猪肝细胞的分离与原代培养

目的：建立稳定的猪肝细胞的分离与原代培养体系,满足生物人工肝体外支持系统对肝细胞的需求。 方法:应用改良Seglen法进行肝脏原位胶原酶灌流分离猪肝细胞,进行平面培养,动态观察细胞生长过程中的形态结构变化。 结果：平均每只猪可获得2×10¹⁰个肝细胞,细胞活率达到92.5%。在平面培养过程中维持了正常肝细胞的形态。 结论：原位胶原酶灌流法是获得大量高活率的猪肝细胞的首选方法,猪肝细胞原代分离培养是目前解决组合型生物人工肝脏（HBLSS）应用中细胞来源问题的主要途径。     

一种简化的分离与培养小鼠原代肝细胞的方法

目的 建立一种简单的能获得高纯度小鼠原代肝细胞的分离与培养方法。方法 将经典的两步灌流法简化为经下腔静脉逆向脉冲式灌注,利用低速离心法对肝细胞分离液进行纯化;利用锥虫蓝染色法鉴定细胞活率;培养瓶预先用鼠尾胶原铺备,利用倒置显微镜观察细胞形态。结果 此法得到了足够数量的肝细胞,细胞活率大于90%;细胞可稳定贴壁1周。结论 成功建立了一种简单的分离与培养小鼠原代肝细胞的方法。     

乳小鼠培养肝细胞蛋白质双向电泳技术的建立

目的 :建立培养乳小鼠肝细胞蛋白质的双向电泳技术。方法 :取乳小鼠肝脏组织 ,进行肝细胞原代培养 ,提取肝细胞蛋白 ,以固相pH梯度 (IPG)等点聚焦为第一向 ,垂直SDS -PAGE为第二向进行双向电泳 ,并对样品处理方式、蛋白上样量、IPG等电聚焦和SDS -PAGE电泳参数设置、凝胶浓度等关键因素和环节进行了比较研究。结果 :通过实验条件的筛选和优化获得了较满意的双向电泳图谱。结论 :本文建立乳小鼠双向电泳分离技术 ,具有较高的分辨率和重复性 ,为研究肝脏不同条件下特异性蛋白的表达及分子标记奠定了基础     

小鼠原代肝细胞的分离与培养

目的 探索小鼠原代肝细胞细胞分离培养的简化方法,并对其生物学特性进行鉴定。方法 分离出生2～3 d小鼠肝组织,利用低温下机械剪碎法结合胶原酶消化,分离小鼠原代肝细胞,利用小鼠肝表面抗原CK-19进行荧光染色鉴定。结果 成功地从乳鼠体内分离获得肝原代细胞,免疫荧光鉴定属于肝细胞。结论 利用简单的机械加酶消化法也可以获得肝组织细胞,且得率较高,细胞活力较好。     

新生小鼠肝细胞的体外培养

目的：探讨体外培养新生小鼠肝细胞的方法。方法：采用肝组织块外植培养和肝组织块胶原酶消化法培养新生小鼠肝细胞，并比较两种方法，结果：运用这两种方法成功地培养出原代肝细胞，并能够传代，光镜证实培养细胞为肝细胞，结论：这两种方法为广泛开展肝细胞培养奠定了基础。     

高效分离屠宰成年猪肝细胞用于生物人工肝方法的建立

【目的】探讨氧合dispase及胶原酶组酶消化法从屠宰成年猪肝脏高效分离肝细胞的方法及分离肝细胞的生物活性。【方法】部分肝叶逆行灌注、氧合组酶dispase及胶原酶消化、密度梯度离心法分离、纯化肝细胞 ,并对其生物活性进行检测。【结果】肝组织细胞的收获量达10× 10 6 个 / g ,细胞平均存活率可达 92 5 % ,且无泡状变性的发生 ,原代培养生物活性与原代培养鼠肝细胞一致 ,随时间的延长而减退。【结论】氧合组酶dispase及胶原酶消化、密浓度梯度离心法自屠宰成年猪分离肝细胞产量高、且保持着良好的生物活性 ,可作为生物人工肝的理想肝细胞源用于肝脏终末性疾患的治疗。     

经心脏逆行置管灌注法在小鼠原代肝细胞分离中的应用

目的 观察采用经心脏逆行置管灌注肝脏的方法分离小鼠原代肝细胞的效果。方法 对传统的分离原代肝细胞方法(Seglen两步胶原酶灌注法)进行改良,即从小鼠右心房的裂口处经肝上下腔静脉向下方置管,并以输液器滴注含体积分数10%胎牛血清的胶原酶灌注液进行肝脏灌注。评价此法与传统方法的置管成功率及所得肝原代细胞的数量及活力。结果 改良组总的置管操作成功率高达95%,且在一次置管成功率上改良组高于传统组（94.7% vs. 68.8%,P<0.05）。改良组小鼠肝脏灌注均匀,肝细胞产量高达1.07×106/g小鼠体质量,细胞活力平均为92.16%,两者均高于传统组（分别为0.99×106/g小鼠体质量及86.44%,P<0.05或P＜0.01）。结论 经心脏逆行置管灌注法分离小鼠原代肝细胞简便易学,重复性高,且能保证分离所得的肝细胞产量和质量。     

胰蛋白酶和胶原酶灌注法分离提取小鼠原代肝细胞的比较

目的：胰蛋白酶和胶原酶灌注法分离提取小鼠原代肝细胞的比较。方法：改良Seglen两步灌注法,选用胰蛋白酶和胶原酶D分别对同批生长的10～16周C57BL/6J雄性小鼠进行在体灌注分离肝实质细胞,比较分离肝细胞的存活率、纯度、形态、活性、获取数量等。结果：两种方法分离得到的小鼠原代肝细胞的存活率和纯度均达到90%以上,且在形态学上无明显差异,不同培养时间的细胞活性基本一致。胶原酶灌注法所得到的细胞数量多于胰蛋白酶灌注法。结论：胰蛋白酶和胶原酶灌注法均适用于分离提取小鼠原代肝细胞,可根据实验条件选择不同的灌注方法。     

肝脏灌注分离大鼠肝细胞及原代培养的方法

目的　建立分离及原代培养大鼠肝细胞的实验技术方法。方法　先后用无Ca2 灌流液及 0 .0 5 %Ⅳ型胶原酶灌注大鼠肝脏 ,分离肝细胞 ,进行原代培养。结果　用台盼蓝排除试验测肝细胞活率大于 90 % ,产率大于 3 .0× 10 8个活细胞。结论　灌注分离大鼠肝脏可获得大量肝细胞 ,而且存活率高 ,原代培养 2 4h后肝细胞完全贴壁 ,形成单层     

视神经星形胶质细胞原代培养技术研究

目的 介绍一种快速原代培养、分离、纯化视神经星形胶质细胞的方法。方法 对P2期小鼠的视神经进行组织块原代培养,振荡法分离纯化,形态学观察,免疫组织化学染色。结果 培养的星形细胞纯度高,GFAP染色显示98%阳性。结论 组织块原代培养,振荡法分离纯化视神经的星形胶质细胞,对细胞的损伤小、纯度高,是快速得到该细胞的理想途径。     

一种小鼠原代肝细胞培养方法

目的寻求一种简易、廉价的原代小鼠肝细胞培养方法。方法采用Ⅳ型胶原酶消化法制备游离肝细胞悬液，以低血清进行肝细胞单层培养。结果通过多次探索、观察，比较成功地进行了原代肝细胞培养。结论此方法适合一般实验室开展肝细胞培养。     

一种改良的小鼠原代肝细胞培养方法

为寻求一种简易、价廉的原代小鼠肝细胞培养方法 ,采用非灌注法、冰浴操作处理肝组织块及改良低血清培养基进行了原代鼠肝组织块和鼠肝细胞单层培养。通过光镜观察细胞形态、电镜观察超微结构及检测培养上清白蛋白水平证实培养细胞为肝细胞。持续培养结果显示原代培养第 6～ 12 d左右为肝细胞功能最佳观察和实验阶段。     

培养肝细胞在蛋白质组学研究中的应用

目的研究一种简便的肝细胞培养方法以培养出足够量的单一类型细胞，从而获得尽可能多的蛋白量进行细胞蛋白质组学分析。方法采用肝组织块贴壁法培养并传一代(目的是去组织块及其他间质细胞)。收集细胞蛋白并进行SDS—PAGE及双向凝胶电泳。结果本实验方法可获得高密度、高纯度、高活力的肝实质细胞，细胞裂解后得到的蛋白质电泳图谱效果好。结论实验方法操作简单、经济、高效，能够满足一般实验室进行细胞蛋白质组学分析。     

复方甘草酸苷在猪肝细胞悬浮培养中的应用

目的探讨复方甘草酸苷对体外悬浮培养肝细胞的保护作用。方法原位胶原酶循环肝灌注法分离猪肝细胞,将分离所得猪肝细胞分为2组,复方甘草酸苷组培养基中含有800ug/mL的复方甘草酸苷,对照组为普通培养组,悬浮培养1周,观察形态和功能的变化。结果2组肝细胞培养12h后均形成多细胞球样聚集体,复方甘草酸酐培养组肝细胞成团更为明显;复方甘草酸苷培养组上清液ALB在培养后24h、3d、5d高于单纯肝细胞培养组（P〈0.05）,在培养24h后,与培养后12h相比,复方甘草酸苷组ALB开始升高,普通培养组ALB开始降低,其后2组都开始升高,至7d时下降（P〈0.05）;2组肝细胞培养上清液BUN含量随培养时间延长逐渐升高,但2组之间差异无统计学意义（P〉0.05）;2组肝细胞上清液中ALT含量逐渐下降,第3～7天复方甘草酸苷培养组组ALT含量低于单纯肝细胞培养组（P〈0.05）。结论复方甘草酸苷对体外悬浮培养的肝细胞具有保护作用。     

三明治培养新生实验小型猪肝细胞的功能与形态

目的 探索双层胶原夹心猪肝细胞的方法，观察培养猪肝细胞的功能与形态特征。方法 将两步法分离的新生中国实验小型猪肝细胞接种于胶原被覆的培养板常规培养，24h后，肝细胞上再加一层胶原形成双层胶原夹心（三明治）培养，观察培养猪肝细胞的白蛋白分泌、形态学特征和乳酸脱氢酶（LDH）漏出量。结果 成功将新生实验小型猪肝细胞固定于双层胶原中，形成三明治状。培养1周内，用SDS／PAGE可检测出猪肝细胞分泌的白蛋白，倒置相差显微镜下观察到典型的形态特征，培养期内LDH漏出量较少。结论 可用双层胶原对新生乳猪肝细胞进行三明治样培养，为肝细胞提供更接近体内的培养环境，有助于维持特殊的肝功能和形态学特征。     

环磷酰胺对大鼠肝细胞的毒性

目的：探讨环磷酰胺对大鼠原代培养肝细胞的毒性作用.方法：采用“二步灌流法”制备大鼠原代肝细胞,分别给予10、20、40、80及160 μmol/L的环磷酰胺干预24h,溶剂对照组不予环磷酰胺干预.噻唑蓝（ MTT）法观察环磷酰胺对肝细胞的毒性,测定各组培养基上清液生化和细胞内氧化及抗氧化指标.结果：不同浓度的环磷酰胺对大鼠原代培养肝细胞均具有明显的毒性.与溶剂对照组比较,环磷酰胺干预的各实验组肝细胞培养上清液丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶均升高;细胞冻融液丙二醛含量均升高,超氧化物歧化酶及谷胱甘肽过氧化物酶活性均降低（均P ＜0.05）.结论：成功建立了环磷酰胺致大鼠原代培养肝细胞脂质过氧化模型.     

新型中空纤维编织型生物人工肝反应器的初步构建

目的 为体外生物人工肝支持系统构建一种新型中空纤维编织型生物反应器，提高传统中空纤维生物反应器的性能。方法 采用中空纤维编织方法，制作三维立体型生物反应器，对反应器进行物质传输试验后，将分离的新生实验小型猪肝细胞接种于中空纤维支架上，用培养液循环式人工毛细管系统进行培养，检测生物反应器的生物功能，观察培养猪肝细胞的酶漏出量。结果 传输试验显示，中空纤维编织型反应器的半秀快速传输含人白蛋白和酚红的RPMI 1640培养液。加入肝细胞并培养后，SDS／PAGE可从生物反应器内检测出猪肝细胞分泌的白蛋白，生物反应器内的猪肝细胞有效地将氯化铵转换成尿素。反应器实验中，肝细胞仅释放了少量的ALT、LDH。结论 初步研制出一种新的、符合生物人工肝基本要求的实验型生物反应器，该反应器内培养的肝细胞保持较好的细胞活力，具有生物合成与转换功能。     

人胚肝细胞分离培养研究

目的　探讨体外优化培养人胚肝细胞的方法。方法　采用胰蛋白酶和聚乙烯吡咯烷酮(pvp) ,胶原酶,胶原酶和pvp消化法分离人胚肝细胞,并比较3种方法对分离人胚肝细胞的效果。结果　运用这三种方法均能成功地培养出原代肝细胞,并能够传代;但胶原酶和pvp消化法分离细胞效果最好,细胞贴壁生长能力强。三种消化方法其细胞存活率从高到低依次为胶原酶和pvp消化法、胶原酶消化法、胰蛋白酶和pvp消化法。结论　人胚肝细胞的分离首选胶原酶和pvp消化法,使用该法在体外培养的人胚肝细胞生长良好,可用于肝细胞移植和生物人工肝等方面的研究。