小鼠胰岛细胞分离纯化及左肾包膜下移植

本试验采用小鼠逆胆总管胶原酶灌注法分离胰岛,移植到同种异体受体小鼠左肾包膜下,为此类研究建立动物模型。1材料和方法1.1实验动物成年Balb/c雌性小鼠,体重21~25g。1.2胰岛分离及纯化1.2.1胰腺灌注切取戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔内注射麻醉。胸腹联合切口,显露肝门,手术放大镜下     

小鼠胰岛分离纯化后肾被膜下胰岛移植动物模型的建立

目的：探讨一种分离纯化小鼠胰岛细胞的优良新型方法,经同种异体糖尿病小鼠肾被膜下胰岛移植建立动物模型.方法：（1）胰岛分离及检测：采用胆总管内胶原酶逆行灌注消化胰腺的方法分离胰岛,淋巴细胞分离液单一密度梯度离心法纯化胰岛.利用双硫腙对胰岛进行特异性染色来计算胰岛产量及纯度,台盼兰染色鉴定胰岛细胞的活性,以葡萄糖刺激胰岛素释放来检测胰岛功能.（2）胰岛移植：空白对照组（n =12）,糖尿病鼠组（n=12）,对糖尿病鼠组行同种异体鼠肾被膜下胰岛移植,观测血糖及生命体征变化.结果：每只小鼠可获得150～200个高质量胰岛,纯度及活性均高于90 ％,葡萄糖刺激后胰岛素释放量明显增加（SI=3）.糖尿病小鼠经胰岛移植后,1～3 d内,血糖均降至11.1 mmol/L以下.结论：采用新改进的分离纯化胰岛方法,可获得高质量、高功能的胰岛细胞.经同种异体糖尿病小鼠肾被膜下胰岛移植动物模型的成功建立,为进行人胰岛小鼠移植及人胰岛同种异体移植提供重要试验价值.     

同种异体胰岛细胞移植在糖尿病小鼠中的实验研究

目的 通过建立糖尿病小鼠模型,观察同种小鼠胰岛细胞移植前后血糖、胰岛功能的变化,探索胰岛细胞分离、纯化、移植的方法及有效性.方法 采用链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)复制糖尿病小鼠模型,经胆囊注入V型胶原酶水浴消化胰腺并进行密度梯度离心以分离纯化胰岛细胞,并在消化液和Ficoll分离液中加入了大豆胰酶抑制剂(STI)和牛血清白蛋白组份V(BSA),用双硫腙(DTZ)法判定胰岛纯度,锥虫蓝排斥试验评估胰岛存活率;糖尿病小鼠行同种异体胰岛细胞移植后,检测受体血糖、胰岛素及C肽变化,以判定胰岛功能.结果 糖尿病小鼠模型胰腺形态有明显病理变化,同种小鼠胰岛纯化后细胞形态完好,使分离纯化后的胰岛产量由原来方法的(40.7±13.2)个提高到了(263.5±32.I)个(P<0.01),活性在95%以上,胰岛移植后,实验组48 h后血糖明显下降,C肽水平上升.结论 采用加用STI、BSA小鼠胰岛细胞分离纯化方法可增加胰岛细胞产量,同种小鼠胰岛细胞移植能明显降低糖尿病小鼠血糖水平,改善胰岛功能,从而达到治疗目的 .     

多种分离纯化大鼠胰岛细胞的实验方法比较

目的：采用不同的分离或消化方法，探讨如何提高大鼠胰岛细胞分离纯化后的收获量和质量。方法：将25只供体SD雄性大鼠依胰腺分离或消化的方法不同随机地分为5组；（1）A组：胆总管灌注胶原酶P；（2）B组：胆总管灌注Hanks液；（3）C组：胆总管不灌注液体；A，B，C＜3组胰腺直接分次消化；（4）D组：胆总管不灌注，胰腺剪碎后分次消化；（5）对照组：胆总管灌注胶原酶P，胰腺直接单次消化，将分离的且经岛沉淀物用Ficoll-400纯化并培养，再把胰细胞移植于糖尿病裸鼠受体腹腔内。结果：纯化后的胰岛细胞在收获量上A和B组明显多于对照组或C组，而D组最低；A，B和D3组的纯度均高于对照组或C组；在胰岛成活率方面，A，B，C3组均高于对照组或D组，移植于糖尿病裸鼠受体内的大鼠胰岛细胞均可逆转高血糖状态。结论：经胆总管灌注胶原酶后的大鼠胰腺用分次消化的方法可提高胰岛细胞的收获,纯度和活性。     

不同体重供体及理化因素对小鼠胰岛分离的影响

目的：探讨提高小鼠胰岛数量和质量的可靠方法.方法：采用胆管内胶原酶灌注和Histopaque 1 077密度离心法分离纯化胰岛.分别观察供体的体重、胶原酶的浓度、消化的时间及温度对胰岛分离起的作用.在体外,ELISA检测葡萄糖刺激引起的小鼠胰岛素分泌.在体内,胰岛移植评价胰岛对糖尿病小鼠血糖的调节功能.结果：高体重供体组胰岛的收获量显著高于低体重供体组（P＜0.01）.胶原酶浓度、消化时间对胰岛收获量起重要作用.胰岛活率≥95%.体外胰岛素释放试验表明胰岛功能良好.同种异体胰岛移植的糖尿病小鼠高血糖状态得到逆转.结论：小鼠的体重、胶原酶的浓度、消化时间和温度是影响胰岛数量和功能的重要因素.     

多种分离纯化大鼠胰岛细胞的实验方法比较

【目的】采用不同的分离或消化方法 ,探讨如何提高大鼠胰岛细胞分离纯化后的收获量和质量。【方法】将 2 5只供体SD雄性大鼠依胰腺分离或消化的方法不同随机地分为 5组 :①A组 :胆总管灌注胶原酶P ;②B组 :胆总管灌注Hanks液 ;③C组 :胆总管不灌注液体 ;A、B、C 3组胰腺直接分次消化 ;④D组 :胆总管不灌注 ,胰腺剪碎后分次消化 ;⑤对照组 :胆总管灌注胶原酶P ,胰腺直接单次消化。将分离的胰岛沉淀物用Ficoll 4 0 0纯化并培养 ,再把胰岛细胞移植于糖尿病裸鼠受体腹腔内。【结果】纯化后的胰岛细胞在收获量上A和B组明显多于对照组或C组 ,而D组最低 ;A、B和D 3组的纯度均高于对照组或C组 ;在胰岛成活率方面 ,A、B、C 3组均高于对照组或D组。移植于糖尿病裸鼠受体内的大鼠胰岛细胞均可逆转高血糖状态。【结论】经胆总管灌注胶原酶后的大鼠胰腺用分次消化的方法可提高胰岛细胞的收获量、纯度和活性。     

大鼠胰岛分离与纯化的实验研究

本实验经胰管注射胶原酶、胰腺静止消化方法。分离成年Wistar大鼠胰岛,葡聚糖密度梯度离心纯化。大鼠胰腺消化后,胰岛收获量为710～1015个/胰腺,纯化后胰岛收获量为610—820个/胰腺,纯度达92%。纯化胰岛形态结构完整,内分泌细胞超微结构保持良好;对葡萄糖刺激反应,胰岛素释放量是基础分泌水平的8倍;异体移植可逆转实验性糖尿病小鼠的高血糖达一周。     

应用淋巴细胞分离液纯化大鼠胰岛的实验研究

目的：建立一种简便、易行和高效的胰岛分离纯化方法，以减少对胰岛细胞的损伤，获得高质量的胰岛组织。方法：选用SD大鼠经胆总管原位灌注胶原酶液，分离消化胰腺组织，用淋巴细胞分离液(histopaque-1077)纯化胰岛细胞。结果：可收获大量的高纯度胰岛，纯度达95％以上，体外葡萄糖刺激实验表明胰岛对刺激反应良好，将胰岛移植于糖尿病小鼠体内可短期纠正其高血糖状态。结论：应用单一密度淋巴细胞分离液纯化大鼠胰岛的方法是一种操作简单、价格低廉、重复性好的大鼠胰岛纯化方法。     

不同消化条件对小鼠胰岛分离纯化效果的影响

目的探讨提高小鼠胰岛分离纯化后数量和质量的适宜消化条件。方法通过胆总管逆行灌注胶原酶P溶液进行小鼠胰腺消化,分离胰岛,采用不连续密度梯度Ficoll离心法纯化胰岛,观察胶原酶浓度和消化时间对胰岛分离结果的影响。结果胶原酶浓度和消化时间对小鼠胰岛分离效果有重要影响。在胶原酶P浓度为1.0 mg/ml、37℃消化25 min条件下,胰岛分离效果最佳。结论胶原酶浓度和消化时间影响小鼠胰岛分离结果,优化消化条件可提高胰岛分离数量和质量。     

糖尿病小鼠左肾被膜下胰岛细胞与胰腺外分泌细胞共同移植动物模型的建立

目的：建立糖尿病小鼠左肾被膜下同种异体胰岛细胞与胰腺外分泌细胞共同移植动物模型及探讨胰腺外分泌细胞对胰岛移植物的损伤作用.方法：（1）体内实验：采用胆总管内逆行灌注胶原酶联合淋巴细胞分离液的方法来分离纯化胰岛,人工挑取胰岛细胞并收集胰腺外分泌细胞.链脲佐菌素腹腔注射诱导BALB/C小鼠成为糖尿病小鼠.单纯移植组（n=10）每只小鼠于左肾被膜上极移植胰岛细胞250个,共同移植组（n =10）每只小鼠于左肾被膜上下极同时移植胰岛细胞250个和等体积的胰腺外分泌细胞,持续观测血糖及生命体征变化,1个月后切除左肾并继续检测血糖.（2）体外实验：利用双硫腙对胰岛进行特异性染色来计算胰岛产量及纯度,利用台盼蓝染色鉴定胰岛细胞的活性,以及用葡萄糖刺激胰岛素释放实验来检测胰岛功能.结果：（1）胰岛移植后,单纯移植组及共同移植组血糖均逐步降至正常,共同移植组较单纯移植组血糖恢复正常时间延迟,移植术后第2,3,4,5天,单纯移植组受鼠血糖低于共同移植组,差异有统计学意义（P＜0.05）.切除两组受鼠左肾3d后,两组受鼠血糖均＞21 mmol/L.（2）每只小鼠可获得150～200个高质量胰岛,纯度及活性均高于90％,葡萄糖刺激后胰岛素释放量明显增加（SI=2.90）.结论：（1）成功建立糖尿病小鼠左肾被膜下同种异体胰岛细胞与胰腺外分泌细胞共同移植动物模型.（2）胰腺外分泌细胞与胰岛细胞同时移植会延迟植入胰岛功能恢复正常的时间.     

胃浆膜下层与门静脉胰岛移植治疗糖尿病大鼠的实验研究

目的 通过比较胃浆膜下层与门静脉胰岛移植治疗糖尿病大鼠的功效,探讨胰岛移植的最适宜部 位。方法 链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠,将其分为胃浆膜组、门静脉组、对照组,每组6 只;经胆总管灌注 胶原酶Ⅺ消化胰腺组织,分离、纯化胰岛,采用双硫腙（DTZ）特性染色并计数胰岛当量（IEQ）及纯度,台 盼蓝染色判断胰岛活性;同期分别将500 IEQ 大鼠胰岛移植入胃浆膜下层和门静脉,对照组输注等量RPMI 1640 液体,移植后分别检测大鼠的血糖浓度,腹腔葡萄糖耐量实验,评判胰岛功能。结果 每只大鼠可获取 胰岛（310±42）个,DTZ 染色显示胰岛纯度为（89.00±4.52）% ;台盼蓝染色显示胰岛活性良好[（89.08± 3.76）%] ;胰岛移植后胃浆膜组、门静脉组大鼠血糖较之前下降（P <0.05）,与对照组血糖浓度比较,差异有 统计学意义（P <0.05）;胃浆膜组与门静脉组胰岛移植后大鼠血糖浓度比较,差异有统计学意义（P <0.05）; 胃浆膜组与门静脉组大鼠有效控制血糖时间分别为（18.0±1.9）和（11.6±2.5）d,差异有统计学意义（P <0.05）。 胃浆膜组与门静脉组大鼠腹腔葡萄糖耐量实验提示糖耐受功能良好。结论 短期内,胃浆膜下层胰岛移植治 疗糖尿病大鼠的疗效优于门静脉移植;与门静脉相比,胃浆膜下层胰岛移植操作简单,安全性高,是胰岛移植 的最适宜部位之一。     

一种简易高效的建立小鼠胰岛移植模型的方法

目的 探索一种简便高效的建立小鼠胰岛移植模型的方法。方法 摘取四只BALB/c小鼠的胰腺,0.25mmPenfine针对胰腺反复多点注射胶原酶P后静止消化20min;采用自制的推进式离心管,以单一密度梯度Ficoll液(1.088g/ml)纯化胰腺消化物,双硫腙对胰岛进行特异性染色,利用胰岛素释放试验检测胰岛细胞的功能;纯化后的胰岛移植到实验性糖尿病C57小鼠的肾包囊下,术后观察其血糖变化。结果 纯化后共得到（789.6±26.4）个胰岛细胞当量（IEQ）,平均纯度为（77.12±3.23）％;胰岛细胞对胰岛素释放刺激反应良好,高糖时胰岛素的释放量为低糖时的2.35倍（P<0.01）。移植后可逆转糖尿病小鼠的高血糖平均达（16.3±2.9d）。结论 提供了快速获取小鼠胰岛细胞的方法,为胰岛移植的实验研究建立了一种简易高效的制作动物模型的方法。     

小鼠胰岛密度梯度离心方法的研究

目的探索最优的密度梯度离心方案,提高胰岛的纯度和得率,为胰岛移植相关研究奠定基础。方法采用雄性Balb／c小鼠作为供体分离胰岛,以0.5mg／ml胶原酶Xl灌注和消化胰腺,通过不同的密度梯度离心策略分离纯化胰岛,进行双硫腙（DTZ）特异染色法染色,显微镜下观察胰岛的纯度和得率,并通过吖啶橙（AO）／碘化丙啶（PI）染色检查分离获得的胰岛活性,最终确定最佳的密度梯度离心方法。结果Balb／c小鼠在Ficoll一1．108（4m1）、1．096（2m1）、1．069（2m1）、HBSS（2m1）,加速度1、减速度1、400r／min、4min中转1800r／min、8min离心后胰岛得率为（125±39）IEQ、纯度为（79．6±105）％,经相同条件二次梯度后得率无明显降低但纯度明显提高．达（96．2±14）％。经AO／PI染色鉴定分离胰岛活性良好。结论本研究所采用的小鼠胰岛密度梯度离心方法很有效,能稳定地获得纯度较高且数量可观的胰岛。     

腺病毒介导外源基因转染大鼠胰岛移植物的实验研究

目的探讨携带外源基因的腺病毒在体外有效感染大鼠胰岛及外源基因在胰岛中的表达。方法用携带人血红素氧合酶-1基因(hHO-1)及绿色荧光蛋白基因(GFP)的腺病毒在体外以不同MOI感染大鼠胰岛,荧光显微镜观察GFP的表达及Western检测hHO-1蛋白来确定转染结果,并观察外源基因表达持续的时间。结果腺病毒载体在体外能将外源基因有效转入到大鼠胰岛细胞,转染的基因能稳定表达。结论腺病毒载体在体外可以有效感染大鼠胰岛,为基因修饰胰岛移植物以提高胰岛移植效果奠定了实验基础。     

单核细胞趋化蛋白-1在非肥胖糖尿病小鼠胰腺中的表达

目的 通过观察单核细胞趋化蛋白-1（Monocyte Chemoattractant Protein-1）在1型糖尿病动物模型NOD小鼠胰腺中的表达，探讨其在1型糖尿病胰岛炎发病机制中的作用。方法 应用免疫组化SABC法和免疫电镜评价MCP-1在NOD小鼠和BALB／C小鼠胰腺中的表达，应用H＆E染色光镜下评价胰岛免疫细胞浸润。结果 免疫组化结果表明：NOD小鼠胰腺中MCP-1呈阳性表达，而对照组无MCP-1表达。免疫电镜进一步显示：MCP-1由胰岛β细胞产生并存在于细胞质中。结论 MCP-1主要由胰岛β细胞产生。MCP-1通过招募单核／巨噬细胞浸润胰岛而在1型糖尿病发病机制中起重要作用。     

Influence of microenvironment on engraftment of transplanted β-cells

Pancreatic islet transplantation into the liver provides a possibility to treat selected patients with brittle type 1 diabetes mellitus. However, massive early β-cell death increases the number of islets needed to restore glucose homeostasis. Moreover, late dysfunction and death contribute to the poor long-term results of islet transplantation on insulin independence. Studies in recent years have identified early and late challenges for transplanted pancreatic islets, including an instant blood-mediated inflammatory reaction when exposing human islets to the blood microenvironment in the portal vein and the low oxygenated milieu of islets transplanted into the liver. Poor revascularization of remaining intact islets combined with severe changes in the gene expression of islets transplanted into the liver contributes to late dysfunction. Strategies to overcome these hurdles have been developed, and some of these interventions are now even tested in clinical trials providing a hope to improve results in clinical islet transplantation. In parallel, experimental and clinical studies have, based on the identified problems with the liver site, evaluated the possibility of change of implantation organ in order to improve the results. Site-specific differences clearly exist in the engraftment of transplanted islets, and a more thorough characterization of alternative locations is needed. New strategies with modifications of islet microenvironment with cells and growth factors adhered to the islet surface or in a surrounding matrix could be designed to intervene with site-specific hurdles and provide possibilities to improve future results of islet transplantation.     

NOD 小鼠胰岛的分离及其在体内外的生物学特性

目的 建立分离纯化非肥胖性糖尿病(NOD)小鼠胰岛的方法,并对其体内外生物学特性进行研究?方法 采用改良的胶原酶消化结合Ficoll 密度梯度离心方法,分离纯化NOD 小鼠胰岛?应用体外糖刺激实验检测分离纯化的胰岛功能,以及通过监测移植小鼠的血糖?体重变化及糖耐量实验对移植胰岛的体内生物学功能进行分析,并通过HE 染色和免疫荧光染色检测肾被膜下移植胰岛的存活情况?结果 胰岛产率为(116 ±12)个胰岛/胰腺,纯度>90%?体外糖刺激实验结果显示,NOD 小鼠胰岛的糖刺激胰岛素释放水平明显低于KM 小鼠胰岛?胰岛移植实验显示,移植胰岛能有效改善糖尿病小鼠的血糖?体重和糖耐量,但改善作用一般仅能维持2 周左右?HE 染色和免疫荧光染色结果显示,肾被膜下可见胰岛素阳性的胰岛细胞团,并且在残存的移植胰岛细胞团周围存在大量淋巴细胞浸润?结论 通过改良的小鼠胰岛分离方法可由NOD 小鼠分离得到大量较高纯度的胰岛,可用于今后探索如何阻断自身免疫损伤保护移植胰岛的研究?     

The blood drainage of Langerhans islets with special reference to the functional and clinical significance of pancreatic exocrine part]

OBJECTIVE: This study sought to gain an insight into the blood drainage of Langerhans islets with special reference to the functional and clinical significance of pancreatic exocrine part. METHODS: Observations were carried out in 11 human dead bodies, 40 monkeys, 24 dogs, 62 rats and 24 rabbits by scanning electron microscopy and light microscopy with the technique of retaining microcirculatory dynamic and tissular information in the static specimens, microvascular serial reconstruction, and/or by intravital fluorecence microscopy with FITC-labeled erythrocytes. RESULTS: Three patterns of islet drainage channels drained into different acinar regions with different features and insulo-insular drainage channels observed in the primates were found in this study. The authors suggest that these patterns might be termed as follows: 1. Continuous drainage vessels. All islets possessed these capillary-sized portal vessels which ran a short distance, and then drained into the peri-islet acinar region. 2. Convergent drainage vessels. Some islets possessed one or two, occasionally more, of these portal vessels, which were relatively long and/or thick and drained into the acinar region far away from the islet in the lobule. 3. Translobular drainage vessels. These portal vessels crossed the interlobular septum into an adjacent lobule where sometimes no islet existed, and then drained into the exocrine acinar region 4. Insulo-insular drainage vessels. Some islets in the monkey and human, possessed these vessels which drained into an adjacent small islet through the insulo-insular drainage vessels. CONCLUSION: Langerhans islets possessed the consummate drainage system which drained into different exocrine acinar regions, suggesting that the release of islet hormones is in some way necessary for the exocrine secreting function, and that the reduction of local insular hormone levels in insuloacinar portal circulation and the impairment of insular drainage vessels would be the morphological basis of the pancreatic exocrine pathologic lesion in human diabetes.     

Clinical islet transplantation in type 1 diabetes mellitus: results of Australia's first trial

OBJECTIVE: To determine whether pancreatic islet transplantation can control diabetes and prevent severe life-threatening hypoglycaemia. DESIGN, SETTING AND PARTICIPANTS: A single-arm observation study of six patients undergoing islet transplantation. All patients had had type 1 diabetes mellitus for over 5 years and documented episodes of repeated severe hypoglycaemia. Islets were isolated from donor pancreases digested by Liberase. Separated islets were infused into the recipient's liver via the portal vein. Patients were immunosuppressed with daclizumab, sirolimus and tacrolimus. The transplants were performed at Westmead Hospital, NSW, between October 2002 and February 2005. MAIN OUTCOME MEASURES: Normal blood glucose control without administration of exogenous insulin; demonstration of islet function and abolition of hypoglycaemia. RESULTS: Five of the patients received two islet infusions, and the sixth was withdrawn after one infusion following a portal vein thrombosis. Three patients became insulin-independent, with excellent glycaemic control. Two had islet function with circulating C-peptide, improved glycaemic control, reduced insulin requirement and abolition of severe hypoglycaemia. However, over a 2-year period, graft function deteriorated. Recipients who were initially insulin free remained C-peptide positive but required supplemental insulin. Complications included one postoperative bleed, two portal vein thromboses (which resolved completely), presumed recurrence of tuberculosis in one patient, and deterioration in renal function in one patient. CONCLUSIONS: Islet transplantation is effective at improving glycaemic control and hypoglycaemia unawareness in the short to medium term. However, problems with long-term safety of immunosuppression, islet-induced thrombosis and early detection of loss of islet function remain to be addressed.     

大鼠胰岛的分离和胰岛移植

目的研究大鼠胰岛分离和移植的方法.方法采用胶原酶消化及不纯化的胰岛分离方法.用双硫腙(DTZ)法判定胰岛纯度,台盼蓝排斥试验评估胰岛存活率;SD大鼠胰岛制备物行同种异体胰岛移植后,动态检测受体血糖、胰岛素及C肽变化,并作移植部位形态学观察,以判定其功能.结果2次消化组胰岛收获量和纯度较单次消化组高,与不加甘油单次消化组相比有显著性差异(P＜0.05);胰岛活率2次消化组显著高于单次消化组(P＜0.05).在有效的免疫抑制方案下胰岛移植物能长期存活,有良好的胰岛素和C肽分泌功能,可维持正常的血糖;移植后2个月在汇管区可见较多形态完整的胰岛细胞.结论胶原酶2次消化和不纯化的分离方法,可获得较高质量和数量的胰岛移植物,且重复性好.