层粘连蛋白受体与配体在C6胶质瘤细胞中的表达及意义

目的 检测层粘连蛋白受体与配体在C6胶质瘤细胞中的表达水平，探讨两者在胶质瘤细胞侵袭性生长和诱导神经干细胞迁移中的意义。方法 从新生3～5d的SD大鼠大脑皮层中分离和培养星形胶质细胞为对照，同时培养C6胶质瘤细胞。采用半定量RT—PCR方法分析层粘连蛋白受体和配体mRNA在星形胶质细胞和C6胶质瘤细胞中表达的差异。结果 星形胶质细胞和C6胶质瘤细胞中均表达层粘连蛋白受体和配体mRNA，而C6胶质瘤细胞呈明显高表达（P〈0．05，P〈0．01）。结论 C6胶质瘤细胞中表达上调的层粘连蛋白受体和配体可能是胶质瘤细胞侵袭性生长和诱导神经干细胞迁移的因素之一。     

C6胶质瘤细胞对体外共培养大鼠神经干细胞增殖影响的初步研究

目的探索与C6胶质瘤细胞体外共培养后大鼠神经干细胞（Neural Stem Cells NSCs）的增殖变化。方法分别培养神经干细胞、星形胶质细胞和C6胶质瘤细胞。利用共培养池（cell culturetranswell inserts）建立两种细胞的体外共培养模型。应用相差显微镜及电镜观察各组共培养后NSCs的形态变化;共培养后NSCs MTT法作生长曲线。结果原代培养后获得神经干细胞及星形胶质细胞;与C6胶质瘤细胞共培养7天后的NSCs增殖较对照组快,电镜观察可见核质比增高,细胞器较发达。结论 C6胶质瘤细胞对体外共培养的大鼠NSCs的增殖有一定促进作用。     

双向电泳技术分析大鼠星形细胞和C6细胞的蛋白差异

目的：建立大鼠星形胶质细胞和C6胶质瘤细胞的双向电泳（2-DE）技术体系,寻找星形胶质细胞和C6胶质瘤细胞的蛋白表达差异。方法：提取大鼠星形胶质细胞和C6胶质瘤细胞中的总蛋白,进行第一向等电聚焦（IEF）和第二向十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离总蛋白,GS-800获得凝胶图像,并测量不同凝胶间蛋白斑点在IEF和SDS-PAGE方向上的位置偏差,使用PDQuest7.3软件对凝胶图像进行分析,找出星形胶质细胞和C6胶质瘤细胞的差异表达蛋白。结果：星形胶质细胞和C6胶质瘤细胞的蛋白表达谱上,分别检测到523±16和550±20个蛋白点,平均匹配点数为452±18和472±21,匹配率达86.4%和85.8%,不同凝胶间蛋白质点在IEF方向的偏差为（0.67±0.48）mm,在SDS-PAGE方向上的偏差为（0.73±0.56）mm,对比分析了星形胶质细胞和C6胶质瘤细胞的2-DE图谱,发现有24个点发生了明显的表达变化（P〈0.01）,在星形胶质细胞中高表达的点有8个,在C6胶质瘤细胞中高表达的点有14个,星形胶质细胞中没有发现表达的点有2个。结论：建立了大鼠星形胶质细胞和C6胶质瘤细胞的双向电泳技术体系,发现两者的双向电泳图谱存在明显差异,C6胶质瘤细胞中表达上调以及星形胶质细胞中没有发现表达的蛋白可能与肿瘤的发生,神经干细胞的迁移有关,表达下调的蛋白可能与抑制肿瘤的发生有关。     

神经干细胞对胶质瘤细胞抑制作用的实验研究

目的:探讨神经干细胞在体外对胶质瘤细胞有无抑制作用。方法:取胎鼠大脑皮层组织,于无血清培养基中进行细胞培养成神经干细胞并进行Nestin免疫荧光染色鉴定;将神经干细胞和鼠胶质瘤细胞(C6细胞)在体外混合培养,观察肿瘤细胞的生长、增殖情况及形态学变化,并对C6细胞进行FCM细胞周期分析及MTT试验。结果:培养所得的细胞特异性抗原Nestin染色呈现阳性,具有较强的分裂增殖能力和自我更新能力,表明培养所获得的细胞是神经干细胞;神经干细胞与C6细胞混合培养后,C6细胞不易贴壁,增殖慢。FCM分析显示实验组处于G0/G1期的C6细胞明显多于对照组(χ2=14.77,P<0.01)。MTT试验显示实验组光吸收值低于对照组(t=-11.66,P<0.01)。结论:胚鼠大脑皮层组织可培养出神经干细胞;在体外对胶质瘤细胞的生长有抑制作用。     

大鼠胚胎神经干细胞的分离培养及鉴定

目的:探索大鼠胚胎神经干细胞的体外分离培养条件,并观察神经干细胞增殖、分化的特点.方法:从孕14 d SD胎鼠前脑组织分离神经干细胞,用DMEM/F12无血清培养液,加入表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),进行体外扩增、培养和传代.传3～4代的神经细胞球在含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液中贴壁诱导分化培养.采用免疫荧光法鉴定神经干细胞和分化的神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞.结果:从孕14 d SD胎鼠前脑分离的细胞在含有EGF和bFGF的无血清培养液中能形成大量的神经细胞球,这些神经细胞球可在体外增殖及传代培养,经nestin染色鉴定,大部分为阳性细胞.神经细胞球在血清培养液贴壁培养后可分化出神经纤维细丝(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、半乳糖脑苷脂(Gal-C)表达阳性的细胞.结论:从孕14 d SD胎鼠前脑分离的细胞具有自我更新能力和多向分化潜能,属于神经干细胞;在含有EGF和bFGF的无血清培养液中,神经干细胞能在体外大量扩增.     

体外培养的嗅上皮神经干细胞具有多潜能性

目的:探讨成体嗅上皮神经干细胞(olfactory epithelium neural stem cells)的培养方法及其体外分化的多潜能性。方法:使用中性蛋白酶和Ⅰ型胶原酶分阶段酶解消化嗅上皮,富集嗅上皮神经干细胞,扩增细胞,用加入生长因子bFGF和EGF的无血清培养液促使其形成神经球。血清诱导神经球分化并用免疫细胞化学染色方法鉴定分化细胞。结果:原代培养的嗅上皮神经干细胞呈集落样增殖,集落中的细胞表达在体分子标记GBC2和细胞角蛋白5。传代细胞用含生长因子的无血清培养液培养可增殖形成神经球。用含血清的培养液可诱导神经球分化;从神经球迁移出的分化细胞具有很高的异质性,其中包含有TUJ1阳性的神经元、P75NGFR阳性的嗅鞘细胞、GFAP阳性的星形胶质细胞和NG2阳性的寡突胶前体细胞,同时也存在有nestin阳性的神经干细胞。结论:成体嗅上皮神经干细胞可体外培养增殖形成神经球,神经球细胞具有向神经元、星形胶质细胞和寡突胶前体细胞分化的潜能。     

胎鼠大脑皮层神经干细胞的分离培养、分化及鉴定

目的:建立胎鼠大脑皮层神经干细胞体外分离、培养、分化及鉴定的方法,探讨神经干细胞的基本生物学特性.方法:取孕14 d胎鼠大脑皮层,吸管吹打机械分离制成单细胞悬液,采用无血清培养和胎牛血清诱导分化,应用免疫荧光技术鉴定神经干细胞及其分化的子代细胞.结果:从胎鼠大脑皮层分离的细胞呈神经巢蛋白(Nestin)免疫阳性并能在体外传代培养,血清诱导分化后的细胞可表达神经元、星形胶质细胞的特异性抗原微管相关蛋白2和胶质纤维酸性蛋白,诱导分化成的神经元能表达突触的特异性标志Synatophymin.结论:分离和培养的细胞能表达神经干细胞的特异性标志物Nestin,并且具有很强的增殖能力和多向分化潜能,属于中枢神经系统的神经干细胞.     

大鼠神经干细胞通过Wnt/β-catenin途径抑制神经胶质瘤生长

\[摘要\]目的探讨大鼠神经干细胞对C6成胶质细胞瘤细胞生长的影响,并探讨可能的作用机制。方法采用0.4 μm孔径的Transwell小室将C6成胶质细胞瘤细胞和大鼠神经干细胞(NSCs)按不同比例\[(C6NSCs):51(2×1054×104)、11(2×1052×105)、15(4×1042×105)\]在无血清培养基中共培养7 d作为实验组,以单独培养的C6成胶质细胞瘤细胞作为对照组。采用SCID荷瘤动物模型观察共培养体系中C6成胶质细胞瘤细胞的成瘤能力;利用半定量RT-PCR及蛋白质印迹等方法分析在共培养体系中C6成胶质细胞瘤细胞凋亡相关基因(BMP2、c-Myc、Bcl-2、p53 mRNA)及Wnt信号分子蛋白(β-catenin、survivin)的表达。结果与实验组相比,对照组的组织切片中肿瘤细胞恶性程度高,有较多的核分裂像,核/质比例高;大片区域出现单核或多核瘤巨细胞。在实验组中,随着共培养体系中起始神经干细胞比例增高,肿瘤细胞异型性逐步降低。随着共培养体系中起始神经干细胞比例增高,C6成胶质细胞瘤细胞p53 mRNA的表达水平逐步增高,BMP2、c-Myc、Bcl-2 mRNA表达水平则逐步降低(P<0.05),β-catenin、survivin蛋白表达水平逐步降低(P<0.05)。结论大鼠神经干细胞在胶质瘤微环境中可能通过Wnt/β-catenin途径促进神经胶质瘤细胞凋亡进而抑制神经胶质瘤生长。     

转化生长因子β1对体外大鼠星形胶质细胞形态及胶质纤维酸性蛋白表达的影响

目的:研究转化生长因子β1 ( TGF-β1) 对培养的大鼠大脑皮层星形胶质细胞形态及胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达的影响. 方法:体外培养的大鼠皮层星形胶质细胞随机分为对照组(无血清培养基培养)和实验组(分别含1, 2, 4 μg/L TGF-β1的无血清培养基培养). 培养24 h后,用相差显微镜观察星形胶质细胞的形态学变化,用RT-PCR和免疫印迹法检测GFAP mRNA和蛋白的表达. 结果:随着TGF-β1浓度的增加,细胞变形趋势越来越明显,GFAP mRNA和蛋白表达也随之增加. 结论:TGF-β1 能上调星形胶质细胞 GFAP的表达并且诱导细胞发生形态改变.     

新生大鼠海马神经干细胞表达趋化因子受体CCR2的体外研究

目的 探讨趋化因子受体CCR2在体外培养神经干细胞的表达.方法 采用无血清方法分离、培养新生大鼠海马神经干细胞,细胞免疫荧光方法检测神经干细胞标志巢蛋白(nestin)表达及干细胞多向分化为神经元及胶质细胞的能力,通过细胞免疫荧光及RT-PCR的方法检测神经干细胞表达趋化因子受体CCR2的情况.结果 体外培养新生大鼠海马神经干细胞呈nestin阳性,可分化为NF200阳性神经元、GFAP阳性星形胶质细胞及CNP阳性少突胶质细胞,CCR2细胞免疫荧光及RT-PCR证实神经干细胞表达趋化因子受体CCR2.结论 新生大鼠海马神经干细胞表达趋化因子受体CCR2,为进一步研究其体内、外迁移提供理论依据.     

Study on the migration of nerve stem cell in vitro Induced by glioma cells

Objective： Previous studies have shown that glioma cells induced the migration of nerve stem cells （NSCs） in vivo. This study was exploring whether this situation could happen in vitro. Methods： Supematant from 05 glioma cell lines or astrocytes cultured in serum-free medium growing in logarithmic phase were separately placed in lower chambers and NSCs were placed in the upper chambers of Trans-well culture system. After 36 h co-incubation, these NSCs spheres occurred on the middle membrane were counted. Results： Results demonstrated that the supematant from 05 glioma cell culture, not from the astrocytes, enhanced the migration of NSCs （ P 〈0.01）. Conclusion： Some components in 05 glioma cell culture can attract the migration of NSCs.     

胰岛素样生长因子-1诱导新生小鼠海马源性神经干细胞增殖分化的研究

目的探讨胰岛素样生长因子-1（IGF-1）对新生小鼠海马源性神经干细胞（NSCs）增殖和分化的影响。方法通过取新生C57BL／6J小鼠海马组织,机械分离,体外培养NSCs,特异性标志蛋白Nestin免疫荧光鉴定。在细胞培养液中加入100μg／L的IGF-1记为IGF-1组,同时设立正常细胞对照组。CCK-8试剂盒检测细胞增殖情况,GFAP、133Tubulin细胞免疫化学检测细胞分化情况。结果体外成功培养NSCs,特异性蛋白Nes-tin具有表达。IGF-1组NSCs较对照组增殖显著,且IGF-1组细胞具有显著的迁移和分化能力。细胞免疫荧光鉴定,IGF-1可促进细胞分化为星形胶质细胞和神经元（P〈0．05）。结论IGF-1能够促进体外培养的新生小鼠海马源性NSCs增殖,并诱导NSCs向星形胶质细胞和神经元分化。     

体外诱导人胚胎干细胞定向分化为神经干细胞

目的:探讨体外定向诱导人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)生成高纯度神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的方法.方法:模拟体内神经细胞分化发育的不同阶段及微环境,分三阶段诱导hESCs定向生成NSCs.形态学观察结合免疫荧光细胞化学、流式细胞术和RT-PCR检测胚胎干细胞标志和神经干细胞标志;NSCs分化实验对所诱导的NSCs的分化潜能进行检测.结果:体外培养的hESCs在胚胎成纤维细胞饲养层上连续传代培养50代,仍保持SSEA-4,TRA-1-81阳性,表达Nanog基因,流式细胞术检测SSEA-4阳性表达率为83.44%;经三步法最终可诱导形成纯度高达90%以上的nestin阳性细胞,表达nestin基因,流式细胞术检测nestin阳性表达率为89.38%;诱导生成的细胞反复传代,仍表现为nestin阳性,并可进一步分化为神经元、星形神经胶质细胞和少突胶质细胞.结论:模拟体内神经分化过程的三步诱导法,可诱导hESCs生成较高纯度的NSCs,并能较好维持其干细胞特性和具有进一步分化的能力.     

大鼠胚胎神经干细胞的分离培养及分化研究

目的:研究大鼠胚胎神经干细胞体外分离、培养的条件及增殖、分化特性。方法:取胎龄15~17 d的SD大鼠胎脑海马及室周组织,在含碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF),表皮生长因子(EGF),B27、N2添加剂的无血清培养基中培养,用有限稀释法进行克隆、传代,免疫细胞化学法鉴定神经干细胞克隆球及诱导分化后的细胞。结果:大鼠胎脑能在体外培养获得大量神经干细胞,并分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。结论:胚胎脑组织有丰富的神经干细胞,可在体外长期培养并保持干细胞特性,能分化为神经元、胶质细胞等终末细胞。     

脂肪源性神经干细胞诱导分化为γ-氨基丁酸能神经元的体外研究

目的探讨诱导脂肪源性神经干细胞(neural stem cells,NSCs)分化为GABA能神经元的体外培养方法,为细胞移植修复神经系统损伤提供种子细胞。方法贴壁培养C57BL/6小鼠(附睾脂肪垫)脂肪来源的干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs),流式细胞仪进行表型鉴定(CD45、CD90、CD105)及标志物纤连蛋白(fibronectin)鉴定后,在碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、2%B27的Neuro-basal培养基中诱导成NSCs。用免疫荧光细胞染色法进行NSC特异性标记物Nestin、增殖能力BrdU检测,再次添加脑源性神经营养因子、骨形成蛋白2后,维甲酸(RA)诱导分化为γ-氨基丁酸能神经元,并进行其标志物GABA的检测。结果分离纯化的ADSCs CD90、CD105表达强阳性,CD45表达阴性;诱导后的干细胞球经Nestin及BrdU鉴定为NSCs,且具有较强的增殖能力;神经干细胞诱导分化后的神经元GABA抗体染色呈阳性。结论在特定神经营养因子作用下,ADSCs在体外诱导生成的NSCs可被诱导分化为GABA能神经元。     

新生大鼠大脑皮质神经干细胞的分离培养与胆碱能神经元的鉴定

目的:体外分离和培养新生大鼠大脑皮质神经干细胞并进行鉴定,为用于脑梗死动物模型梗死区移植细胞作准备.方法:分离新生大鼠皮质神经干细胞,进行体外培养,使用免疫细胞荧光染色技术对细胞的特性进行鉴定,并对细胞的胆碱能特征进行鉴定.结果:获得了Nestin阳性的神经干细胞,其分化后可获得MAP-2、GFAP和 CNPase阳性的神经元、星形胶质细胞和寡突胶质细胞;通过胆碱能鉴定发现大脑皮质干细胞可分化为胆碱能神经元. 结论:体外分离和培养的大脑皮质神经干细胞具有增殖分化的能力,并可以分化为胆碱能神经元,有望应用于皮质损伤后认知障碍及运动障碍的细胞移植治疗.     

氯化甲基汞抗大鼠C6胶质瘤细胞的体外研究

目的：通过体外实验探讨氯化甲基汞（MMC）抗大鼠C6胶质瘤细胞的作用。方法：体 外培养C6胶质瘤细胞,分为空白对照组和MMC给药实验组（将0.08～10.00 μmol•L MMC按浓度梯度分为8组）。采用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测不同浓度MMC对体外养C6胶质瘤细胞的增殖抑制和杀伤作用,采用流式细胞仪测定MMC对C6胶质瘤细胞凋亡和细胞周期的影响。结果：1.25、2.50、5.00和10.00 μmol•L^-1的MMC在体外均可抑制C6胶质瘤细胞的增殖,C6胶质瘤细胞存活率明显低于对照组（P<0.05）,增殖抑制作用随浓度的增加而增强。2.50、5.00和10.00 μmol•L^-1 MMC 作用于C6胶质瘤细胞4、8、16和32 h后细胞存活率明显低于对照组（P<0.05）,细胞杀伤作用随浓度的增加和时间的延长而增强。0.31、0.63、2.50、5.00和10.00 μmol•L^-1 MMC作用于C6胶质瘤细胞24h后细胞凋亡/坏死率明显高于对照组（P<0.05）。1.25、2.50和5.00 μmol•L^-1 MMC 作用于C6胶质瘤细胞72 h后,G₀/G₁期细胞百分率明显高于对照组（P<0.05）,S期细胞百分率明显低于对照组（P<0.05）。结论：MMC能够杀伤大鼠C6胶质瘤细胞,抑制增殖,诱导凋亡,具有应用于胶质瘤治疗 的潜在价值。     

恶性胶质瘤细胞诱导内皮细胞三维成型的体外实验

目的观察在三维胶原体外培养条件下恶性胶质瘤细胞体外诱导内皮细胞血管生成的作用.方法采用鼠尾胶原作为内皮细胞样细胞ECV-304培养的支架,以恶性胶质瘤细胞系SHG-44作为诱导条件,观测ECV-304细胞生长和小管样结构形成的过程,测定形成曲线、小管管径和管长以及细胞周期,比较有和无SHG-44细胞诱导ECV-304细胞形成小管样结构的差异.结果 SHG-44细胞对体外三维培养的ECV-304细胞具有诱导小管形成的作用,所诱导的小管管径和管长数值均较对照组大,小管形成时间早.结论恶性胶质瘤细胞能促进内皮细胞的生长、迁移和小管结构的形成,是研究体外血管生成研究的良好模型.