高相对分子质量α-晶体蛋白分子伴侣活性在年龄相关性白内障中的变化

目的研究年龄相关性白内障高相对分子质量α晶体蛋白(αH晶体蛋白)的分子伴侣功能。方法101只白内障晶状体取自年龄相关性白内障(ARC)患者眼,26只透明晶状体取自意外死亡的健康青壮年角膜移植供体眼,使用SephacrylS300HR分离透明和混浊晶状体皮质和核αH晶体蛋白。采用αH晶体蛋白抑制过氧化氢酶(CAT)、βL晶体蛋白的热凝聚,以及糖基化和加热诱导CAT的失活作为分子伴侣的观察指标。结果年龄相关性白内障晶状体含大量αH晶体蛋白,αH晶体蛋白的作用较αL晶体蛋白弱,对CAT和βL晶体蛋白热凝聚的抑制作用相似。透明晶状体与ARC、65岁以上组与65岁以下组、Ⅱ级与Ⅳ级核之间αH晶体蛋白分子伴侣功能差异具显著性。αH晶体蛋白可保护果糖和加热诱导CAT的失活。结论人αH晶体蛋白具有分子伴侣活性。但活性较αL晶体蛋白低。晶状体在老化过程中受翻译后修饰(PTM)的严重影响,形成大量αH晶体蛋白聚合物,导致分子伴侣功能下降,可能是白内障发病的关键因素之一。     

年龄相关性白内障α-晶状体蛋白的分子伴侣功能

目的:研究年龄相关性白内障α-晶状体蛋白的分子伴侣功能。方法:使用SephacrylS-300HR分离健康人透明的和年龄相关性白内障混浊的晶状体皮质和核的αL-晶状体蛋白。采用分光光度计测定αL-晶状体蛋白对过氧化氢酶(catalase,CAT)热凝聚的抑制作用。应用SDS-PAGE分析CAT与αL-晶状体蛋白在热凝聚实验中形成的复合物。结果:人αL-晶状体蛋白可特异性地抑制CAT热凝聚。透明晶状体皮质较核的抑制作用明显;白内障αL-晶状体蛋白的抑制作用明显下降,65岁以下与65岁以上、65岁以上白内障Ⅱ与Ⅳ级核之间αL-晶状体蛋白的抑制作用比较,差异均有显著性;65岁以下Ⅱ与Ⅳ级核之间比较,差异无显著性,但Ⅳ级核的抑制作用降低。SDS-PAGE显示热凝聚实验透明晶状体皮质αL-晶状体蛋白的20kDa带在加热后0、40min和2h可溶部分无显著减少,62kDa的CAT带含量逐渐减少。结论:人α-晶状体蛋白具有抑制CAT热凝聚的分子伴侣功能,白内障晶状体核的α-晶体蛋白具有年龄和混浊程度依赖性伴侣功能的降低,这在白内障形成过程中起重要作用。     

紫外线辐射对α-晶状体蛋白分子伴侣活性的作用

目的 研究在老化和白内障形成过程中紫外线（UV）辐射对α-晶状体蛋白分子伴侣活性的作用。方法 新生Sprague-Dawley大鼠皮下注射亚硒酸钠诱导硒性白内障（SC），采用SephacrylS-300HR分离幼年和老年兔晶状体皮质和核以及SC大鼠α-晶状体蛋白。以α-晶状体蛋白对过氧化氢酶热凝聚的抑制作为分子伴侣活性指标，观察UV-B（300nm)辐射α-晶状体蛋白蛋白后，其伴侣活性的变化。结果 UV辐射新生和老年兔晶状体核αL-晶状体蛋白后30h，与辐射前比较伴侣活性降低约18%和14%，而皮质的变化不显著；至100h时，老年兔皮质，核和新生兔核αL-晶状体蛋白比αL-晶状体蛋白敏感，UV辐射可进一步降低硒性白内障α-晶状体蛋白的分子伴侣活性。     

离体氨甲酰化诱导α-晶体蛋白分子伴侣活性的丧失

目的:研究氨甲酰化作为晶状体蛋白质重要的翻译后修饰,对α-晶体蛋白分子伴侣活性的作用。方法:分离牛晶状体αL和βL-晶状体蛋白。αL-晶状体蛋白分别与不同浓度的[14C]氰酸钾温育1至7 d,采用三氯醋酸沉淀法测定αL-晶状体蛋白与[14C]氰酸基团的结合率。αL-晶状体蛋白分别与50和100 mmol.L-1氰酸钾37℃温育3至7 d,测定αL-晶体蛋白抑制βL-晶状体蛋白热凝聚的分子伴侣活性,高效液相色谱法(HPLC)分析αL-晶状体蛋白的氨甲酰化作用。结果:αL-晶状体蛋白与[14C]氰酸基团的结合率和离体氨甲酰化诱导的α-晶状体蛋白伴侣活性的降低呈剂量和时间依赖性。伴侣活性的降低与较高氰酸基团的结合相一致。与对照相比,100mmol.L-1氰酸钾温育7 d导致αL-晶体蛋白伴侣活性几乎殆尽。.HPLC结果提示与氰酸钾温育3 d后可发生剂量依赖性αL-晶体蛋白的凝聚。结论:离体氨甲酰化通过高分子量凝聚物的形成修饰α-晶体蛋白,氨甲酰化诱导α-晶体蛋白的凝聚可能导致其伴侣活性的丧失。     

硒性白内障α—晶体蛋白的分子伴侣特性

目的：研究硒性白内障α－晶体蛋白的分子伴侣特性。方法：制作SD大鼠亚硒酸钠性白内障模型,分离纯化正常和白内障晶状体α－晶体蛋白。观察α－晶体蛋白对过氧化氢酶（CAT）热凝聚的抑制作用。结果：正常和硒性白内障幼鼠晶状体α－晶体蛋白与对照蛋白比较,具有特异性抑制CAT热凝聚的作用;αH较αL－晶体蛋白伴侣功能降低;硒性白内障α－晶体蛋白的掏作用下降,正常和白内障晶状体αH和αL－晶体蛋白伴侣功能两者之间分别比较均有显著性差异。结论：硒性白内障α－晶体蛋白抑制AT热凝聚的分子伴侣活性下降是导致白内障形成的重要环节。     

糖基化对α-晶状体蛋白的修饰和分子伴侣活性的降低

目的　研究糖基化对 α-晶状体蛋白分子伴侣活性的作用。方法　分离牛晶状体α-晶状体蛋白 ,分别与 0 .5 mol· L- 1 果糖和 0 .5 m ol· L- 1 葡萄糖在 37℃温育 ,在第 0、2 4、32天测定 380 nm的光吸收值和 40 0 nm非色氨酸荧光值 ,高压液相色谱 ( high performanceliquid chrom atography,HPL C)和 SDS- PAGE评价蛋白质交联程度 ,采用过氧化氢酶( catalase,CAT)和βL-晶状体蛋白的热凝聚光散射值 ,作为α-晶状体蛋白的分子伴侣活性指标。结果　果糖和葡萄糖可导致时间依赖性 α-晶状体蛋白在 380 nm吸收值的增加 ,非色氨酸荧光值升高 ;HPL C和 SDS- PAGE提示糖与α-晶状体蛋白形成交联复合物。果糖较葡萄糖作用明显。糖基化导致 α-晶状体蛋白抑制 CAT和 βL-晶状体蛋白热凝聚作用降低 ,孵育第 2 4天 ,葡萄糖组α-晶状体蛋白分子伴侣活性分别降低约 12 %和 19% ,果糖组约7%和 9% .结论　糖基化导致 α-晶状体蛋白形成高分子聚合物、凝聚、交联 ,分子伴侣活性丧失 ,这在老化和糖尿病性白内障形成过程中起重要作用。     

肌肽对激素诱导晶状体α-晶状体蛋白修饰的作用

目的：研究肌肽对糖皮质激素诱导的α-晶状体蛋白修饰和分子伴侣功能降低的保护作用，以及肌肽与糖皮质激素的直接反应。 方法：采用SephacryIS-300HR凝胶柱分离牛αL-晶状体蛋白。αL-晶状体蛋白分别与不同浓度的泼尼松龙-21-半琥珀酸（P-21-H）及肌肽孵育不同时间。以α1-晶状体蛋白对热凝聚的抑制作为分子伴侣活性指标。采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和荧光光度仪来监测被修饰的αL-晶状体蛋白，并观察肌肽和泼尼松龙-21-半琥珀酸作用后的光谱变化。 结果：泼尼松龙-21-半琥珀酸可导致浓度和时间依赖性αL-晶状体蛋白分子伴侣活性的降低，但是肌肽加剧了这种效应。被泼尼松龙-21-半琥珀酸修饰后的较未被修饰的αL-晶状体蛋白色氨酸荧光强度显著降低，但是其非色氨酸荧光强度向较长波长移位，并呈现时间一剂量依赖的增强，提示有新的荧光色素物的形成。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示肌肽能与泼尼松龙-21-半琥珀酸迅速反应，从而抑制激素诱导的蛋白质修饰。时间依赖性的光吸收强度增加提示肌肽与泼尼松龙-21-半琥珀酸反应可能形成了新的加合物。 结论：肌肽能够与泼尼松龙-21-半琥珀酸直接反应，肌肽具有潜在的抗糖皮质激素作用。     

蛋白质组学在白内障研究中的应用

后基因组时代，蛋白质组学作为功能基因组学研究的核心技术之一，已成为生物医学领域强大的技术支撑，并为白内障疾病的研究提供了一个新的平台。白内障和老化被认为是一类构象性疾病。晶状体透明性与具有分子伴侣活性的α-晶体蛋白密切相关。白内障发生时，多种疾病特征性的蛋白质组改变，可导致α-晶体蛋白分子内或分子间的交联，分子伴侣活性下降，加速白内障的形成。就蛋白质组学在白内障发病机制研究中的应用进行综述。     

老化过程中人晶状体蛋白质的改变

用凝胶过滤和SDS-PAGE对不同年龄人透明晶状体水溶性蛋白、尿素溶蛋白及纤维细胞膜内在蛋白进行了分析。随着年龄的增长,HM+α-晶体蛋白的相对含量增加,而β-、γ-晶体蛋白降低。四岁儿童晶状体含有较多的β_1-晶体蛋白,成人晶状体则含量明显降低。成人晶状体尿素溶蛋白的主要成分为α-晶体蛋白,而四岁儿童晶状体尿素溶蛋白中α-晶体蛋白及23kDa的β-晶体蛋白成分含量均较高并含有较多的细胞骨架蛋白。细胞膜主要内在蛋白(MIP)的相对含量随年龄的增长而下降,而MP23升高。     

ATP对α-晶状体蛋白分子伴侣功能及构象的影响

目的 探讨α-晶状体蛋白分子伴侣功能的作用机制.方法将柠檬酸合酶(CS)、盐酸胍和不同浓度的α-晶状体蛋白及3 mmol/L的ATP温育,分光光度计测定CS的活性.α-晶状体蛋白与ATP温育后用荧光分光光度计检测其荧光发射光谱. 结果α-晶状体蛋白不能使变性的CS复性,但能抑制盐酸胍诱导的CS凝聚,保护CS的失活且呈浓度依赖性.ATP可使这些作用增强.ATP浓度增高可导致α-晶状体蛋白色氨酸荧光强度降低. 结论 ATP可增强α-晶状体蛋白的分子伴侣功能且能改变α-晶状体蛋白的分子构象.     

α-晶体蛋白分子伴侣活性在白内障发病中作用的研究进展

α－晶体蛋白是晶状体中重要的成份蛋白质，是由αＡ和αＢ亚基组成的四聚体蛋白。长期被认为其功能主要是维持晶体的结构和屈光性，自１９９２年Ｈｏｒｗｉｔｚ证实α－晶体蛋白具有分子伴侣（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｐｅｒｏｎｅ）作用之后，大量的研究表明α－晶体蛋白能够抑制其它晶状体蛋白和酶的化学性修饰和热凝聚而保护其活性，对长期维持晶体状体的透明性具有重要作用。αＡ亚基Ｃ－端序列和αＢ亚基Ｃ－端的伸展的变化     

翻译后修饰对α—晶体蛋白分子伴侣活性的影响及白内障形成机制

翻译后修饰（post translational modification,PTM）是蛋白质翻译后通过酶的催化或酶控制下的反应而发生修饰，包括糖基化、氨甲酰化、氧化、磷酸化、乙酰化、脱酰胺和切除作用等。白内障和老化被认为是一类结构性疾病（conformational disease）。PTM可造成蛋白质结构改变。α－晶体蛋白作为晶状体主要的结构蛋白质，具有分子伴侣（molecular chaperone）活性，可抑制蛋白质的凝聚和酶的失活。PTM可诱导α－晶体蛋白分子内部或分子之间的交联，导致其分子伴侣活性降低，加速白内障形成。赖氨酸基因PTM最敏感，封闭赖氨酸的ε－氨基基团，可阻止和延迟蛋白质交联。寻找抑制或阻断PTM的因子，有助于药物治疗此类疾病方法的突破。     

糖皮质激素对α-晶状体蛋白分子伴侣功能的影响

目的　研究糖皮质激素对α 晶状体蛋白分子伴侣功能的影响。 方法　凝胶过滤层析分离αL和βL 晶状体蛋白,αL 晶状体蛋白与 25mmol/L泼尼松龙 21 半琥珀酸(P 21 H)孵育 20d(37℃),分别于 0、2、4、10和 20d应用βL 晶状体蛋白热聚集法测定分子伴侣活性,采用PerkinElmerLB50B荧光光度仪观察色氨酸和非色氨酸荧光值,SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳监测蛋白质交联程度。 结果　被P 21 H修饰后的αL 晶状体蛋白分子伴侣功能显著降低。P 21 H可导致αL 晶状体蛋白色氨酸荧光强度明显降低,非色氨酸荧光强度向较长波长移位和增强,提示形成新的荧光色素物。孵育第 10d,伴侣活性已降低至约 3 3%,色氨酸荧光强度殆尽,约在激发波长 412nm出现新的非色氨酸荧光强度。SDS PAGE显示糖皮质激素导致αL 晶状体蛋白明显凝聚。 结论　糖皮质激素对α 晶状体蛋白的修饰和伴侣活性的降低可能参与糖皮质激素诱导白内障的形成。     

紫外线-B激光照射对α晶状体蛋白的影响及3-吲哚甲醇对其分子伴侣活性的保护作用

背景 紫外线照射是年龄相关性白内障形成的诱因之一.研究表明,3-吲哚甲醇(I3C)可抑制氧化作用导致的细胞损害及淀粉样纤维变性的形成,氧化损伤及淀粉样纤维变性的形成均与白内障有关,而I3C与α晶状体蛋白活性的关系尚有待证实. 目的 评估紫外线-B激光照射对α晶状体蛋白结构和分子伴侣功能的影响,探讨I3C对α晶状体蛋白分子伴侣功能的保护作用.方法 取新鲜1岁龄牛眼球的晶状体,采用凝胶层析法提纯牛的α晶状体蛋白,并按照快速蛋白液相色谱( FPLC)吸收谱线收集α晶状体蛋白.然后分别以23.75、118.75、475.00、1187.50、2375.00、4750.00、11 875.00和23 750.00mJ/cm2的紫外线-B激光照射在凸透镜后一固定位置的α晶状体蛋白,然后通过改变α晶状体蛋白在凸透镜后的位置达到改变照射能量的目的,使各组照射能量分别为28 535.00、6730.00、3435.00、1910.00、1040.00 mJ/cm2.使用紫外分光光度仪测量紫外线-B激光照射前后α晶状体蛋白的紫外吸收谱线(色氨酸荧光谱).在照射能量为475.00、1187.50、2375.00、4750.00、11 875.00mJ/cm2照射后的α晶状体蛋白溶液中分别加入50μmol/L和100 μmol/L的I3C,并进行过氧化氢酶(CAT)热凝聚实验,判断α晶状体蛋白分子伴侣活性,未加入50 μmol/L和100 μmol/L I3C的α晶状体蛋白溶液进行相同的实验作为对照,采用分光光度仪测量360 nm波长处各组α晶状体蛋白抑制CAT热凝聚的吸光度(A360)值,计算各干预组与对照组A值的百分数作为评价分子伴侣活性的指标. 结果 α晶状体蛋白紫外吸收谱测定发现,紫外线-B激光照射能量为1187.50 mJ/cm2时,α晶状体蛋白A280值降到10％左右,当照射能量达到23.75 J/cm2时,α晶状体蛋白A280值降到2％以下,二者呈负相关(R2=0.925).色氨酸荧光光谱测定表明,紫外线-B激光照射强度与色氨酸荧光强度呈负相关(R2=0.996),而与色氨酸代谢产物N-甲酰犬尿氨酸(N-FK)的荧光强度呈正相关(R2=0.949).CAT热凝聚实验表明,加入50 μmol/L和100μmol/L的I3C后,各强度的激光照射组α晶状体蛋白的相对A360值均明显高于对照组,差异有统计学意义(P=0.000)；α晶状体蛋白分子伴侣功能下降幅度低于对照组,差异有统计学意义(P=0.000).分子伴侣活性随着激光照射能量的增加与不加入I3C的α晶状体蛋白相比降低变慢.结论 紫外线-B激光照射可以造成α晶状体蛋白分子结构的变化及分子伴侣活性的降低,I3C对于α晶状体蛋白分子伴侣活性具有保护作用.     

α-晶状体蛋白分子伴娘功能的初步研究

α-晶状体蛋白作为晶状体的主要结构蛋白，具有分子伴娘特性，对长期维持晶状体的透明具有重要意义。为探讨其作用机制，我们对比观察了透明晶状体皮质和核、年龄相关性白内障不同年龄患者晶状体和不同混浊程度晶状体中α--晶状体蛋白对过氧化氢酶热凝聚的抑制作用。     

兔α-晶状体蛋白的分子伴娘功能的研究

目的 了解兔α-品状体蛋白是否具有分子伴娘功能。方法凝胶过滤法分离水溶性晶状体蛋白。在550C高温条件下,观察α-晶状体蛋白是否能抑制β-low晶状体蛋白的凝集和变性;观察α-晶状体蛋白是否能抑制糖基化诱导的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)的失活,均以牛血清白蛋白(BSA)作为对照。结果 α-晶状体蛋白能抑制热诱导的p—low晶状体蛋白的凝集和变性;α-晶状体蛋白亦能抑制糖基化诱导的G6PD的失活;而牛血清白蛋白却无此作用。结论 α-晶状体蛋白具有分子伴娘功能。     

α-晶状体蛋白对维持晶状体透明性的功能研究进展

α-晶状体蛋白是眼晶状体细胞质的主要成分,由小热休克蛋白家族中的αA-晶状体蛋白和αB-晶状体蛋白组成.α-晶状体蛋白具有分子伴侣活性,还有调控细胞周期、增强基因组稳定性、防止压力诱导性细胞凋亡的作用.α-晶状体蛋白相关基因突变常引起遗传性白内障,是目前儿童盲的主要原因,而α-晶状体蛋白的多种改变可导致年龄相关性白内障.了解α-晶状体蛋白的功能有助于理解晶状体的发育及其正常功能的维持,为预防及治疗α-晶状体蛋白相关性白内障提供理论依据.就白内障发生机制、遗传定位及晶状体蛋白的功能进行综述.     

翻译后修饰对α-晶体蛋白分子伴侣活性的影响及白内障形成机制

翻译后修饰 (posttranslationalmodification ,PTM)是蛋白质翻译后通过酶的催化或酶控制下的反应而发生修饰 ,包括糖基化、氨甲酰化、氧化、磷酸化、乙酰化、脱酰胺和切除作用等。白内障和老化被认为是一类结构性疾病 (conformationaldisease)。PTM可造成蛋白质结构改变。α 晶体蛋白作为晶状体主要的结构蛋白质 ,具有分子伴侣 (molecularchaperone)活性 ,可抑制蛋白质的凝聚和酶的失活。PTM可诱导α 晶体蛋白分子内部或分子之间的交联 ,导致其分子伴侣活性降低 ,加速白内障形成。赖氨酸基团对PTM最敏感 ,封闭赖氨酸的ε 氨基基团 ,可阻止和延迟蛋白质交联。寻找抑制或阻断PTM的因子 ,有助于药物治疗此类疾病方法的突破。     

糖基化对牛α-晶状体蛋白分子伴娘功能的作用

α-晶状体蛋白作为晶状体的主要结构蛋白，是维持晶状体结构和屈光特性的重要物质，其分子伴娘功能对保护晶状体透明具有决定性作用。糖基化可修饰α-晶状体蛋白，影响其分子伴娘功能，参与年龄相关性白内障和糖尿病性白内障的形成。本研究通过观察α-磷酸果糖(fructose-6-phosphate，F6P)和核糖对α-晶状体蛋白的修饰和影响，证实糖基化在白内障形成中的作用机制。     

人晶状体细胞膜衰老模型的建立

目的建立人晶状体细胞膜年龄相关性改变的体外实验模型。方法取3对完整晶状体(30、41、63岁),将每对中的1个晶状体经50℃加热20h,与对侧未加热的晶状体均行冷冻切片。将上述切片行6-酰基-2-二甲氨基萘染色,然后在双光子共聚焦显微镜下观察。测量距晶状体中心处不同位点的总极化图像灰度(即总极化值),以评估相应位点细胞膜流动性的变化。另取2个晶状体(28、47岁)的冷冻切片,将切片于50℃加热20h,观察加热与未加热切片的细胞膜流动性改变情况。结果完整晶状体经加热后,中央区域的细胞膜流动性较对侧未加热晶状体明显增加,加热后的晶状体切片较加热前细胞膜流动性亦明显增加。结论晶状体50℃加热是模拟晶状体细胞膜流动性年龄相关性改变的有效模型,可用于晶状体细胞膜流动性方面的研究。