应用TK自杀基因治疗骨肉瘤的研究进展

近年来，人们针对骨肉瘤及其肺转移的基因治疗方面进行了多领域的研究，尤其是在应用自杀基因治疗骨肉瘤方面取得了许多可喜成果，比如替代性前体药物的研究、肿瘤特异性启动子联合自杀基因的研究等。本文就TK自杀基因在骨肉瘤基因治疗中的研究进展进行综述。     

肿瘤基因治疗的研究进展

基因治疗是指将外源正常基因通过基因转移技术导入靶细胞,纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病,以达到治疗目的的一种生物治疗方法。本文从自杀基因、基因沉默、抑癌基因、免疫基因、抑制血管生成基因等几方面综述了近几年肿瘤基因治疗的研究和发展现状。自杀基因治疗系统包括HSV-tkGCV系统、H19 RNA、hTERT等,HSV-tkGCV系统是自杀基因治疗系统研究最多的一种,TK基因是药敏基因,肿瘤细胞转染该基因后,对前体药物丙氧鸟苷(GCV)或无环鸟苷(ACV)变得敏感而能被杀死。RNA干扰是基因沉默治疗的主要方式,通过沉默肿瘤相关基因IDO2、DUSP6、IGF1R、ORAOV1等基因可以明显抑制肿瘤生长。抑癌基因激活或过表达可以抑制肿瘤生长,p53和PTEN是两个最有意义的抑癌基因,重组腺病毒p53和PTEN可以显著抑制肿瘤生长。免疫基因治疗是将细胞因子或共刺激分子基因导入肿瘤细胞或体细胞内,通过激发或调动机体免疫功能来控制或杀伤肿瘤细胞,常用的免疫效应细胞有TIL、CTL、LAK、NK等,可供选择的目的基因有肿瘤坏死因子、白介素、集落刺激因子、干扰素、趋化因子等。抑制血管生成基因可以通过抑制肿瘤新生血管的生成,来阻止肿瘤生长和侵袭,VEGF-Trap、PEDF、ES通过腺病毒导入肿瘤可以显著抑制肿瘤生长。目前肿瘤基因治疗在特异性、安全性和靶向性方面依然存在亟需解决的问题。      

CD-UPRT融合自杀基因治疗肺癌的研究进程

随着肿瘤基因研究,广泛运用自杀基因（suicide gene）用于各种恶性肿瘤治疗,CD（cytosine deaminase）、TK（thymidine kinase）等自杀基因治疗人类多种恶性肿瘤已取得了令人瞩目的成绩。     

MDR1启动子调控的双自杀基因真核表达载体的构建及其在K562/A02细胞中的表达

目的：构建多药耐药基因（MDR1）启动子调控的CD-TK双自杀基因真核表达载体用于耐药白血病的靶向性基因治疗。方法：采用PCR方法从K562/A02细胞基因组DNA中扩增MDR1启动子，将其连接到双自杀基因CD TK的上游，构建pcDNA3 MDR1 Promoter CD-TK真核表达载体，用脂质体介导法将构建好的载体转染入K562、K562/A02细胞，PCR鉴定CD、TK基因的整合，RT-PCR鉴定CD、TK基因的表达。结果：PCR克隆出MDR1启动子经DNA测序证实序列正确，通过连接成功构建含正确目的基因的表达载体pcDNA3-MDR1-Promoter-CD-TK。转染入细胞后PCR结果显示，CD、TK基因均整合入K562、K562/A02细胞中，RT-PCR结果显示,562/A02/CD TK细胞CD、TK基因有特异性条带表达，而K562/CD TK细胞无特异性条带。结论： MDR1启动子调控的CD TK双自杀基因真核表达载体的成功构建及其在K562/A02细胞中的特异性表达为耐药白血病的靶向性基因治疗提供了实验基础。     

经膀胱灌注阳离子脂质体介导的HVS-TK基因对大鼠膀胱癌的杀伤作用

目的观察阳离子脂质体介导的HSV—TK基因经尿道膀胱灌注对大鼠膀胱肿瘤体内杀伤作用。方法N-甲基亚硝基脲(MNU)膀胱灌注诱导雌性Wistar大鼠膀胱肿瘤。经尿道HSV—TK基因膀胱灌注后，RT—PCR检测肿瘤组织中TK基因表达；TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡；荷瘤膀胱总重量测定。结果HSV—TK基因经尿道膀胱灌注后．RT—PCR检测膀胱肿瘤组织有TK基因mRNA表达；TUNEL法凋亡检测，荷瘤膀胱总重量测定，提示治疗组与对照组差异有显著性。结论经尿道膀胱灌注阳离子脂质体-TK复合物可转导TK基因；联合GCV治疗，肿瘤生长被抑制；诱导肿瘤细胞凋亡可能是HSV—TK／GCV系统作用机理之一。     

双自杀基因融合基因重组腺病毒的制备与鉴定

目的：制备含胞嘧部氨酶（CD）基因，胸苷激酶（TK）基因的融合基因重组腺病毒，为恶性肿瘤的基因治疗研究作准备。方法：构建包含有CD，TK融合基因的重组粘粒，将其与腺病毒DNA末端肽复合物混合后以磷酸钙共沉淀法转染人胚肾293细胞株细胞，获取重组腺病毒，并进行鉴定。结果：酶切结果及PCR结果显示，重组粘粒中CD，TK融合基因插入正确，经鉴定所获重组腺病毒带有融合基因，并且无具有复制能力的腺病毒存在。结论：所获重组病毒为E1，E3缺陷型，含有所需的双自杀基因，可进一步用于基因治疗研究。     

腺病毒载体介导的CD自杀基因体外抑瘤效果观察

目的:构建含CD基因的腺病毒载体pAd-CD, 进行肿瘤的自杀基因治疗.方法:分别构建了含CD基因和LacZ基因的重组病毒质粒载体,同质粒pJM17共转染293细胞同源重组后包装为感染性腺病毒颗粒,经滴度测定后,体外分别感染小鼠前胃癌肿瘤细胞MFC.结果:感染Ad-LacZ的细胞可被X-gal染成蓝色,感染Ad-CD的细胞予前药5-FC可见肿瘤细胞杀伤效果明显.结论:腺病毒载体可有效地转CD和LacZ基因进入肿瘤细胞,C D基因作为自杀基因进行体外肿瘤治疗效果明显,本实验构建的新载体及结果为下一步应用于体内肿瘤基因治疗研究提供了基础.     

腺病毒介导融合双自杀基因治疗膀胱癌

目的 探讨腺病毒介导胞嘧啶脱氨酶（CD）和胸苷激酶（TK）融合双自杀基因系统对膀胱癌治疗作用并与单基因系统作比较。方法 利用含有CD-TK双自杀融合基因及绿色荧光蛋白（GFP）基因的复制缺陷腺病毒作载体,PCR检测CD、TK及E1基因。建立C57BL／6同系膀胱癌Mb49皮下移植瘤模型,观察肿瘤注射腺病毒联合丙氧鸟苷（GCV）或／和5-氟胞嘧啶（5-FC）治疗后肿瘤体积及组织学变化。结果 PCR可检测到腺病毒DNA中含CD及TK基因、无E1基因。腺病毒注射联合GCV、5-FC、GCV＋5-FC治疗后,肿瘤体积与对照组相比明显缩小（P=0.00）,腺病毒注射联合GCV＋5-FC有协同作用（P=0．04）,优于腺病毒注射联合GCV以及腺病毒注射5-FC。基因治疗后肿瘤细胞大片坏死．对照组细胞形态无变化。结论 腺病毒介导CD-TK融合双自杀基因联合GCV或／和5-FC能有效治疗膀胱癌,融合双自杀基因CD-TK／（GCV＋5-FC）系统对膀胱癌治疗有协同作用,其效果优于CD-TK／GCV或CD-TK／5-FC系统。     

重组表达载体pIRES-CD、pIRES-TK的构建及其在ACC-2细胞中的表达

目的：运用分子生物学技术扩增CD、TK基因，进行其DNA序列分析，并构建真核表达质粒pIRES-CD及pIRES-TK，将其共同转染ACC-2细胞，为进一步研究双自杀基因对ACC-2细胞杀伤作用奠定基础。方法：根据CD和TK基因DNA的序列分别设计、合成引物，构建克隆载体pMD18-T-CD和pMD18-T-TK,并进行DNA序列分析；构建以内部核糖体进入位点 (IRES)相连的CD和TK基因的真核表达质粒pIRES-CD及pIRES-TK，用电穿孔法以真核表达质粒共同转染ACC-2细胞，用RT-PCR检测CD和TK的表达。结果：克隆DNA片段和GeneBank上报道的CD、TK序列基本一致，且经酶切鉴定,CD、TK基因成功插入真核表达质粒IRES，R-PCR检测表明，以真核表达质粒pIRES-CD及pIRES-TK共同转染的ACC-2细胞能表达CD和TK。结论：成功扩增了CD、TK的DNA片段，并进行了序列分析；成功构建CD和TK基因的重组真核表达质粒pIRES-CD及pIRES-TK，将其转染ACC-2细胞后能分泌性表达CD和TK，为肿瘤基因治疗的研究提供一定途径。     

应用两步氯化钙转化法高效制备双自杀基因重组腺病毒

目的 构建巨细胞病毒(CMV)启动子驱动下的双自杀基因重组腺病毒。方法 应用PCR扩增出CD和TK基因，经适当改造后插入pAdtrack CMV中构建成转移质粒pAdtrack CMV-CDTK。经酶切线性化后。转化用氯化钙制备的感受态AdEasier-1细菌，获得重组腺病毒质粒。最后将线性化的重组腺病毒质粒转染293细胞包装获得重组腺病毒。滴度测定后，体外感染血管内皮细胞ECV304。结果 PCR检测表明已成功构建了含CD、TK融合基因的重组腺病毒，为进一步开展肿瘤的双自杀基因治疗研究奠定了基础。结论 应用改进后的AdEasy系统构建腺病毒相比于传统AdEasy系统，方法更简便、成功率更高、实验周期更短。     

结直肠癌的基因治疗

结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤,目前治疗以外科手术为主,辅以放、化疗,术后5年生存率在50%左右。肿瘤基因治疗发展迅速,作为一种新的辅助治疗手段有重要意义。结直肠癌中研究比较多的是免疫基因治疗、自杀基因治疗、抑癌基因的应用等。基因疗法可以有效地杀伤肿瘤细胞,联合传统治疗方法可延长结直肠癌患者的生存时间,提高生活质量。     

六味地黄丸对小鼠移植性肝癌自杀基因治疗增效作用的病理学研究

【目的】探讨六味地黄丸对小鼠移植性肝癌HSVt-k/GCV自杀基因治疗增效作用的病理学机制。【方法】昆明种小鼠90只,随机分为5组:正常对照组、模型对照组、六味地黄丸治疗组(剂量为10 g.kg-1.d-1)、自杀基因治疗组(腹腔注射丙氧鸟苷100 mg.kg-1.d-1)、联合治疗组;选用H22与H22/tk细胞株皮下接种建立小鼠荷肝癌模型,以自杀基因疗法联合六味地黄丸进行治疗并观察疗效;对肿瘤组织进行病理学观察和半定量分析;采用免疫组化技术及原位末端标记(TUNEL)技术观察肿瘤细胞增殖核抗原(PCNA)的表达及凋亡情况。【结果】HSVt-k/GCV自杀基因系统联合六味地黄丸治疗较单独应用HSVt-k/GCV系统或六味地黄丸能更显著地抑制肿瘤生长;免疫组化及凋亡TUNEL染色结果表明联合治疗组对肿瘤细胞增殖的抑制及对肿瘤细胞凋亡的诱导作用与模型对照组比较,差异均有显著性意义(P<0.05)。【结论】六味地黄丸对实验性肝癌的自杀基因治疗具有增效作用,其机制可能与六味地黄丸抑制了自杀基因治疗过程中肿瘤细胞的加速增殖有关,也与协同促进自杀基因治疗诱导的肿瘤细胞凋亡有关。     

HSV-tk/GCV系统对鼠膀胱癌的自杀基因治疗研究

目的:在体外和体内水平建立膀胱癌的单纯疱疹病毒-胸苷激酶/丙氧鸟苷(herpes simplex virus type thymidine Kinase/ganciclovir,HSV-tk/GCV)自杀基因系统,并验证该系统的有效性.方法:用逆转录病毒载体HSV-TK转染鼠膀胱癌细胞株T739,体外检测其对GCV的敏感性,在同基因鼠,分别建立T739和T739-TK膀胱癌腹腔肿瘤模型.当B超显示肿瘤直径约0.5～0.8cm时,腹腔GCV给药6天,然后观察肿瘤大小变化及动物存活时间.结果:GCV对T739-TK细胞有显著杀伤作用,而对T739细胞的生长无影响,成功的建立了T739同基因鼠膀胱癌腹腔肿瘤模型,体内实验得到相应结果,转染了TK基因的T739鼠肿瘤明显变小,甚至消失,而未转染TK基因的T739鼠肿瘤继续增大,GCV对其无明显治疗作用,转染了TK基因的T739鼠存活时间显著延长.结论:在体外和体内水平,表达TK基因的肿瘤细胞均被GCV有效杀伤,这表明HSV-tk/GCV系统有可能成为基因治疗膀胱癌的有效方法.     

慢病毒介导的双自杀基因对大肠肿瘤细胞的靶向杀伤作用

目的 研究慢病毒介导的KDR启动子驱动CD/TK双自杀基因系统对大肠肿瘤细胞选择性杀伤作用.方法 构建的重组FGW-KDRP-CD/TK慢病毒载体在293T细胞包装扩增后,获得病毒颗粒,体外感染表达KDR的LOVO细胞株和不表达KDR的LS174T细胞株,以RT-PCR方法检测转基因细胞CDglyTK的表达,然后给予不同浓度的前药5-FC及GCV处理,观察该体系对不同细胞株的杀伤效应.结果 重组体对各细胞株的感染率相似,RT-PCR方法检测发现:除LS174T细胞外,LOVO细胞有目的基因CDglyTK的表达.LOVO与LS174T细胞株对前药敏感性有显著性差异(P＜0.001),双自杀基因的疗效优于任一单自杀基因的疗效(P＜0.001).结论 KDR启动子可调控双自杀基因系统选择性杀伤表达KDR的大肠肿瘤细胞.     

双自杀基因CD+TK对胰腺癌BxPC-3细胞的影响

目的探讨逆转录病毒介导的双自杀基因对胰腺癌BxPC-3细胞的杀伤作用及胰腺癌的基因治疗方法。方法通过脂质体将含有双自杀基因的逆转录病毒载体MMLV—CD＋TK导入包装细胞PA317，经G418筛选后大量培养产病毒的阳性克隆PA317／CD＋TK细胞株，收集病毒上清液，浓缩后转染胰腺癌BxPG3细胞系，再次经G418筛选，获得稳定表达双自杀基因的BxPC-3／CD＋TK细胞株。用RT—PCR检测双自杀基因的表达。给予前体药物5-氟胞嘧啶（5-flourocytosine，5-FC）和（或）无环鸟苷（Ganciciovir，GCV）后，MTT法测定转基因组及未转基因组胰腺癌BxPC-3系细胞的存活率。结果双自杀基因在胰腺癌BxPC-3系细胞中可稳定表达，联合使用5-FC和GCV对细胞增殖的杀伤作用及旁杀伤效应效果明显。结论逆转录病毒介导自杀基因可有效杀死胰腺癌Bx-PC-3系细胞，双自杀基因具有更强的抗肿瘤作用。     

pGEX-4T-2-TK原核表达质粒的构建及其表达

目的 构建含胸苷激酶基因(TK自杀基因)的pGEX-4T-2-TK原核表达质粒,观察其在大肠杆菌中表达情况,为肿瘤基因治疗奠定基础.方法 聚合酶链式反应(PCR)扩增TK基因片段,利用限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ将其连接至原核表达载体pGEX-4T-2内,再将连接产物转化入大肠杆菌,挑取单菌落,提取质粒,经PCR和双酶切鉴定后测序.将转化正确的大肠杆菌培养过夜,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后观察蛋白表达情况.结果 TK基因片段成功连接至载体pGEX-4T-2中,在大肠杆菌BL21中可得到稳定表达的目的 蛋白.结论 pGEX-4T-2-TK原核表达质粒构建成功,为后续肿瘤基因治疗研究奠定了基础.     

自杀基因联合中医药疗法治疗肿瘤的设想

自杀基因疗法是一种具有良好应用前景的肿瘤治疗新措施。但如何有效提高疗效是目前仍须解决的关键性问题。由于免疫机制在自杀基因疗法旁杀伤效应中的重要作用，激活荷瘤机体的免疫功能，改善自杀基因抗肿瘤作用的炎症免疫微环境，是提高肿瘤自杀基因疗法疗效的主要策略。中医中药在调节机体免疫状态方面具有肯定的作用，与其他方法比较具有明显优势。因而，将自杀基因疗法与中医中药联合应用，有可能起到提高肿瘤自杀基因疗法疗效，防止肿瘤复发的作用。提出了自杀基因联合中医药疗法治疗肿瘤的新设想，为肿瘤基因治疗提供了一种新的思路和模式。     

肝癌自杀基因治疗最新进展

自杀基因治疗是指利用基因工程技术将某些细菌或病毒基因(目的基因)与载体相结合,并导入肿瘤细胞中,在一定条件下目的基因持续高效表达,从而杀伤肿瘤细胞,所以又称为“病毒导向酶解药物前体疗法。这些病毒或细菌的基因表达产物(酶)能导致受体细胞的死亡,因此将这些基因称为自杀基因。本文就肝癌自杀基因治疗的最新进展作一综述。     

肿瘤的“自杀基因”疗法研究进展

肿瘤是基因发生变化的疾病,是累积性基因损伤在转化表型方面达到顶点的结果。在有关肿瘤基因治疗方面,将“自杀基因”（ｓｕｉｃｉｄｅｇｅｎｅ）导入肿瘤细胞,而将无毒性前体药物在肿瘤细胞内代谢为毒性产物,进而杀伤肿瘤细胞的“自杀基因”疗法占有重要地位并显示出良好的应用前景,本文对该方面的研究进展作一综述。１　“自杀基因”的种类及作用原理人们早就发现,一些来自病毒或细菌的基因具有一些特殊的功能,其表达产物可将原先对哺乳动物细胞无毒的或极低毒性的药物转换成毒性产物,导致这些细胞的死亡。人们将这些基因转入靶细…     

肝癌的基因治疗近况

肝癌是一种恶性程度极高及预后极差的恶性肿瘤 ,尽管目前肝癌的治疗方法较多 ,但仍未能从根本上改善病人的预后。随着肿瘤分子生物学和免疫学理论及技术的发展 ,在一定程度上阐明了肝癌的发生、发展及演变过程。研究表明 ,肝癌是由多基因突变引起的 ,故用基因工程的手段进行肝癌的基因治疗 ,是目前医学界研究的热点。现有关文献综述如下。1　自杀基因治疗　　自杀基因治疗就是通过基因转染技术使目的基因选择性表达在肿瘤细胞内 ,方能准确地杀伤肿瘤的细胞 ,保护正常组织 ,减少毒副作用。目前已发现和克隆出多种自杀基因 ,其中研究最为深入…