CEMx174细胞中SAMHD1蛋白表达与SIVmac239病毒水平的相关性研究

目的研究SIV在感染CEMx174细胞过程中,SAMHD1在基因和蛋白水平的变化与病毒水平之间的相关性。方法 SIVmac239病毒感染CEMx174细胞后,每天收集上清和细胞,应用Taq Man探针实时荧光定量RT-PCR方法,检测细胞内SAMHD1 mRNA的相对表达量的变化;用Western blot检测SAMHD1蛋白与SIVmac239P27蛋白表达量的变化,并分析其相关性。结果 CEMx174细胞感染SIVmac239后,细胞中的SAMHD1 mRNA基于内参基因GAPDH的相对表达量逐渐增加,前3 d分别增加了14%,16%,42%,随后开始迅速增加,第4天达到了200%,第6天更是达到了890%;细胞中SAMHD1蛋白的表达量在感染后第1、2天时变化不大,随后逐渐降低,到第5、6天时,几乎检测不到,呈现逐渐下降的趋势。结论 CEMx174细胞感染SIVmac239后,SAMHD1基因表达上调,与上清中病毒载量水平正相关,细胞内SAMHD1蛋白水平与SIVmac239 P27蛋白水平呈负相关。     

SIVmac239病毒经不同途径感染恒河猴急性期CD4+T细胞数量与其细胞表面CD95表达量的变化关系

目的研究SIVmac239病毒分别通过直肠(rectal infection:IR)及静脉(intravenous infection:IV)感染恒河猴,在感染急性期外周血CD4+T细胞数量与其细胞表面的死亡受体(CD95)表达量之间的变化关系。方法将SIVmac239经直肠及静脉途径各感染14只恒河猴。监测病毒载量、CD4+T淋巴细胞数量及CD4+/CD8+比值的变化,从而明确感染。同时,在感染急性期内9个时间点采集静脉血,并利用流式细胞术分析CD4+T细胞表面CD95的表达量。结果静脉组恒河猴CD95表达量于第2天开始升高,第7天达到最高,同时CD4+T淋巴细胞数降到最低。直肠组恒河猴也于感染后第2天开始升高,但第10天才达到最高值,CD4+T淋巴细胞数于第17天降到最低。同静脉组相比,直肠组CD95表达量增高及CD4+T细胞数降低均较晚出现,且其CD4+T细胞数量降至最低晚于CD95表达量达到峰值一周后出现。结论 SIVmac239经直肠及静脉感染恒河猴后,伴随CD4+T细胞表面CD95表达的升高,CD4+T细胞数量逐渐下降。但不同感染途径对CD4+T细胞表面CD95的表达量与CD4+T淋巴细胞数的变化不尽相同,这可能由于不同感染途径造成CD95在感染急性期CD4+T细胞数量降低中发挥的作用不同。     

HIV-1 p24和SIV p27两种ELISA试剂盒检测SIV p27抗原的比较

目的 由于检测SIV p27抗原试剂盒来源困难,有时不稳定,鉴于HIV-1 p24与SIVp27有较强的交叉抗原,本研究比较HIV-1 p24和SIV p27两种ELISA试剂盒检测SIV p27抗原得出的结果是否存在一定的相关性.方法 HIV-1 p24和SIV p27两种ELISA试剂盒定性和定量检测样品中SIV p27抗原,并对检测结果进行回归和相关分析.结果 HIV-1 p24和SIV p27两种ELISA试剂盒检测SIV p27抗原的灵敏度分别是150 pg/mL和62.5 pg/mL.两种试剂盒检测病毒液和血浆中SIV p27抗原的定性结果一致.定量结果的统计分析得出病毒液的直线回归决定系数R2=0.857,直线相关系数r=0.926,P＜0.01,直线正相关程度较高;血浆的直线回归决定系数R2=0.512,直线相关系数r=0.716,P＜0.05,直线正相关程度较低.结论 HIV-1 p24 ELISA试剂盒能够替代SIV p27 ELISA试剂盒定性检测病毒液和血浆中SIV p27抗原,但只能定量检测病毒液中SIV p27抗原.     

猴免疫缺陷病毒SIV核心蛋白基因在大肠杆菌中表达的研究

应用多聚酶链反应（ＰＣＲ），直接从ＳＩＶ感染的猴艾滋病（ＳＡＩＤＳ）模型猴的外周血淋巴细胞总ＤＮＡ中扩增出７６７ｂｐ的ＳＩＶ核心蛋白Ｐ２７基因片段。扩增产物经ＥｃｏＲＩ及ＳａｌＩ双酶切后，克隆入相同酶切的表达质粒ｐＢＶ２２０中，获得含ＳＩＶ核心蛋白基因片段的重组质粒ｐＢＶＳＧ，并进行ＤＮＡ序列分析。用该重组质粒转化大肠杆菌ＤＨ５ａ经筛选、增殖及４２℃温度诱导，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ表明外源基因表达蛋白含量占菌体总蛋白１４．５％，Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ证实表达产物能被ＳＩＶＰ２７单克隆抗体及ＳＡＩＤＳ模型猴血清中特异性抗体识别。     

腺病毒介导人血管内皮细胞生长因子基因感染NIH3T3细胞的实验研究

目的:探讨腺病毒介导人血管内皮细胞生长因子(hVEGF)基因感染NIH3T3细胞后目的基因表达情况及其对细胞增殖分化的影响,并观察体内移植后的表达情况及其血管生成效应.方法:构建含hVEGF基因重组腺病毒Ad.hVEGF,体外感染NIH3T3细胞,采用荧光显微镜和流式细胞术检测其转染效果和转染率,采用免疫组化、RT-PCR和ELISA法分别检测转染后的NIH3T3细胞VEGF的表达情况.将转染后的NIH3T3细胞移植于小鼠背部皮肤缺损模型上,1周后取创面覆盖的脱细胞真皮组织标本,免疫组化检测组织VEGF的表达,并行组织新生血管计数.结果:携带hVEGF基因的重组腺病毒对于NIH3T3细胞具有较高的转染效率,转染效率与病毒感染复制数(multiplicities of infection,MOI)具有量效关系.MOI为100倍时,转染效率达95%.RT-PCR和免疫组化检测到,Ad.hVEGF感染NIH3T3细胞24 h后即可在基因和蛋白质水平表达,ELISA法检测到VEGF第3日表达分泌较高,7 d时达到表达高峰(1052 pg/ml),13 d后仍可检测到VEGF的表达.2周内MTT法动态检测D值,转染组细胞与未转染组细胞比较无显著性差异(P＞0.05).转染细胞体内种植后在组织中亦可明显表达VEGF,实验组新生血管数显著高于对照组(P＜0.01).结论:腺病毒介导的VEGF基因可有效转染NIH3T3细胞,体内外均可有效表达目的基因,并可促进移植组织血管新生.     

表现神经症状的SIVmac251感染猴大脑基底节病毒gp120序列变异分析

目的研究猴免疫缺陷病毒SIVmac251在中国恒河猴感染传代过程中产生的可能的神经侵袭性和神经嗜性及其分子机制。方法从静脉感染SIVmac251-155p6N的8只实验猴中出现严重神经症状的1只猴中,监测病毒及免疫指标变化,观察临床症状、猴脑组织病变,单拷贝PCR扩增病毒gp120序列并分析变异及糖基化位点变化情况。结果感染猴晚期出现明显艾滋病脑病症状,病理切片显示脑组织出现多核巨细胞及神经元变性、坏死。脑基底节分离出单一序列病毒,其氨基酸序列与血浆病毒及感染毒株SIVmac251-155p6序列差异主要位于Gp120的V1和V4区,并且在C1区66位出现一个糖基化位点缺失。结论SIVmac251在猴体长期传代过程中表现出神经嗜性毒株的特征,对AIDS脑病研究具有重要意义。      

SIVmac239毒株经静脉及直肠感染中国恒河猴的比较

目的研究猴免疫缺陷病毒SIVmac239毒株经静脉及直肠途径感染中国恒河猴后的生物学特性和症状表现,并比较由感染途径不同导致的差异,为该模型系统的应用提供依据。方法以SIVmac239毒株经静脉感染19只中国恒河猴,经直肠感染6只中国恒河猴,观察至感染后232或168d,比较其抗猴免疫缺陷病毒(SIV)特异性抗体滴度、CD4 T细胞数量、血浆病毒载量、淋巴结病理改变以及临床表现的变化。结果所有猴均出现SIV抗体阳转。在静脉感染猴,感染后10d检测到SIV特异的IgM,而直肠感染猴始终未能检测到。在感染后168d,静脉感染猴的SIV特异性IgG的平均水平较直肠感染猴高10倍。在观察期内,直肠感染组的CD4 T细胞数下降不如静脉感染组显著。所有猴的血浆SIV载量均在感染后10~14d达到高峰(107拷贝/ml左右),约2个月后降至平台期(103~106拷贝/ml)。2只静脉感染猴及1只直肠感染猴在感染后150~210d死于猴免疫缺陷综合征,呈快速进展型改变。结论SIVmac239毒株静脉及直肠感染接种中国恒河猴,均可建立慢性的SIV感染,其特征与人感染人类免疫缺陷病毒后的改变相似,均可以作为良好的研究获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的动物模型,尤其有助于预防性或治疗性AIDS疫苗的研究。     

SIVmac239感染T淋巴细胞后的上清液对B淋巴细胞增殖的抑制

目的探讨恒河猴免疫缺陷病毒SIVmac239感染CD4+T淋巴细胞后,能否产生某些可抑制B淋巴细胞生长的活性因子。方法用MTT实验观察不同时间收集的SIVmac239感染的CD4+T淋巴细胞上清液和未感染SIVmac239的CD4+T淋巴细胞(C8166)的上清液对猕猴B淋巴细胞(MM133)生长的抑制作用情况。结果SIVmac239感染的CD4+T淋巴细胞上清含有抑制猕猴B淋巴细胞生长的因子,并且,其抑制效果随着作用时间的延长而增加。结论SIVmac239感染CD4+T淋巴细胞可产生抑制B淋巴细胞生长的因子。     

E-selectin及其配体介导食管癌细胞与血管内皮细胞早期粘附

目的探讨E-选择素（E-selectin）及其配体sLe A和sLe X在食管癌细胞和内皮细胞早期粘附中的作用。方法应用粘附实验检测食管癌细胞和血管内皮细胞的粘附。结果静息状态下,人食管癌细胞株EC9706和奇静脉内皮细胞株ECV304粘附较少,内皮细胞经脂多糖激活后,与人食管癌细胞株粘附显著增加。激活内皮细胞组、E-选择素单抗（1∶200）、E-选择素单抗（1∶400）、E-选择素单抗（1∶800）组相对粘附率（5.2900±0.790）、（1.8818±0.8289）、（1.9436±0.3935）、（3.1730±0.4887）,差异具有统计学意义（F值28.789,P值〈0.001）。sLe A、sLe抗体处理组相对粘附率分别为（2.5436±0.6789）、（3.1286±0.8306）,均较未处理（6.5170±0.9293）低,差异具有统计学意义（P〈0.01）。结论E-selectin及其配体sLe A和sLe X介导食管癌细胞和内皮细胞早期粘附,可能与食管癌转移有关。     

两种分离大鼠心脏微血管内皮细胞方法的比较及改良

目的:比较两种分离成年大鼠心脏微血管内皮细胞的方法并进行改良.方法:分别采用组织块贴壁法和酶消化法分离大鼠心脏微血管内皮细胞,并对其进行表面特异性抗原CD31免疫荧光鉴定.结果:两种方法都获得了心脏微血管内皮细胞,CD31鉴定细胞阳性率在95％以上.两种方法相比,酶消化法具有获得所需的细胞时间相对短,稳定可靠,细胞纯度高等特点.结论:使用酶消化法可获得纯度高、状态良好的心脏微血管内皮细胞.     

非洲绿猴在艾滋病研究中的应用进展

人类在人免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus,HIV-1）感染后,通常经过一段潜伏期,进展为艾滋病（acquired immunodeficiency syndromes,AIDS）。非洲绿猴（African green monkeys,AGM）是SIV（simian immunodeficiency virus,SIV）的天然宿主,虽然体内的病毒水平与HIV感染者相似,但不表现出艾滋病症状。因此,探索AGM控制病毒复制和疾病进展的分子机制,可以很好地促进对HIV感染致病机理的认识和AIDS疫苗与治疗方法的研究。本文简要介绍AGM在艾滋病研究中的应用和最新研究进展,为艾滋病动物模型的研究提供更多参考。     

人体内皮细胞对胆固醇的代谢作用

研究人体内皮细胞对胆固醇的代谢作用。方法以体外培养的胎儿脐静脉内皮细胞为实验对象，应用免疫印迹技术、同位素标记技术和气相色谱－质谱分析技术，联合测定胆固醇代谢产物２７－羟基胆固醇和３β－羟基－５－胆甾烯酸含量。结果在内皮细胞培养液中，２７－羟基胆固醇和３β－羟基－５－胆甾烯酸含量随培养时间延长而增多；在培养液中加入１００μｇ外源性胆固醇再培养，上述两种产物含量明显增加；应用氘标记胆固醇证明，大部分产物是由细胞摄取的外源性胆固醇在固醇２７－羟化酶的作用下形成的，并且证明体外培养的内皮细胞内含有固醇２７－羟化酶。结论体外培养的人体脐静脉内皮细胞对外源性胆固醇有代谢作用，其路径可能是内皮细胞摄取胆固醇，在固醇２７－羟化酶的作用下，生成容易从细胞内转运出来的２７－羟基胆固醇和３β－羟基－５－胆甾烯酸。     

细胞色素P450表氧化酶抑制肿瘤坏死因子诱导内皮细胞凋亡的研究

目的:研究细胞色素P450表氧化酶对肿瘤坏死因子诱导的内皮细胞凋亡可能的机制。方法:原代培养的牛主动脉内皮细胞分为4组,分别转染细胞色素P450表氧化酶基因rAAV-GFP、rAAV-2J2、rAAV-2C11、rAAV-F87V病毒液,2周后用肿瘤坏死因子?α(TNF?α)(10ng/mL)和放线菌素D(ActD)(5ng/mL)诱导凋亡,GFP组不加TNF?α和ActD作为对照,另设空白对照组,用Western blot法检测Bcl-2和Bax的表达,并用酶标法检测Caspase-3的活性。结果:Western blot结果表明转染CYP P450表氧化酶的各组后Bcl-2表达升高,Bax表达下降,Caspase-3的活性下降,较空白对照组及GFP对照组差异有统计学意义(P均<0.01)。结论:细胞色素P450抗内皮细胞凋亡的机制可能与上调Bcl-2表达,下调Bax表达及抑制Caspase-3活性有关。     

巨细胞病毒感染对内皮细胞凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体-1 mRNA表达的影响

目的探讨巨细胞病毒(CMV)感染对人内皮细胞凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体-1 mRNA表达的影响.方法原代培养人脐静脉内皮细胞并传代,CMV感染3～6代细胞,不同时间提取细胞总RNA,采用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)检测凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体-1 mRNA的表达.结果病毒感染6h凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体-1 mRNA表达与对照组相似,病毒感染12、24h与对照组比较明显增强.结论CMV感染上调凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体-1 mRNA表达,可能是CMV参与动脉粥样硬化的机制之一.     

ART治疗对HIV感染者CD4+FoxP3+T细胞水平的影响

目的:探索抗逆转录病毒疗法(ART)治疗在HIV-1疾病进程中对调节性T细胞(Treg细胞)的影响,并探讨Treg细胞频率在HIV-1疾病进程中的作用.方法:抽取114例(男96例、女18例)HIV-1阳性患者及17例健康对照者外周血,应用流式细胞术检测Treg细胞,并分析其表达水平(频率和绝对数)在 HIV-1疾病进程中的变化趋势及其与CD4+细胞绝对数之间的相关性.结果:随着HIV-1感染者病情进展,患者外周血中Treg细胞绝对数趋向下降并且与CD4+T细胞绝对数呈正相关,而Treg细胞频率趋向升高并且与CD4+T细胞绝对数呈负相关.Treg细胞频率及绝对数在ART治疗无症状HIV-1阳性感染者中显著降低,而在AIDS患者中却显著升高.结论:Treg细胞参与艾滋病免疫发病过程,并且在HIV-1感染的不同阶段,ART治疗对Treg细胞水平具有一定的影响,提示通过控制Treg细胞的水平可能有助于HIV-1感染疾病的临床控制.     

RNA干扰Tax基因表达及其对HTLV-Ⅰ在TLC中转录的影响

目的探讨RNA干扰Tax基因表达对人嗜T淋巴细胞病毒Ⅰ型（HTLV—I）在T淋巴细胞（TLC）中表达的影响。方法运用RNAi技术特异性干扰Tax基因的表达,流式细胞技术和western blot法鉴定Tax蛋白的表达情况,并通过p27特异性蛋白的检测反映HTLV—I在TLC中表达。结果重组质粒psiTax／U6转染T细胞组Tax蛋白的表达（9．84&#177;3．32）％较未处理组（47．45&#177;14．52）％和pSilencer1．0／U6转染组（45．98&#177;10．66）％明显降低;western blot法显示重组质粒psiTax／U6转染TLC后。Tax以及p27蛋白表达较pSilencer1．0／U6转染组明显降低。结论运用RNA技术干扰Tax基因表达可以有效的阻止HTLV—1在TLC中的转录。     

ROS对内皮细胞胞浆游离钙水平的影响

目的探讨活性氧（ROS）在TNFα刺激人脐静脉内皮细胞（HUVEC）胞浆游离钙水平变化中的作用。方法用氧化-还原敏感的荧光探针2,7-Dichlorofluorescein（DCF）检测细胞内氧化-还原水平。用激光共聚焦显微镜检测胞浆游离钙浓度。结果TNFα（200U/ml）处理24h后,HUVEC胞内ROS水平和游离钙浓度均明显升高;NAC（20mmol/L）预处理可明显抑制胞浆内游离钙浓度（P〈0.01）。结论ROS部分介导了TNFα对胞浆内游离钙水平的诱导作用。     

HIV/AIDS患者低钠、低钾血症与合并机会性感染关系的临床研究

目的探讨人类免疫缺陷病毒（HIV）感染者和艾滋病（AIDS）患者血钠、血钾和肾功能情况。方法总结280例HIV／AIDS患者临床资料,分析其血钾、血钠和肌酐、尿素氮水平,并探讨机会性感染的发生情况。结果低钠血症和低钾血症多见于CD4^＋淋巴细胞〈200个／mm^3的患者,其发生率为19．4％和13．3％,显著高于CD4^＋T淋巴细胞≥200个／mm^3组。在低钠血症和低钾血症患者中,机会性感染的发生率分别为70．6％（24／34）和60．7％（17／28）,显著高于非低钠、低钾血症组。在280例HIV／AIDS患者中,仅发现2例肾功能异常。结论低钠血症和低钾血症多发生于AIDS晚期患者,合并机会性感染者更易出现,临床医师应在CD4T淋巴细胞数量〈200／mm^3时注意患者的血钠和血钾水平;HIV感染对肾脏功能影响较小。     

普伐他汀对培养人内皮祖细胞药理作用的影响

目的观察普伐他汀对培养人内皮祖细胞（EPC）数量、增殖、迁移、黏附及一氧化氮（NO）合成能力的影响。方法采用密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞,贴壁筛选法培养内皮祖细胞,培养7d后收集细胞并分别加入普伐他汀10μmol／L及100μmol／L,干预48h,免疫组化、荧光显微镜和流式细胞仪鉴定内皮祖细胞,分别观察内皮祖细胞的数量、增殖迁移黏附能力、细胞内皮型一氧化氮合酶（eNOS）、mRNA的表达以及培养液中NO的水平。结果普伐他汀组促进外周血内皮祖细胞扩增,并显著改善外周血内皮祖细胞的黏附、迁移、增殖以及eNOSmRNA表达和NO合成的能力。结论他汀类药物可增加培养人内皮祖细胞数量并改善其功能。