果糖氨基酸氧化酶的原核表达及在糖化血红蛋白检测中的初步应用

摘要：目的：原核表达果糖氨基酸氧化酶（FAOX）,建立检测糖化血红蛋白A1c（HbA1c）的酶法并作初步评价。 方法：构建重组质粒pET32a(+)/FAOX,转化大肠埃希菌Rosetta(DE3),获得重组FAOX;以糖基化六肽为底物检测酶活性;初步建立检测HbA1c的酶法并进行方法学评价。 结果：重组FAOX在Rosetta(DE3)中高效表达,SDS-PAGE电泳分析显示其相对分子质量（Mr）约65 000;酶比活性为22 U/mg;建立的检测HbA1c酶法的批内、批间、日间CV均<5%;低值（5.1%）和高值（15.8%）HbA1c的回收率分别为98.1%和98.9%;总胆红素(＜220 μmol/L）、三酰甘油(＜10.8 mmol/L）和维生素C(＜500 mg/L）对酶法检测HbA1c无影响;与HPLC法和HA-8160型全自动糖化血红蛋白仪测定结果进行比较,相关系数分别为0.977和0.993。 结论：FAOX可在大肠埃希菌Rosetta(DE3)中高效表达,用其建立的检测HbA1c的酶法可满足临床对HbA1c测定的要求。     

糖化血红蛋白五种检测方法的评价

目的：将糖化血红蛋白测定的电泳法、亲和层析法、酶法和免疫法和HPLC法进行比较及评估，为临床医师及实验室在分析不同方法检测糖化血红蛋白结果时提供参考。方法正常对照组45例， DM患者44例，每一份标本在同样条件下用五种方法检测HbA1c，记录测定结果，用于对比分析；选择具有医学决定水平的正常和异常浓度的样本，分别采用5个样本，批内在同一天内重复20次；批间分别在7 d内进行10次测试。计算出批内和批间的均值、标准差和CV值；收集HbA1c高的糖尿病患者的抗凝血，同时收集当天健康者的抗凝血。在各种干扰物不同浓度的影响下，如果 HbA1c的值上下浮动0.3%，则将视为受到干扰。采用SPSS16.0统计软件包对所测结果进行配对t检验（以HPLC组的实验数据为参照组），检验水准α=0.05。结果5种方法中除外硼酸亲和法，其他四种方法均符合要求；5种方法在4.0%～14.2%范围内线性良好，实测值与理论值的相关系数（r）在0.971～0.996之间，其中HPLC法最好；当加入各种干扰因素时，结果显示HPLC法、酶法、胶乳凝集法测得的HbA1c值上下浮动〈0.1%，可见性能稳定、不易受到各种干扰物的影响；电泳受溶血影响非常大；硼酸亲和法对溶血标本显示浓度太低时测不出数，脂血标本显示浓度太高时测不出数；通过标本量、测定时间、CV、r等指标进行比较, HPLC法各种指标远优于其他方法。结论高校液相色谱法（HPLC）作为金标准，批内和批间精密度在所采用的5种方法中是最好的，其次为酶法和胶乳凝集法，而硼酸亲和法的重复性则相对较差。电泳法结果与实验人员扫描和对电泳的波峰判断有关，主观随意性较大，现将HPLC法和电泳法、亲和层析法、酶法和免疫法进行比较，旨在为临床医师及检验科实验室在分析不同方法检测糖化血红蛋白结果时提供参考。     

免疫比浊法检测糖化血红蛋白A1c的性能评价

目的评价Roche公司第3代免疫比浊法检测糖化血红蛋白A1c(HbA1c)的性能。方法分析免疫比浊法检测HbA1c的精密度、线性,评价Hb、胎儿Hb(HbF)、三酰甘油(TG)、总胆红素(T-Bil)和不稳定HbA1c对HbA1c检测的影响、抗干扰能力及其与HPLC法测HbA1c结果的相关性;比较免疫比浊法检测HbA1c与高效液相色谱(HPLC)法的一致性。结果免疫比浊法检测HbA1c的变异系数(CV)均<2.5%。在4.7%～15.4%范围内,理论值与实测均值呈线性相关,r2值达0.999。Hb、HbF、T-Bil、TG水平分别在57～177 g/L、1.7%～11.7%、27～265μmol/L、3.2～9.85 mmol/L范围时,差异百分比均<5%;当HbF>13.5%时,差异百分比>5%。不稳定GHb(样本葡萄糖糖含量0～55.56 mmol/L)对HbA1c检测无影响。免疫比浊法(X)与高效液相色谱法(Y)相关性良好,Y=1.0188X-0.2271,r2=0.971 3。结论免疫比浊法检测HbA1c性能良好,适合临床应用。     

免疫比浊法检测肿瘤患者糖化血红蛋白假性升高原因分析

目的分析32例免疫比浊法检测肿瘤患者糖化血红蛋白（HbA1c）假性增高的原因及处理方法,为临床提供准确结果。方法回顾性分析生化仪免疫透射比浊法检测肿瘤患者血清HbA1c水平,用高效液相色谱法对HbA1c结果加以验证,并用毛细管电泳法确证未处理的样本HbA1c假性升高的影响因素,然后洗涤处理标本再次进行免疫比浊法的测定HbA1c水平。结果免疫透射比浊法检测部分肿瘤患者血清HbA1c可能引起假性增高,增高幅度可达到8.3%-19.2%,通过洗涤红细胞,HbA1c水平与高效液相色谱法所检测的结果基本一致（P〉0.05）。且用生理盐水处理与用正常血清处理结果比较差异无统计学意义（P〉0.05）。结论γ-球蛋白量的异常升高可导致免疫比浊法检测HbA1c假性增高,高效液相色谱法不受γ-球蛋白的影响。通过洗涤处理标本可以去除γ-球蛋白对免疫比浊法检测HbA1c的干扰。     

高血脂高胆红素对IE-HPLC法检测糖化血红蛋白干扰的评价

目的探讨高血脂和高胆红素对离子交换高效液相色谱法(IE-HPLC)检测糖化血红蛋白的干扰。方法将收集的新鲜EDTA-K2抗凝全血标本分成4组:对照组(HbA1c6.2%)、糖尿病组(HbA1c≥6.2%)、高血脂组(TG 3~20mmol/L)、高胆红素组(TBIL 21~549μmol/L)。分别用硼酸盐亲和层析高效液相色谱法(AC-HPLC)和IE-HPLC检测HbA1c。结果当HbA1c≤18.7%时IE-HPLC检测HbA1c相关系数r=0.993;95%置信区间(95%CI)为-0.71~0.89;偏差(%)为-5.8%~6.8%;差异无统计学意义(P=0.198)。当HbA1c16.3%时IE-HPLC检测HbA1c相关系数r=0.997;95%CI为-0.31~0.67;偏差(%)为-5.8%~4.3%;差异有统计学意义(P=0.000),结果无显著干扰;当%HbA1c为16.3~18.7时结果出现正偏倚。当TG≤20.78mmol/L时IE-HPLC检测HbA1c结果相关系数r=0.995;95%CI为-0.26~0.50;偏差(%)为-5.5%~5.8%;差异有统计学意义(P=0.000)结果无显著干扰;当TBIL≤549.3μmol/L对IE-HPLC检测HbA1c相关系数r=0.990;95%CI为-0.08~0.63;偏差(%)为-14%~4.1%;差异有统计学意义(P=0.000);当TBIL≤342.1μmol/L对IE-HPLC检测HbA1c相关系数r=0.994;95%CI为-0.09~0.50;偏差(%)为―5.5%~4.1%,结果无显著干扰;当TBIL为380.7~549.3μmol/L时结果出现负偏倚。结论实验数据表明IE-HPLC检测HbA1c有良好的抗脂血能力;当TBIL≤342.1μmol/L和HbA1c16.3%对检测HbA1c无明显干扰能满足一般临床检测需求;当HbA1c标本的TG≥20.78 mmol/L、TBIL≥342.1μmol/L、HbA1c≥16.3%临床工作者应结合患者本身情况选择更合适检测HbA1c的方法。     

HbF变异体对三种不同HbAlc检测系统的干扰评价

目的评价血红蛋白变异体F(HbF)对三种糖化血红蛋白(HbA1c)检测系统测定结果的干扰。三种方法分别为离子交换高效液相色谱法(IE-HPLC)、硼酸盐亲和层析高效液相色谱法(AC-HPLC)和免疫抑制比浊法。方法分别用三种检测系统检测血红蛋白结构正常标本及含有胎儿血红蛋白(HbF)的标本,依据美国国家糖化血红蛋白标准化计划(NGSP)的判定标准,对检测结果进行比对分析和偏倚评估。结果以Primus Ultra2(AC-HPLC)为比较系统,IE-HPLC和免疫比浊法为检测系统,两种检测系统与比较系统检测正常样品HbA1c值的相关性良好。当HbF≤8.75%时,IE-HPLC测定结果与比较系统偏差6%;HbF为17.50%时,IE-HPLC测定结果与比较系统偏差6%;当HbF浓度达35.00%~70.00%时IE-HPLC无法检测出结果。免疫比浊法测定不同HbF浓度HbA1c值与比较系统偏差均6%,测试几乎不受HbF的干扰。结论 HbF对不同HbA1c检测系统的干扰程度不同,临床实验室在进行HbA1c检测时,应注意血红蛋白变异体的存在,必要时选用替代指标或者合适的方法进行HbA1c测定以防止干扰的发生。     

测定CystatinC和β2-微球蛋白的颗粒增强透射免疫比浊试剂盒抗干扰性能评价

目的对测定半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(Cystatin C,Cys C)和β2-微球蛋白(β2-microglobulin,β2-MG)的颗粒增强透射免疫比浊法(PETIA)试剂盒的抗干扰性能进行评价。方法根据CLSI EP7-A2文件,对PETIA法Cys C和β2-MG试剂盒进行干扰评价试验。结果配对差异实验结果显示:1 000 U/L类风湿因子(RF)、1 450浊度乳糜微粒、342μmol/L游离胆红素(F-Bil)、342μmol/L结合胆红素(C-Bil)、30 mg/L维生素C(Vit C)对Cys C和β2-MG测定无干扰,5 g/L血红蛋白(Hb)对高浓度Cys C和低浓度β2-MG测定均有干扰;5个浓度系列的剂量效应实验结果显示,Hb对Cys C和β2-MG测定可产生非线性干扰。结论 PETIA法测定Cys C和β2-MG试剂盒具有较强的抗干扰能力,基本能满足临床需求。     

HbF变异体对三种不同HbA1c检测系统的干扰评价

目的 评价血红蛋白变异体F(HbF)对三种糖化血红蛋白(HbA1c)检测系统测定结果的干扰。三种方法分别为离子交换高效液相色谱法(IE-HPLC)、硼酸盐亲和层析高效液相色谱法(AC-HPLC)和免疫抑制比浊法。方法 分别用三种检测系统检测血红蛋白结构正常标本及含有胎儿血红蛋白(HbF)的标本,依据美国国家糖化血红蛋白标准化计划(NGSP)的判定标准,对检测结果进行比对分析和偏倚评估。结果 以Primus Ultra2(AC-HPLC)为比较系统,IE-HPLC和免疫比浊法为检测系统,两种检测系统与比较系统检测正常样品HbA1c值的相关性良好。当HbF≤8.75%时,IE-HPLC测定结果与比较系统偏差<6%; HbF为17.50%时,IE-HPLC测定结果与比较系统偏差>6%; 当HbF浓度达35.00%～70.00%时IE-HPLC无法检测出结果。免疫比浊法测定不同HbF浓度HbA1c值与比较系统偏差均<6%,测试几乎不受HbF的干扰。结论 HbF对不同HbA1c检测系统的干扰程度不同,临床实验室在进行HbA1c检测时,应注意血红蛋白变异体的存在,必要时选用替代指标或者合适的方法进行HbA1c测定以防止干扰的发生。     

糖化血红蛋白A1c的检测方法和干扰因素

糖化血红蛋白A1c(HbA1c)检测对糖尿病(DM)的诊断和监测至关重要。HbA1c检测方法根据其电荷,分子结构和免疫反应性不同可以分为离子交换法、电泳法、亲和色谱法、免疫学分析法和酶法等。每种方法都有其优势,如快速、重复性好、不受某些成分影响等,但也有方法会受到诸如氨甲酰化血红蛋白、血红蛋白变异体、血液系统疾病等因素的干扰。美国糖化血红蛋白标准化计划(NGSP)和国际临床化学与检验医学联合会(IFCC)推出的HbA1c标准化计划在HbA1c的检测方法及其干扰因素的调查方面做出了很多贡献。     

变异血红蛋白和氨基甲酰血红蛋白对糖化血红蛋白测定干扰的评价

目的评价变异血红蛋白和血红蛋白衍生物氨基甲酰血红蛋白对离子交换-高效液相色谱(HPLC)系统和用酶法检测糖化血红蛋白(HbAlc)的影响。方法分别用2种方法同时检测无尿毒症糖尿病患者血红蛋白结构正常的血液样本和含有不同浓度胎儿血红蛋白(HbF)的血液样本及尿毒症患者HbA1c浓度。结果对于血红蛋白结构正常且无尿毒症的糖尿病患者,2种方法的HbA1c检测结果差异无统计学意义(P>0.05)。当HbF<8.75%时,离子交换-HPLC的HbA1c测定结果与预期值无差异;当样本中HbF浓度为8.8%～23.0%时,其HbA1c测定结果要明显低于理论浓度;当HbF浓度达35.0%～70.0%时,离子交换-HPLC无法检测出结果。因尿毒症患者血液中含氨基甲酰血红蛋白,所以离子交换-HPLC的HbA1c检测结果明显高于酶法;而酶法检测HbA1c不受血液中HbF和氨基甲酰血红蛋白的干扰。结论采用离子交换-HPLC检测含HbF和氨基甲酰血红蛋白的样本中的HbA1c时,结果可能受到干扰;而酶法检测HbA1c时几乎不受样本中HbF和氨基甲酰血红蛋白的干扰。     

糖化血红蛋白与尿微量白蛋白联合检测诊断早期糖尿病肾病价值

目的探讨糖化血红蛋白（glycosylated hemoglobin,HbA1c）与尿微量白蛋白（microalbuminuria,MA）联合检测对早期糖尿病肾病的诊断价值。方法糖尿病患者142例（糖尿病组）,同期92名体检健康者（对照组）,分别应用酶法、免疫比浊法检测2组HbA1c,尿MA水平;将糖尿病组依据HbA1c分为低值、中值、高值3组,比较各组HbA1c,尿MA水平及HbA1c和尿MA单独与联合检测诊断糖尿病肾病的阳性率。结果 HbA1c和尿MA单独检测诊断糖尿病肾病符合率为61.2%和78.5%,联合检测符合率为98.1%,联合检测与单项检测比较差异有统计学意义（P〈0.05）。结论 HbA1c与尿MA联合检测诊断早期糖尿病肾病优于2项指标单独检测。     

颗粒增强免疫比浊法测定血清同型半胱氨酸的方法学评价

目的：对胶乳颗粒免疫比浊法测定血清同型半胱氨酸（HCY）的方法学进行初步评价。方法：应用胶乳颗粒免疫比浊法测定HCY的精密度、标准曲线、干扰实验、稳定性实验、并与循环酶法测定血清HCY的结果进行相关性分析。结果：颗粒增强免疫比浊法测定HCY的精密度（批内CV为1.87%、0.75%,批间CV为2.29%、5.35%）较高;HCY浓度在0μmol/L～50μmol/L范围内线性良好;当抗坏血酸浓度1107mg/L、胆红素浓度445 umol/L、血红蛋白浓度6.7 g/L;甘油三酯浓度14.6 mmol/L、氨离子浓度75 umol/L时均未对测定结果产生干扰;试剂开瓶后稳定周期也可达到25天;颗粒增强免疫比浊法和循环酶法测定HCY相关性良好（y =0.9904x ＋0.0813,r=0.9981）。结论：颗粒增强免疫比浊法测定血清HCY具有较高的精密度,结果准确可靠,适合临床实验室推广。     

2型糖尿病患者血糖和胱抑素C水平与肾脏早期病变的关系

目的探讨2型糖尿病(T2DM)患者糖化血红蛋白(HbA1c)、餐后2 h血糖(2 hPBG)、胱抑素C(Cy-sC)与24 h尿清蛋白排泄率(UAE)和肾脏早期病变的关系。方法选择135例空腹血糖(FBG)控制达标的T2DM患者及30例体检健康人群。HbA1c检测采用酶法,2 hPBG检测采用葡萄糖氧化酶法,CysC检测采用免疫比浊法,尿微量清蛋白(mALB)检测采用免疫比浊法,记录24 h尿量算出UAE。按照HbA1c及2 hPBG水平将135例患者分为A组(HbA1c<7%且PBG<10 mmol/L)、B组(HbA1c<7%且P≥10 mmol/L)、C组(HbA1c<7%且PBG<10 mmol/L)和D组(HbA1c≥7%且PBG≥10 mmol/L)。结果 135例T2DM患者UAE和CysC均高于健康对照组(P<0.01);HbA1c>7%组的UAE和CysC水平明显高于HbA1c<7%组,差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。2 hPBG和HbA1c未达标者的UAE和CysC明显高于达标者,也高于2 hPBG或HbA1c任何一项达标者。结论 T2DM患者FBG控制达标后,HbA1c及...     

警惕糖化血红蛋白A1c在地中海贫血患者中误用

毛细管电泳法检测3例不同基因突变和缺失的地中海贫血患者结果显示3例患者Hb均异常,用阳离子交换高效液相色谱法(IE-HPLC)检测其糖化血红蛋白A1c(HbA1c)图谱均出现异常,而用硼酸盐亲和层析法、免疫比浊法检测结果均在仪器可报告范围内,但该结果并不能代表患者HbA1c水平。检测HbA1c时要了解患者的Hb是否存在异常,以避免指标误用。     

糖化血红蛋白的检测技术与临床应用进展

正常血红蛋白有3种：血红蛋白A（HbA）,血红蛋白F（HbF）,血红蛋白A2（HbA2）,成人红细胞中主要含有HbA。在用层析法分离血红蛋白时,可洗脱出3种含糖成分：HbA1a、HbA1b和HbA1c合称为糖化血红蛋白（GHb）。糖化血红蛋白（HbA1c）是血液中红细胞内血红蛋白与血糖结合的产物。     

分析前标本不同处理方法对HLC-723G8测定糖化血红蛋白结果的影响

目的 探讨分析前标本不同处理方法对HLC-723G8糖化血红蛋白分析仪测定糖化血红蛋白(HbA1c)结果的影响.方法 选取EDTA抗凝全血标本100份(HbA1c 3.8%～15.0%),每份标本分别按5 μL原血+2.5 mL溶血剂、5 μL原血+0.6 mL溶血剂进行稀释,对稀释标本进行检测.结果 100份不同处理方法检测结果差异无统计学意义(P＞0.05).结论 分析前标本不同处理方法对HLC-723G8糖化血红蛋白分析仪测定HbA1c结果无影响.     

TINIA检测HbA_(1c)的性能评价及和IE-HPLC在HbE患者中的应用比较

目的评价免疫抑制比浊法(TINIA)检测糖化血红蛋白(HbA1c)的分析性能,与离子交换高效液相色谱法(IE-HPLC)检测HbA1c进行比对和偏倚评估,并评估血红蛋白(Hb)变异体E(HbE)对TINIA和IE-HPLC的影响。方法参考美国临床与实验室标准化协会(CLSI)发布的方法学评价系列文件(EP文件)及有关文献,对TINIA检测HbA1c的精密度、正确度、分析测量范围、分析干扰以及生物参考区间进行评价和验证,对TINIA与IE-HPLC检测Hb结构正常的血液样本和含HbE的血液样本进行对比分析和偏倚评估,分析患者平均血糖的相关性。结果 TINIA检测HbA1c的批内精密度2.08%,总不精密度2.94%;在HbA1c浓度为4.4%~18.3%范围内,理论值与实测均值呈线性相关(r=0.999 4);Hb、游离胆红素(FBiL)、结合胆红素(CBiL)、乳糜(CH)浓度分别为9.9~49.6μmol/L、65.6~328.0μmol/L、65.6~328.0μmol/L和3 000~12 000 FTU时,差异百分比均5%;厂商提供的参考区间(4.8%~5.9%)适用于临床实验室。对于Hb结构正常的血液样本,TINIA和IEHPLC的HbA1c检测结果差异无统计学意义(P0.05),两种方法的相关性良好(r2=0.999 2)。对于HbE浓度在5.4%~54.7%范围内的血液样本,TINIA的平均偏倚为-4.1%~1.9%,均5%,几乎不受HbE的干扰,HbA1c检测结果与平均血糖的相关性较好(r=0.998 8);当HbE6.4%时IE-HPLC检测HbA1c的实测值与理论值平均偏倚为5.7%~278.7%,差异百分比均5%,测定结果与预期理论结果有明显差异;两种方法检测结果差异有统计学意义(P0.01)。结论 TINIA检测HbA1c的分析性能符合临床测定的性能要求,不受HbE的干扰。当HbE6.4%时,IE-HPLC法检测HbA1c会受干扰,出现假性增高的情况。     

免疫凝集法检测糖化血红蛋白的应用评价

目的了解免疫凝集法检测糖化血红蛋白试剂盒测定结果的准确性、可靠性,并对其进行方法学评价,为临床在分析不同方法检测糖化血红蛋白结果时提供参考。方法参照美国临床实验室标准化委员会的方法学评价方案,与美国BIO-RADVARIANTⅡ糖化血红蛋白分析仪检测HbA1c(%)的结果进行对比,同时监测放置时间对其结果的影响。结果免疫凝集法线性良好,稀释变异可接受,线性范围为0～5.2g/L,最低可检出限为0.074g/L。日间CV=4.33%,批内CV=3.02%,批间CV=3.39%,总CV=4.51%。血浆中高浓度胆红素、三酰甘油和尿素干扰HbA1c的检测。全血标本4℃条件下放置2周后结果稳定;溶血标本4℃条件下放置6个月结果稳定。结论免疫凝集法检测HbA1c的线性范围、稀释变异均符合临床检测要求,最低可检出限度为0.074g/L,不精密度小于5%。与美国BIO-RAD VARIANTⅡ糖化血红蛋白分析仪检测结果比较,差异无统计学意义。可采用在4℃保存的溶血标本作为室内质控品。     

两种糖化血红蛋白检测方法的比较

糖尿病的检测方法有很多，糖化血红蛋白作为糖尿病筛选、诊断、疗效考核的有效检测指标，已越来越多地在临床中使用。糖化血红蛋白目前主要的测定方法有3种：(1)离子交换高效液相色谱分析法；(2)硼酸亲和层析法；(3)免疫分析法。本文用免疫抑制比浊法与金标层析法分别检测血标本中的糖化血红蛋白含量，对结果进行统计分析，并对两种方法进行比较。     

糖化血红蛋白在糖尿病诊断中的临床意义

目的通过糖化血红蛋白（HbA1c）水平的检测,探讨其在糖尿病诊断中的意义。方法选取2009年在我院集体健康体检的志愿者2986例（除外已经诊断糖尿病者和其他影响HbA1c检测结果因素者）,全部检查HbAlc及空腹血糖,HbA1c≥6.5%的318例和空腹血糖（FPG）≥6.1 mmol/L的616例（其中FPG≥7.0 mmol/L者262例）,择日再行血糖水平检测或75%糖耐量试验（OGTT）,根据两次检测结果诊断或排除糖尿病。结果进一步检测HbAlc≥6.5%组诊断糖尿病276例,FPG≥6.1 mmol/L组诊断糖尿病311例（其中FPG≥7.0 mmol/L组216例）。以HbA1c≥6.5%为切点诊断糖尿病的敏感性为88.7%,特异性为98.4%;FPG≥7.0 mmol/L为切点诊断糖尿病的敏感性为69.5%,特异性为98.3%;以HbA1c≥6.5%为切点诊断糖尿病的漏诊率（11.3%）,明显低于以FPG≥7.0 mmol/L为切点诊断糖尿病的漏诊率（30.5%）。结论 HbA1c水平可以作为糖尿病诊断的参考指标之一,或提供进一步检查诊断糖尿病的依据。