基于细胞因子对介导同种异体反应的 T淋巴细胞的测定和富集及扩增

目的对同种异体外周血单个核细胞(PBMNCs)刺激后分泌细胞因子的T淋巴细胞进行测定、富集和扩增,为研究介导同种异体反应的T淋巴细胞提供新的途径.方法利用细胞因子分泌检测方法(CKSA),从单细胞水平定量测定人混合淋巴细胞反应中分泌干扰素-γ(IFN-γ)的T淋巴细胞;并对其进行磁性富集、扩增,再用酶联免疫斑点法(ELISPOT)检测其对原抗原的特异性.结果同种异体PBMNCs刺激后检测到分泌IFN-γ的T淋巴细胞水平较对照组明显升高[(1.12±0.13)% vs (0.23±0.07)%,P<0.05],进一步富集达(67.3±10.5)%,相对倍数为(93.8±22.1)倍.经过富集的细胞能够通过OKT3、抗CD28单抗和IL-2组合,在21～28 d扩增>600倍,扩增后的细胞保留与原相关异基因刺激细胞特异性反应,并具分泌IFN-γ的能力.结论利用CKSA从单细胞水平定量测定到显著升高的由同种异体PBMNCs刺激后分泌IFN-γ的T淋巴细胞.这些细胞可以被有效地富集和扩增,并保留针对原抗原的特异反应性.     

悬浮红细胞对CD4+CD25+Treg细胞分化的影响

目的 体外观察悬浮红细胞对异体T淋巴细胞向CD4+ CD25+ Treg细胞分化的影响.方法 采用Ficoll密度梯度离心法和免疫磁珠法从人外周血中分离纯化出CD3+T淋巴细胞,给予CD3/CD28抗体刺激,并分别与异体非去白悬浮红细胞或去白悬浮红细胞混合培养72 h.采用流式细胞仪检测各组培养体系中CD4+ CD25+Treg细胞的比例.采用实时荧光定量PCR检测各组Foxp3 mRNA的表达情况.采用酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法检测各组细胞上清中促炎细胞因子[白细胞介素2(interleukin-2,IL-2)和干扰素γ(interferon-γ,IFN-γ)]和抗炎细胞因子[白细胞介素10(interleukin-10,IL-40)和转化生长因子β(transforming growth factor beta,TGF-β)]的水平.结果 与阴性对照组(细胞培养液组)比较,非去白悬浮红细胞和去白悬浮红细胞组CD4+ CD25+ Treg细胞比例明显增加,功能基因Foxp3 mRNA表达也明显增高;1L-2和IFN-γ促炎细胞因子分泌减少,IL-10和TGF-β抗炎细胞因子分泌增多(P＜0.01).而与去白悬浮红细胞比较,非去白悬浮红细胞作用更加明显(P＜0.05).结论 悬浮红细胞可能通过调节促炎/抗炎细胞因子平衡诱导异体T淋巴细胞向CD4+ CD25+ Treg分化,而悬浮红细胞内残留的白细胞可能在其中起了关键作用.     

人脐血间充质干细胞抑制异体T淋巴细胞反应的实验及临床意义

目的:研究人脐血间充质干细胞(MSCs)对异体外周血T淋巴细胞抑制的影响.方法:分离、扩增脐血MSCs,流式细胞术检测表面标志以鉴定.取分离培养的脐血MSCs,与经分离的异体淋巴细胞共培养,在植物血凝素(PHA)刺激下,用MTT还原法测定细胞增殖,观察脐血MSCs对PHA刺激的T淋巴细胞转化抑制作用.采用ELISA检测培养上清中IFN-γ和IL-4的分泌水平.结果:脐血MSCs在PHA刺激下可抑制T淋巴细胞增殖,且其培养上清也具有抑制异体淋巴细胞增殖转化能力.ELISA检测7 d共培养上清中IFN-γ和IL-4两种细胞因子的含量,发现IFN-γ分泌水平下调、IL-4分泌水平部分上调.结论:脐血MSCs具有抑制异体淋巴细胞免疫反应,降低移植物抗宿主反应(GVHD)的作用.具有研究价值和应用潜能.     

人骨髓间充质干细胞对异体外周血T淋巴细胞的抑制作用及机制

目的:探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)体外对异体外周血T淋巴细胞的抑制作用及机制.方法:从骨髓中分离培养MSCs,反复贴壁进行纯化;用尼龙棉柱法纯化异体外周血T淋巴细胞;观察MSCs对植物血凝素(PHA)刺激下T淋巴细胞增殖的影响,用ELISA方法检测IFN-γ,IL-4水平变化.结果:MSCs对PHA诱导的T淋巴细胞增殖有抑制作用,并呈剂量依赖性;同时MSCs亦可抑制T淋巴细胞的IFN-γ分泌,但可促进IL-4的分泌.结论:MSCs对异体外周血T淋巴细胞的增殖有抑制作用,其作用可能与其影响T淋巴细胞分泌IFN-γ和IL-4有关.     

胎盘源间充质干细胞对T淋巴细胞因子分泌的影响

目的从人胎盘组织中分离培养获得间充质干细胞（MSCs）,并进一步研究其对异体T淋巴细胞细胞因子白细胞介素2（IL-2）、γ-干扰素（IFN-γ）分泌的影响。方法首先从胎盘组织中分离培养胎盘间充质干细胞（PM-SCs）,在体外观测其形态,并通过细胞表面抗原表达、分化潜能等特征进行鉴定;然后将体外分离培养扩增的PMSCs按照不同比例加入双向混合淋巴细胞培养体系（MLR）中,共同培养3d后,用ELISA法检测各组MLR上清中细胞因子IL-2与IFN-γ的含量。结果从人胎盘组织中分离培养获得MSCs,具有与骨髓间充质干细胞（BMSCs）极为相似的细胞形态及细胞表面标志,并且还具有与BMSCs相似的跨胚层分化能力,能在一定条件下被诱导分化出神经元样细胞。PMSCs与同种异体混合淋巴细胞共同培养后,能有效抑制MLR中T淋巴细胞细胞因子IL-2与IFN-γ的分泌（P〈0.05）。结论胎盘组织是MSCs的有效来源,PMSCs具有与BMSCs相似的生物学特性及免疫调节机制,为MSCs的研究提供了又一重要的细胞来源。     

肺结核患者CD4+T淋巴细胞凋亡及相关细胞因子水平变化

目的探讨肺结核患者外周血CD4 T淋巴细胞凋亡及相关细胞因子水平的变化。方法分离肺结核患者和正常人外周血单核细胞标记后用流式细胞仪测定CD4 T淋巴细胞凋亡率,用ELISA法检测白细胞介素-10(IL-10)与干扰素-γ(IFN-γ)的浓度。结果肺结核患者外周血CD4 T淋巴细胞凋亡率明显高于正常对照组,淋巴细胞培养上清液IL-10水平显著高于对照组,而IFN-γ水平显著低于对照组。涂阳组外周血CD4 T细胞凋亡率高于涂阴组与健康对照组,复治组外周血CD4 T细胞凋亡率显著高于初治组与健康对照组。外周血CD4 T细胞凋亡率与IL-10,IFN-γ水平相关。结论外周血CD4 T淋巴细胞凋亡增加可能是肺结核的免疫发病机制之一,对诱导或抗凋亡的某些因素进行干预有望为结核病的治疗带来新的希望和突破。     

小鼠膜型B7-H1分子激活同种异体Tr1细胞介导免疫抑制

目的:观察小鼠膜型B7-H1分子对同种异体CD4+T细胞分化和功能的影响,探讨B7-H1诱导免疫抑制的作用机制。方法:用经稳定转染而高表达膜型B7-H1分子的小鼠1B4.B6细胞刺激同种异体小鼠初始CD4+T细胞,检测被激活的CD4+T细胞的细胞因子分泌格局、免疫功能及Foxp3的表达。结果:与转染空载体的对照细胞相比,高表达B7-H1的1B4.B6细胞刺激同种异体CD4+T细胞产生高水平白细胞介素10(interleukin 10,IL-10)和干扰素γ(interferonγ,IFN-γ)、极低水平IL-4和IL-2。活化的CD4+T细胞具有免疫抑制活性,不表达Foxp3。结论:稳定转染B7-H1的1B4.B6细胞可通过其表面高表达的B7-H1分子诱导同种异体Ⅰ型调节性T细胞(type 1 regulatory T cells,Tr1)的分化。     

肺癌患者Th1/Th2细胞因子的免疫反应状态变化及临床意义

目的:分析肺癌患者外周血分泌不同细胞因子的T细胞数以及血清中6种细胞因子的水平,为肿瘤的免疫治疗提供实验依据。方法:先用刺激物刺激外周血T细胞,以增加细胞内细胞因子的表达,继用流式细胞仪分析特异性细胞因子表达水平。同时用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清中相应的细胞因子量。结果:肺癌患者Th1型细胞因子干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-12(IL-12)表达水平较正常对照组显著降低,Th2型细胞因子白细胞介素-4(IL-4)和白细胞介素-10(IL-10)表达水平较正常对照组升高,差异有显著性。肿瘤坏死因子-a(TNF-a)表达水平较正常对照组升高,差异有显著性意义。结论:肺癌患者体内Th2型细胞因子模式占优势状态,这可能是肿瘤细胞发生免疫逃逸的原因之一。     

小鼠脾脏间充质干细胞调节T淋巴细胞的增殖与活化

目的研究小鼠脾脏间充质干细胞(Sp-MSCs)对T淋巴细胞增殖与活化的调节作用。方法采用组织块法从小鼠脾脏中分离培养出Sp-MSCs,并做多向诱导分化实验。分离小鼠T淋巴细胞,开展淋巴细胞转化试验和混合淋巴细胞反应,分别检测Sp-MSCs对于非特异抗原和同种异体抗原活化的T淋巴细胞的影响。以CFSE流式法检测Sp-MSCs对活化的T淋巴细胞增殖的影响。采用定量PCR分析Sp-MSCs对T淋巴细胞表达的炎性细胞因子的影响。结果流式检测结果显示Sp-MSs C可以抑制非特异抗原和同种异体抗原引起的T淋巴细胞增殖。Sp-MSCs能够有效抑制淋巴细胞转化试验和混合淋巴细胞反应引起的细胞活化。进一步分析发现,Sp-MSCs抑制T淋巴细胞表达干扰素γ,肿瘤坏死因子α和白细胞介素17A。结论 Sp-MSCs能够抑制T淋巴细胞增殖与活化,抑制T淋巴细胞表达多种炎性细胞因子。     

来源于人外周血单核细胞的树突状细胞感染rAAV-HBsAg后的功能改变

目的观察人外周血单核细胞来源树突状细胞(DCs)经重组腺相关病毒(rAAV)载体介导乙肝表面抗原(HBsAg)基因感染后的功能改变。方法采用ELISA试剂盒检测感染rAAV-HBsAg后的DCs (rAAV-HBsAg-DC)分泌IL-12水平以及rAAV-HBsAg-DCs与淋巴细胞共孵育后上清中γ-干扰素(IFN-γ)的含量;采用混合白细胞反应(MLR)检测rAAV- HBsAg感染前后DCs刺激同种异体淋巴细胞的增殖能力;用FACSort流式细胞仪检测rAAV-HBsAg-DCs表面分子CD80、CD83、CD86和HLA-DR的变化。结果rAAV-HBsAg感染可促进DCs分泌IL-12(P<0.05),感染后的DCs刺激淋巴细胞分泌IFN-γ的水平显著提高(P<0.01),感染前后的DCs刺激同种异体淋巴细胞增殖能力及其特征性表面分子无明显改变。结论rAAV介导HBsAg基因感染的DCs能诱发淋巴细胞朝Th1型细胞分化,且不明显改变DCs的表型和刺激淋巴细胞增值的功能,rAAV载体介导HBsAg基因体外遗传修饰的DCs可以进一步用于乙型肝炎的免疫治疗研究。