA疫苗奠定了实验基础。     

外周血单个核细胞中乙型肝炎病毒前S／S基因变异？…

目的 研究外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）中乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）包膜抗原基因变异的意义。方法 收集１９例慢性乙肝患者的ＰＢＭＣ和配对血清,用ＰＣＲ扩增ＰＢＭＣ及血清中ＨＢＶ包膜基因片段９Ｓ,ｐｒｅＳ１,ｐｒｅＳ２）,并对其中各５例ＰＢＭＣ及配对血清中的ｐｒｅＳ１和ｐｒｅＳ２基因片段,分别进行核苷酸序列分析。结果 Ｓ,ｐｒｅＳ１和ｐｒｅＳ２片段在血清和ＰＢＭＣ中的检出率,分别为１００％,９４．＆％,１     

Expression and characterization of the preS1 peptide of hepatitis B surface antigen in Escherichia coli

The infectious particles of hepatitis B virus (HBV) contain 3 related surface antigens, i.e., small, medium, and large, all of which are encoded by one large open reading frame with multiple initiation codons. The large surface antigen (L-Ag) contains preS1, preS2, and S regions while both the middle and small surface antigens lack preS1. Several lines of evidence suggested that the preS1 region is involved in the binding of HBV to human hepatocytes as shown by its binding to HepG2 cells and isolated human hepatocyte membranes. To obtain large quantity of preS1 peptide, an expression vector was constructed containing a lac promoter, the 5' half of the beta-galactosidase gene, the Factor Xa tetrapeptide recognition sequence, and the coding region of preS1 plus preS2. This recombinant plasmid constitutively produced high concentration of a fusion protein in inclusion bodies in Escherichia coli. When the fusion protein was treated with Factor Xa, a peptide consisting of the N-terminal 91 amino acids of the preS1 region was released. This preS1 fragment purified by anion exchange chromatography was able to bind specifically to the isolated plasma membranes from human liver. Hence, this recombinant preS1 peptide can be used to identify and isolate hepatocyte receptors for HBV.     

Determination of the minimal length of preS1 epitope recognized by a monoclonal antibody which inhibits attachment of Hepatitis B virus to hepatocytes

The minimal amino acid sequence sufficient to be recognized efficiently by virus-attachment inhibiting murine monoclonal anti-preS1 antibody MA 18/7 has been determined. We have constructed a recombinant gene library using the cloned coat protein gene of Escherichia coli RNA bacteriophage fr as a carrier. Different fragments of preS1 region from cloned hepatitis B virus (HBV) genomes, subtype ayw and adw, were inserted at position 2 of the 129 amino acid-long fr coat protein gene in the appropriate E. coli expression vectors. Fine mapping of preS1 epitope recognized by MA18/7 was accomplished by bidirectional shortening of the preS1 within original recombinant preS-fr coat protein genes with Bal31 exonuclease. Immunoblot analysis of the obtained recombinant protein library revealed that the tetrapeptide Asp-Pro-Ala-Phe (DPAF), located at the position preS(31–34) and conserved in all known HBV genomes, is sufficient to bind MA18/7 antibody. Recognition of the preS1 region by MA18/7 occurred irrespective of the amino acid context surrounding this DPAF tetrapeptide. Further shortening of this minimal epitope from the left or from the right side completely prevented antibody binding in immunoblots.     

乙型肝炎病毒preS/S蛋白对人PCNA基因启动子激活作用的研究

目的：研究乙型肝炎病毒preS/S蛋白对人增殖细胞核抗原（PCNA）基因启动子的激活作用。方法：利用荧光素酶报告基因，用共转染方法研究该整合片段对人PCNA启动子的作用。用免疫组织化学法确定preS/S蛋白细胞中的定位。结果：在人肝细胞L02中，含有上述HBV整合片段的质粒pKSH7C-Hpa I能以剂量依赖方式激活PCNA启动子，使PCNA启动子活性提高0.5倍；免疫组化分析表明，其蛋白定位于细胞质中。结论：preS/S蛋白对PCNA启动子有激活作用，但作用并非直接，可能是通过细胞信号传导途径来影响PCNA活性。     

乙型肝炎病毒preS抗原在大肠杆菌中的高效表达与鉴定

利用ＰＣＲ和基因重组技术构建了乙型肝炎病毒完整ｐｒｅＳ抗原高效表达克隆，该克隆在大肠杆菌中表达一分子量约３１ｋＤ的融合蛋白，由ＭＳ２、白细胞介素３Ｎ端１４个氨基酸接头和ｐｒｅＳ抗原组成，在ＩＬ－３Ｎ端与ＭＳ２连接处有凝血酶识别位点，可被该酶切开。     

重组质粒pcDNA3.1IL-2/Fc对HBV preS2S DNA疫苗免疫作用的影响

目的 探讨IL-2/Fc融合表达后对HBVpreS2S基因疫苗诱导免疫反应的佐剂效应.方法 采用HBV preS2S DNA疫苗作为基础免疫,重组质粒pcDNA3.1IL-2/Fc作为佐剂加强免疫BALB/c小鼠,采用0、2、4周的方案接种,检测各次接种后抗体水平.初次免疫后7周,测定免疫脾细胞的杀伤活性、增殖活性和细胞因子的分泌水平.结果 pcDNA3.1IL-2/Fc作为佐剂在HBV preS2S注射3 d后免疫组小鼠抗体滴度、免疫脾细胞的杀伤活性和增殖活性、TH1型细胞因子的分泌水平,均比各对照组明显增强.结论 IL-2/Fc是有效的HBV preS2S DNA疫苗佐剂之一.