LY367385通过抑制细胞外信号调节激酶途径减轻小鼠脑血管痉挛后神经细胞凋亡

目的: 探讨代谢型谷氨酸受体1(mGluR1)选择性拮抗剂LY367385对脑血管痉挛(CVS)后神经细胞凋亡的影响及细胞外信号调节激酶1/2(ERKl/2)途径的作用。方法: 采用非开颅血管内线栓法制备小鼠蛛网膜下腔出血(SAH)并CVS模型,随机分为3组:假手术组、模型对照组和mGluR1拮抗剂LY367385组,于SAH后10 min侧脑室注射生理盐水或LY367385(500 nmol)5 μL,术后行神经功能评分。分别在SAH后6、24和48 h 3个时点取右侧脑组织标本,在光镜和电镜下观察脑组织病理变化,采用逆转录-聚合酶链式反应检测各组mGluR1 mRNA的表达变化;蛋白免疫印迹法检测mGluR1和p-ERK1/2蛋白的表达;用TUNEL法检测神经细胞凋亡情况。结果: 与假手术组比较,模型组小鼠神经功能评分显著降低,随CVS时间延长,各组小鼠mGluR1 mRNA、mGluR1和p-ERK1/2蛋白均有不同程度增强,凋亡细胞增多,神经细胞出现变性坏死、神经轴索变性断裂。与模型组比较,拮抗剂组小鼠神经功能评分增加,mGluR1 mRNA、mGluR1和p-ERK1/2蛋白表达均有不同程度下调,神经细胞凋亡数目减少,脑组织形态学和超微结构损伤减轻。结论: (1)CVS后mGluR1的表达增强可通过激活ERK信号途径诱导神经细胞凋亡。(2)mGluR1选择性拮抗剂LY367385对CVS损伤具有拮抗作用。     

拟载脂蛋白E-1410 12肽对脑血管痉挛小鼠代谢型谷氨酸受体/细胞外信号调节激酶途径的调节作用

目的 探讨脑血管痉挛(CvS)后细胞外信号调节激酶(ERK)途径的作用机制,及重组载脂蛋白E( apoE)拟肽对脑血管痉挛损伤的保护作用. 方法 采用非开颅血管内线栓法制备小鼠蛛网膜下腔出血(SAH)并脑血管痉挛模型.将134只健康雄性ICR小鼠随机分为4组:假手术组、模型对照组、拮抗剂组,apoE治疗组.ApoE治疗组将拟apoE-1410以无菌磷酸盐缓冲液溶解后,经尾静脉注射0.6mg/kg,术前30min开始第1次,每12h1次.拮抗剂组于SAH后10 min侧脑室注射生理盐水或LY367385( 500nmol/L)5μl,术后行神经功能评分.分别在SAH后6、24、48h 3个时相点取脑组织标本,在光镜和电镜下观察脑组织病理变化,采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测各组代谢型谷氨酸受体1(mGluRl) mRNA的表达变化;免疫印迹法(Western blotting)检测mGluR1、磷酸化细胞外信号调节激酶(ERK1/2)蛋白的表达;用原位缺口末端标记法(TUNEL)检测神经细胞凋亡情况.结果 与假手术组比较,模型对照组小鼠神经功能评分显著降低,随脑血管痉挛时间延长,各组小鼠mGluR1 mRNA、mGluR1和磷酸化ERK1/2蛋白均有不同程度增加,凋亡细胞增多,神经细胞出现变性坏死、细胞器数量减少.与模型对照组比较,拮抗剂组和apoE治疗组小鼠神经功能评分增加,mGluR1 mRNA、mGluR1、磷酸化ERK 1/2蛋白表达均有不同程度下调,神经细胞凋亡数目减少,应用apoE1410拟肽减轻了脑组织形态学和超微结构损伤. 结论 脑血管痉挛后mGluR1的表达增强可通过激活ERK信号途径诱导神经细胞凋亡,apoE拟肽对脑血管痉挛损伤具有抗损坏作用.     

ERK1/2和PI3-K通路在蛛网膜下腔出血大鼠海马区对神经细胞自噬的调控作用

目的:探讨细胞外信号调节激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK1/2)和磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3-K)通路对大鼠蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)后神经细胞自噬的调控作用。方法:雄性SD大鼠160只,分为假手术(Sham)组、模型(SAH)组、ERK1/2抑制剂U0126组和PI3-K抑制剂LY294002组。采用二次注血法制作SAH大鼠模型,HE染色观察海马区神经细胞的形态变化;免疫组织化学染色法检测海马区磷酸化ERK1/2、PI3-K、自噬相关蛋白Beclin-1和微管相关蛋白1轻链(LC3)-II的表达实时荧光定量PCR检测海马区ERK1/2、PI3-K、自噬相关蛋白Beclin-1和微管相关蛋白LC3的表达。结果:SAH组海马区神经细胞存活率低于Sham组,ERK1/2、PI3-K、Beclin-1和LC3的表达水平高于Sham组(P0.05);U0126组和LY294002组海马区神经细胞存活率均高于SAH组,ERK1/2、PI3-K、Beclin-1和LC3表达均低于SAH组(P0.05);U0126组和LY294002组两组间海马区神经细胞存活率差异无统计学意义(P0.05),U0126组ERK1/2、Beclin-1和LC3表达水平低于LY294002组(P0.05),PI3-K表达水平高于LY294002组(P0.05)。结论:ERK1/2和PI3-K通路激活共同参与SAH后神经细胞自噬的调节,且以PI3-K通路更为主要。     

Changes of extracellular signal regulated kinase and caspase-8 expression in arteriae cerebri of mice with cerebral vasospasm model

目的:研究细胞外信号调节激酶(ERK)、半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-8(caspase-8)在脑血管痉挛(CVS)后早期脑损伤中的作用,并探讨ERK特异性抑制剂U0126通过此途径发挥作用的保护机制.方法:采用非开颅血管内穿线法制备小鼠蛛网膜下腔出血(SAH)并脑血管痉挛模型,给予U0126,术后行神经功能评分,分别在术后12、24、48 h3个时相点取右侧大脑动脉标本,应用免疫印迹检测各组磷酸化ERK1/2( p-ERK1/2)、caspase-8蛋白表达,TUNEL法检测大脑中动脉内皮细胞凋亡.结果:模型组小鼠神经功能评分降低,大脑中动脉出现严重脑血管痉挛,随脑血管痉挛时间延长,各组小鼠p-ERK1/2、caspase-8蛋白均有不同程度增强,凋亡细胞增多.与模型组比较,治疗组小鼠神经功能评分增加,各时相点3项指标的表达均不同程度下调.脑血管痉挛12～48 h p-ERK1/2与caspase-8呈正相关.结论:脑血管痉挛后,ERK表达增强可通过激活caspase-8信号途径诱导大脑动脉内皮细胞凋亡;U0126对脑血管痉挛具有一定的治疗作用,其机制之一可能是通过部分阻抑ERK通路活化,减少凋亡实现的.     

小鼠蛛网膜下腔出血后胰岛素与PI-3K/AKT信号通路的关系

观察胰岛素在小鼠蛛网膜下腔出血后神经元凋亡作用的影响,并进一步探讨其引起该作用的分子机制。健康雄性昆明小鼠,体质量28~32 g,清洁级(SPF),70只,随机分为三组:假手术组(Sham组),蛛网膜下腔出血+生理盐水组(SAH组),蛛网膜下腔出血+胰岛素组(Ins组),蛛网膜下腔出血+胰岛素+PD98059抑制剂组(PD组)。检测方法:(1)神经功能学检测,观察记录小鼠的精神状态、部分感觉和运动能力;(2)HE染色观察小鼠顶叶皮质神经元的形态学改变;(3)RT-PCR检测p-AKT、p-ERK的mRNA水平表达情况;(4)Western blot检测p-AKT、p-ERK的蛋白水平表达情况。结果表明:(1)神经功能学检测:与对照组比较,小鼠SAH后感觉和运动能力呈现不同程度障碍,综合得分明显下降;与SAH组比较,Ins组感觉和运动能力相对较好,综合得分有所上升。(2)HE染色观察:Sham组小鼠神经元排列相对整齐,形态较完整,核质均匀,核仁清晰;SAH组小鼠神经元损伤较重,部分细胞肿胀,排列紊乱,细胞周间隙增宽,部分细胞核固缩深染。(3)RT-PCR结果显示:与Sham组比较,SAH后6h p-AKT有所增加,同时p-ERK增加,与SAH组比较,Ins组p-AKT增加更显著,且p-AKT相对增加,与Ins组比较,PD组p-AKT明显减少,p-ERK明显减少,且与SAH组比较亦有统计学意义。(4)Western Blot结果显示p-AKT、p-ERK蛋白水平变化与mRNA水平一致。胰岛素可通过PI3K-Akt信号转导途径明显抑制小鼠蛛网膜下腔出血后神经元的凋亡,其中Akt激活以及ERK的增加是胰岛素上述抗凋亡效应的关键环节。     

GLYX-13 通过NR2B-ERK-CREB 信号通路改善氯胺酮麻醉后幼鼠认知 功能障碍

目的:探讨GLYX-13通过N-甲基-D-门冬氨酸受体2B(NR2B)-胞外信号调节激酶(ERK)-环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB)信号通路改善氯胺酮麻醉后幼鼠认知功能障碍。方法:将60只幼鼠根据随机数字法分为对照组(NS组)、氯胺酮麻醉组(Ket组)、氯胺酮麻醉+GLYX-13组(Ket+GLYX-13组),每组20只。Ket组和Ket+GLYX-13组小鼠每天腹腔注射30 mg/kg氯胺酮,间隔30 min重复一次,每天3次;Ket+GLYX-13组小鼠每天首次注射氯胺酮前2 h尾静脉注射1 mg/kg GLYX-13;NS组每天注射等量生理盐水,共5 d。水迷宫实验和旷场实验测定小鼠认知功能,Western blot法测定海马组织NR2B、ERK、磷酸化ERK(p-ERK)、CREB、p-CREB蛋白水平,免疫荧光法测定海马CA1区NR2B、p-ERK、p-CREB蛋白表达情况。结果:与NS组比较,Ket组和Ket+GLYX-13组小鼠逃避潜伏期延长(P0.05),穿越原平台象限次数和在原平台象限停留时间降低(P0.05),中心区停留时间均缩短(P0.05),海马组织NR2B、p-ERK、p-CREB蛋白水平降低(P0.05),海马CA1区NR2B、p-ERK、p-CREB荧光阳性信号强度降低(P0.05)。与Ket组比较,Ket+GLYX-13组小鼠逃避潜伏期缩短(P0.05),穿越原平台象限次数和在原平台象限停留时间升高(P0.05),中心区停留时间均延长(P0.05),海马组织NR2B、p-ERK、p-CREB蛋白水平升高(P0.05),海马CA1区NR2B、p-ERK、p-CREB荧光阳性信号强度升高(P0.05)。结论:GLYX-13通过激活NR2B-ERK-CREB信号通路改善氯胺酮麻醉后幼鼠认知功能障碍。     

Edaravone对大鼠脑创伤后ERK1/2信号通路及神经细胞凋亡的影响

目的 探讨Edaravone对脑创伤后ERK1/2信号通路及神经细胞凋亡的影响及其机制。方法 用Marmarou,s法建立SD大鼠中度弥漫性轴索损伤模型(n=120),随机分为3组: (1)假手术对照组(A 组, n=24 )、(2)创伤组(B组, n=48)、(3)Edaravone干预组(C组, n=48)。分别在伤后1、6、24、48和72 h 5个时相点收取脑组织标本,硫代巴比妥酸法检测大脑皮质中MDA含量;Western-blot法检测皮质区p-ERK1/2活性;免疫组化法检测p-ERK1/2、Bax 和bcl-2蛋白的表达;TUNEL法标记神经细胞凋亡数。计算机图像分析系统,进行定量分析。结果 与假手术组比较,创伤组中MDA含量（伤后6～72 h）、ERK1/2（p-ERK1/2）活性（伤后1～48h）、Bax/bcl-2比值（伤后6～48 h）及凋亡的神经细胞数目（伤后6～72 h）显著增高(p＜0.05); Edaravone干预显著缓解上述改变 (p＜0.05)。结论 Edaravone可减少脑创伤后的神经细胞凋亡,其机制与其可清除氧自由基、抑制ERK1/2通路活化有关。     

U0126对蛛网膜下腔出血小鼠细胞外信号调节激酶途径的调节作用

目的:研究细胞外信号调节激酶(ERK)、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-8(caspase-8)在蛛网膜下腔出血(SAH)后早期脑损伤中的作用,并探讨ERK特异性抑制剂U0126通过此途径发挥作用的保护机制。方法:采用稳定的非开颅血管内穿线法制备小鼠SAH模型,并于术前30 min经尾静脉给予U0126(0.1 mg/kg),分别在术后12、24、48 h 3个时相点取右侧大脑动脉标本,HE染色观察大脑动脉的形态改变,并检测大脑中动脉(MCA)的直径变化;应用免疫印迹法检测各组p-ERK1/2、caspase-8蛋白表达,TUNEL法检测MCA内皮细胞凋亡。结果:模型组小鼠MCA出现严重血管痉挛,直径减小,p-ERK1/2、caspase-8蛋白均有不同程度增强,凋亡细胞增多。与模型组比较,治疗组小鼠各时相点上述3项指标的表达均呈不同程度下调,MCA管径增加,脑血管痉挛缓解。SAH 12～48 h时p-ERK1/2与caspase-8的表达呈正相关。结论:SAH后ERK表达增强可通过激活caspase-8信号途径诱导大脑动脉内皮细胞凋亡;U0126可减少大脑动脉内皮细胞凋亡,其机制之一可能是通过阻抑ERK通路活化实现的。     

神经干细胞移植显著改善脑外伤小鼠的神经功能

目的探讨鼠源性神经干细胞(neural stem cells,NSCs)静脉移植对脑外伤小鼠海马的治疗作用。方法30只BALB/c小鼠随机分为3组,假手术组(10只)、脑外伤组(10只)和NSCs移植组(10只)。NSCs移植7d后,根据小鼠脑损伤NSS(Neurological Severity Score)评分系统进行评分。TUNEL法检测各组小鼠海马细胞凋亡情况。免疫组化和Westernblot检测各组小鼠海马半胱氨酸蛋白酶-3(cysteinyl aspirate specificproteinase3,caspase-3)蛋白的表达。结果NSCs移植7d后,NSS评分显示NSCs移植组的神经功能明显改善(<0.001)。TUNEL法检测结果发现,脑外伤组小鼠海马凋亡细胞百分数明显高于假手术组(<0.05),但经过NSCs移植后,凋亡率显著下降。免疫组化和Westernblot结果显示,脑外伤组小鼠海马caspase-3蛋白表达量明显高于假手术组(<0.05),但NSCs移植组小鼠海马caspase-3表达明显降低(<0.05)。结论静脉NSCs移植能PPPP够显著改善脑外伤小鼠的神经功能,其机制可能与降低caspase-3的表达有关。     

Edaravone对大鼠弥漫性脑创伤后ERK1/2通路的影响

为探讨Edaravone对脑创伤的保护机制,本研究观察了Edaravone对弥漫性脑创伤大鼠脑组织磷酸化细胞外信号调节激酶ERK1/2表达变化的影响。114只雄性SD大鼠,随机分为3组:(1)假手术对照组(A组,n=18),(2)创伤组(B组,n=48),(3)Edaravone治疗组(C组,n=48),采用Marmarou’s法建立大鼠弥漫性颅脑损伤模型。伤后1、3、6、24、48和72h,HE染色观察伤后皮质和海马区神经细胞组织形态变化,Western blot法、免疫组化法检测皮质和海马区p-ERK1/2的表达,术后24、48、72h对大鼠神经运动功能和综合运动能力评分。结果显示:光镜下,伤后6、24h即可见B组大脑皮质和海马区神经细胞胞体收缩呈三角形,胞浆嗜色性减弱,核皱缩浓染,细胞周围出现空隙,即神经细胞变性坏死改变,C组上述改变明显减轻;免疫组化与Western blot法结果显示,与A组比较,B组ERK1/2(即p-ERK1/2)活性在伤后1、3、6、24、48h显著增高(P<0.05);与B组比较,C组中p-ERK1/2在6、24及48h显著回降(P<0.05);神经功能与综合运动能力评分在B组中(8.73±1.4,63.8±27.7)明显低于A组(24.00±0.00,278.4±27.7),C组(17.36±1.63,117.6±20.9)显著回升(P<0.05)。本研究表明Edaravone可改善脑创伤后神经功能损伤,其机制与调节脑创伤后ERK1/2信号活化水平有关。     

Differential roles for mGluR1 and mGluR5 in the persistent prolongation of epileptiform bursts.

Transient activation of group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) with the selective agonist (S)-3,5-dihydroxyphenylglycine (DHPG) produces persistent prolongation of epileptiform bursts in guinea pig hippocampal slices, the maintenance of which can be reversibly suppressed with group I mGluR antagonists. To determine the relative roles of mGluR1 and mGluR5 in these group I mGluR-dependent induction and maintenance processes, subtype-selective antagonists were utilized. In the presence of picrotoxin, DHPG (50 microM, 20-45 min) converted interictal bursts into 1- to 3-s discharges that persisted for hours following washout of the mGluR agonist. 2-methyl-6-(phenylethynyl)-pyridine (MPEP, an mGluR5 antagonist; 25 microM) and (+)-2-methyl-4-carboxyphenylglycine (LY367385, an mGluR1 antagonist; 20-25 microM) each significantly suppressed the ongoing expression of the mGluR-induced prolonged bursts. However, LY367385 was more effective, reducing the burst prolongation by nearly 90%; MPEP only produced a 64% reduction in burst prolongation. Nevertheless, MPEP was more effective at preventing the induction of the burst prolongation; all 10 slices tested failed to express prolonged bursts both during and after co-application of DHPG with MPEP. Co-application of DHPG with LY367385, in contrast, resulted in significant burst prolongation (in 68% of slices tested) that was revealed on washout of the two agents. These results suggest that while both receptor subtypes participate in both the induction and maintenance of mGluR-mediated burst prolongation, mGluR1 activation plays a greater role in sustaining the expression of prolonged bursts, whereas mGluR5 activation may be a more critical contributor to the induction process underlying this type of epileptogenesis.     

活性氧和ERK1/2信号通路在缺氧大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖和凋亡中的作用

目的：研究缺氧状态下大鼠肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）内活性氧（ROS）水平的变化,ROS对细胞外信号调节激酶（ERK）1/2蛋白表达的影响以及ROS和ERK1/2在PASMCs增殖和凋亡关系失衡中的作用。方法: 原代培养正常大鼠PASMCs,选用第2-3代用于实验。分别在常氧及缺氧条件下用ROS清除剂tiron、ERK1/2抑制剂PD98059进行分组干预。通过NBT还原法和DCFH-DA荧光探针检测细胞内ROS,免疫荧光法检测磷酸化- ERK1/2（p-ERK1/2）蛋白表达,MTT比色法和增殖细胞核抗原（PCNA）蛋白的免疫细胞化学法检测细胞增殖,原位末端标记法（TUNEL）检测细胞凋亡。结果: (1)缺氧组细胞内ROS水平明显高于对照组（P<0.01）;(2)缺氧组的增殖活性与对照组相比显著增高（P<0.01）,而凋亡率显著降低（P<0.01）,使用tiron后能明显抑制缺氧诱导的细胞增殖（P<0.05）,而凋亡率却明显升高（P<0.01）;(3)缺氧组p-ERK1/2蛋白表达显著高于对照组（P<0.01）,使用tiron后缺氧诱导的p-ERK1/2表达被显著抑制（P<0.01）;(4)使用PD98059也能明显抑制缺氧诱导的细胞增殖（P<0.05）,而凋亡率也明显升高（P<0.01）,缺氧下同时使用PD98059和tiron与单用tiron相比,对细胞增殖和凋亡的影响均无明显差异（P>0.05）。结论: 缺氧时PASMCs中生成增多的ROS通过活化下游ERK1/2信号通路,促进PASMCs增殖并抑制凋亡,从而在缺氧性肺动脉重建过程中发挥重要作用。     

CSF1通过CSF1R/PLCG2/ERK/Nrf2信号通路减少缺氧缺血性脑病大鼠神经元凋亡

目的:探讨集落刺激因子1(CSF1)通过CSF1受体(CSF1R)减轻缺氧缺血性脑病(HIE)大鼠神经元凋亡的下游信号通路.方法:采用原代大鼠皮质神经元建立氧糖剥夺(OGD)神经元损伤模型,重组人CSF1(rh-CSF1)干预该模型,通过CCK-8和MTT检测细胞活力,测定LDH漏出,Western blot检测CSF...     

p53在蛛网膜下腔出血小鼠脑皮质的表达及其与PI3K/Akt信号通路的关系

目的 探讨p53蛋白在实验性蛛网膜下腔出血小鼠脑皮质的表达及其与PI3K/Akt信号通路的关系.方法 将72只小鼠随机平均分为3组,即假手术组(Sham组),蛛网膜下腔出血组(SAH组),抑制剂LY294002组(LY组).采用线栓法制备小鼠蛛网膜下腔出血模型,术后观测6个时相点:0h、3h、6h、9h、12h、24h...     

依达拉奉通过抑制细胞外信号调节激酶1/2信号通路减轻大鼠弥漫性脑创伤后神经细胞凋亡

目的:探讨依达拉奉对脑创伤后神经细胞凋亡的影响及其机制.方法:雄性SD大鼠随机分为对照组、创伤组、依达拉奉组,Marmarou's法建立弥漫性脑创伤模型.H-E染色观察皮质区神经细胞组织形态变化;免疫组织化学法和免疫印迹法检测磷酸化ERK1/2及Bax的表达;原位缺口末端标记法(TUNEL)检测神经细胞的凋亡,并对大鼠综合运动功能进行评定.结果:与对照组比较,创伤组中皮质区部分神经细胞出现变性坏死和凋亡的改变,磷酸化 ERK1/2(1、 6、 24、 48h)和Bax(6、 24、 48、 72h)表达水平增高;神经细胞凋亡数目(6、 24、 48、 72h)增多;大鼠综合运动能力评分下降.与创伤组比较,依达拉奉组中脑组织形态结构损伤程度、磷酸化ERK1/2和Bax表达、神经细胞凋亡数目显著下降;大鼠的运动功能评分升高.结论:依达拉奉通过抑制ERK1/2信号途径活化,进而抑制促凋亡蛋白Bax表达,减少神经细胞凋亡,发挥对弥漫性脑创伤的保护作用.     

The anti-apoptotic effect of PI3K-Akt signaling pathway after subarachnoid hemorrhage in rats

The serine-threonine kinase Akt plays an important role in survival pathways by inactivating downstream apoptogenic factors in many cell systems. In the following study, we investigated whether or not the activation of the Phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)-Akt pathway could reduce neuronal apoptosis following subarachnoid hemorrhage (SAH). Rats were randomly divided into 6 groups: control group, SAH group, SAH+ saline group, SAH+ vehicle group, SAH+ Insulin-like Growth Factor 1 (IGF-1) group, and SAH+Ly294002 (PI3K pathway inhibitor) group. All SAH animals were subjected to injection of autologous blood into the cisterna magna twice (on day 0 and on day 1). The administration was executed via cerebral ventricle 30 minutes before the induced SAH on day 0 and was continued every 24 hours for 72 hours. Whole brains were obtained on day 2. Phospho-Akt (pAkt) expression was analyzed by immunohistochemistry and western blotting. The neuronal apoptosis was evaluated by terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated uridine 5'-triphosphate-biotin nick end-labeling (TUNEL). We found that the PI3K-Akt pathway was activated in the brain after experimental SAH. Moreover, administration of IGF-1 significantly elevated pAkt expression and decreased the percentage of apoptotic neurons following SAH, while administration of Ly294002 suppressed pAkt expression and induced increased neuronal apoptosis following SAH. Taken as a whole, our results suggested that the activation of PI3K-Akt pathway could mediate the protective effect against neuronal apoptosis after SAH.