人正常软骨细胞和骨性关节炎软骨细胞体外培养对照研究

目的:对人正常软骨细胞和骨关节炎软骨细胞进行体外培养,并就其2组在传代过程中生物学特性变化进行比较和评价。方法:酶两步顺序消化法消化关节软骨分离细胞;体外传代培养观察细胞形态、生长,MTT法测定增殖,甲苯胺蓝和Ⅱ型胶原免疫组化染色,从蛋白和基因水平检测Ⅱ型胶原、蛋白多糖的变化,以及用流式细胞仪检测细胞凋亡。结果:①骨性关节炎软骨细胞形态似成纤维细胞,生长速度明显较正常软骨细胞慢。②MTT检测骨关节炎组2、4、6代软骨细胞增殖均低于正常组(P0.05),Ⅱ型胶原免疫组化和甲苯胺蓝O染色均较弱,传至第4代软骨细胞生物学特性基本消失。③2、4代骨关节炎软骨细胞凋亡率明显高于正常软骨细胞(P0.05)④各代骨性关节炎软骨细胞Ⅱ型胶原和蛋白多糖表达量都不如正常软骨细胞。结论:体外培养的人骨性关节炎软骨细胞符合软骨细胞退变的表现,能很好的为骨关节炎细胞水平的研究提供最佳实验对象。     

补肾方含药血清干预大鼠椎间盘软骨细胞miRNA的差异表达

目的筛选补肾方含药血清干预大鼠椎间盘软骨细胞后差异表达的miRNA,为补肾方治疗颈椎病提供可供选择的目标miRNA,以探讨其通过调控靶基因表达发挥治疗效应的机制。方法原代培养的大鼠椎间盘软骨细胞经Ⅱ型胶原酶免疫荧光染色和甲苯胺蓝染色鉴定后,分别用补肾方含药血清、空白血清干预椎间盘软骨细胞,在给定时间点收获细胞,抽提纯化总RNA,行miRNA芯片检测,通过芯片差异性分析,挑选差异表达4倍以上的miRNA行定量聚合酶链式反应(PCR)验证。结果二次酶消化法可简便高效培养大量原代椎间盘软骨细胞,所培养细胞具有典型的椎间盘软骨细胞形态和功能,Ⅱ型胶原酶免疫荧光染色和甲苯胺蓝染色均为阳性。补肾方含药血清干预组芯片数据分别与相应时间点的空白血清组芯片数据行组间比较后再行组内比较,与含药血清干预椎间盘软骨细胞1 d相比,干预3 d的共有121个2倍以上表达差异的miRNA,其中上调的53个,下调的68个。差异表达4倍以上的miRNA定量PCR结果与芯片数据一致。结论补肾方含药血清干预椎间盘软骨细胞获得了一套较为特异的miRNA,初步预测上调的miRNA可能通过靶向Opn、Col、Bcl212、Vdr、IGF-I、Mmp-13等基因在椎间盘营养代谢相关信号通路中发挥作用。     

四种中药对体外培养大鼠成骨细胞增殖分化功能的影响

目的:观察中药海螵蛸、骨碎补、三七、阿胶含药血清对体外培养大鼠成骨细胞增殖、分化功能的影响。方法:应用MTT法观察海螵蛸、骨碎补、三七、阿胶对体外培养成骨细胞增殖功能的影响,ELISA法观察海螵蛸、骨碎补、三七、阿胶对体外培养成骨细胞ALP含量的影响。结果:在成骨细胞的增殖方面,海螵蛸、三七含药血清对成骨细胞增殖有抑制作用,骨碎补、阿胶对成骨细胞增殖没有明显促进作用。在对成骨细胞内碱性磷酸酶(ALP)的作用方面,海螵蛸、骨碎补对体外培养大鼠成骨细胞内ALP的合成有抑制作用;三七没有明显作用;阿胶有明显的促进作用。结论:4种中药对体外培养大鼠成骨细胞增殖、分化功能的影响各不相同。海螵蛸对体外培养大鼠成骨细胞的增殖、分化功能有抑制作用;骨碎补对体外培养大鼠成骨细胞的增殖无明显作用,对其分化功能有抑制作用;三七对体外培养大鼠成骨细胞的增殖有抑制作用,对其分化功能作用不明显;阿胶对体外培养大鼠成骨细胞的增殖无促进作用,但能促进体外培养大鼠成骨细胞的分化功能。     

补肝肾方血清对体外培养大鼠软骨细胞的影响

目的观察补肝肾方血清对体外培养的SD大鼠软骨细胞增殖和总蛋白合成的影响.方法分别采用5%,10%,20%的补肝肾方血清和相应浓度的空白血清培养SD大鼠软骨细胞,用MTT法检测软骨细胞的增殖,用考马斯亮蓝测定法检测细胞总蛋白含量.结果补肝肾组与对照组比较,不同血清浓度下补肝肾组的软骨细胞OD值及总蛋白含量均高于对照组(P＜0.01或P＜0.05).结论 3种不同血清浓度下补肝肾方均有明显的促进体外软骨细胞增殖及蛋白合成的作用,且5%和10%含药血清作用较明显.     

大鼠前脂肪细胞的原代培养

目的:建立一种大鼠前脂肪细胞原代培养的方法,为科研实验提供原代大鼠脂肪细胞。方法:无菌取4周龄大鼠附睾的脂肪组织,采用酶消化法进行原代培养。倒置显微镜观察细胞的形态,经培养分化后,油红O染色进行细胞鉴定。结果:原代细胞培养的形态观察显示,细胞贴壁后为类圆形,3天后成梭形,培养2周后,胞内出现脂肪颗粒积聚,经过油红O染色,确定细胞分化成为脂肪细胞。结论:用4周龄大鼠附睾组织能培养出大鼠前脂肪细胞,并经过2周,自然分化成为脂肪细胞。     

大鼠毛囊干细胞体外培养及基因转染方法

目的：探讨大鼠毛囊干细胞体外培养和基因转染的方法.方法：采用组织块法分离、培养大鼠触须隆突部毛囊干细胞,经Ⅳ型胶原差速贴壁法纯化后,采用碱性磷酸酶染色和细胞免疫荧光染色进行细胞鉴定,测定细胞生长曲线,并分别采用脂质体和慢病毒质粒进行毛囊干细胞基因转染.结果：经两次Ⅳ型胶原贴壁筛选后,毛囊干细胞呈克隆性生长,具有典型的干细胞生物学特征,碱性磷酸酶染色阳性,角蛋白-15、整合素-α6和整合素-β1表达均为阳性.细胞生长曲线显示毛囊干细胞在接种后第3天时出现干细胞克隆;第5天和第6天时细胞处于对数生长期.脂质体介导的毛囊干细胞基因转染率为1.55％～17.21％,中位数9.63％;慢病毒介导的毛囊干细胞基因转染率为62.14％ ～79.42％,中位数71.52％.结论：采用组织块法分离、培养大鼠触须隆突部毛囊干细胞,经Ⅳ型胶原差速贴壁法纯化后,毛囊干细胞可保持较好的生长状态和较强的克隆形成能力,且慢病毒介导毛囊干细胞基因转染比脂质体转染更高效、稳定.     

生骨注射液对体外培养大鼠成骨细胞增殖和分化影响的实验研究

目的探讨生骨注射液对体外培养的大鼠成骨细胞增殖和分化的影响,及探讨生骨注射液促进骨折愈合的细胞机制。方法体外培养大鼠成骨细胞,应用MTT法、对硝基苯磷酸盐法观察生骨注射液对体外培养成骨细胞的增殖、ALP表达的影响。结果生骨注射液对成骨细胞具有明显的促增殖、分化作用。结论生骨注射液具有刺激体外培养成骨细胞增殖、分化的功能．这可能是生骨注射液促进骨折愈合的机制之一。     

大黄素对培养大鼠心肌细胞游离钙浓度的影响

采用新型荧光指示剂Ｆｕｒａ－２／ＡＭ观察大黄素对培养大鼠心肌细胞游离钙浓度的影响，结果大黄素（１８．５ｕｍｏｌ／Ｌ）对静息状态下心肌细胞游离钙浓度（［Ｃａ２＋］ｉ）无明显影响，但对ＣａＣｌ２所引起（［Ｃａ２＋〕ｉ）的增加则有明显的促进作用，而且这种作用的强弱与所加入ＣａＣｌ２的剂量相关，和对照组比较Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１。     

中药益气化瘀方对体外培养的大鼠颈椎间盘软骨细胞生物学功能的影响

为研究中药益气化瘀方对体外培养的大鼠颈椎间盘软骨细胞生物学功能的影响. 取健康10周龄SD大鼠70只,体重200±50g,雌雄各半,随机分为空白组(E)、芬必得组(D)、中药低剂量组(C)、中药中剂量组(B)、中药高剂量组(A),每组14只.定时、定量胃饲,4天后分别处死取血清,相同条件下制备益气化瘀方含药血清和对照血清,取体外培养的大鼠颈椎间盘软骨细胞进行实验研究,采用MTT法观察软骨细胞生长、增殖;流式细胞仪检测细胞凋亡率.结果显示不同中药浓度对培养的软骨细胞生长、增殖均有促进作用,以10%血清浓度高剂量含药血清组促进软骨细胞增殖的作用最为明显,与其他各组相比,有非常显著的差异(P<0.01).细胞周期分析,中药组能促进细胞DNA合成(S期),与对照组相比,有非常显著的差异(P<0.01).表明益气化瘀方具有促进大鼠颈椎间盘软骨细胞生长、增殖及促进细胞DNA合成的作用.     

补肾活血方对大鼠软骨细胞凋亡增殖及MMP-13水平的影响

目的:探讨补肾活血方对大鼠体外培养软骨细胞凋亡增殖及基质金属蛋白酶-13(MMP-13)水平的影响。方法:采用SD大鼠切取关节软骨进行软骨细胞的体外培养,应用甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组化染色进行鉴定。同步细胞后分为中药组、西药组和空白对照组分别处理。采用流式细胞仪进行细胞凋亡与增殖检测,采用放免法进行MMP-13水平检测。结果:成功进行了软骨细胞的培养及鉴定。流式细胞仪检测显示补肾活血方可减低软骨细胞的凋亡率,与空白对照组比较有显著性差异(P0.05),补肾活血方可促进细胞周期中G2与S期细胞比例,与空白组比较有非常显著性差异(P0.01)。补肾活血方还可以降低MMP-13水平,与空白组比较有显著性差异(P0.05)。结论:补肾活血方具有减少软骨细胞凋亡的作用,同时可以降低MMP-13水平。     

伸筋易骨法调控家兔软骨细胞增殖减轻软骨变性的实验研究

[目的]研究伸筋易骨法影响调控甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrP)促进兔软骨细胞增殖减轻软骨变性的作用。[方法]新西兰大耳白兔编号后随机分为正常组、假手术组、模型组、推拿组、玻璃酸钠组,每组各10只,改良Hulth法制备膝骨性关节炎(KOA)兔模型,推拿组采用伸筋易骨法治疗21 d,玻璃酸钠组采用关节腔玻璃酸钠注射治疗,每周1次,共治疗3周,取材后透射电镜观察细胞器情况,扫描电镜观察软骨组织表面的变性和修复情况,逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测PTHrP mRNA的表达。[结果]RT-PCR法检测各组软骨组织PTHrP mRNA的表达,假手术组与正常组PTHrP mRNA的表达经统计学比较,无统计学意义(P>0.05),模型组与正常组比较,具有统计学意义(P<0.05),推拿组、玻璃酸钠组与模型组比较,具有统计学意义(P<0.05),推拿组与玻璃酸钠组相比,无统计学意义(P>0.05),推拿组、玻璃酸钠组与正常组相比,具有统计学意义(P<0.05)。扫描电镜检查显示,模型组软骨表面垄沟样明暗带明显紊乱,胶原纤维裸露;推拿组和玻璃酸钠组软骨表面有纤维爬过,提示软骨修复。透射电镜观察显示,模型组软骨细胞形态肥大,粗面内质网形态异常,核膜上多个膜孔,线粒体消失,胶原纤维断裂;推拿组和玻璃酸钠组软骨细胞细胞形态结构基本正常,细胞内可见多个自噬小体。[结论]伸筋易骨法能够调控软骨合成代谢关键蛋白PTHrP的表达,减缓软骨变性,促进软骨修复,减轻KOA症状。     

辛伐他汀对骨关节炎模型软骨细胞保护作用的研究

目的通过体内和体外实验研究辛伐他汀对骨关节炎模型(OA)膝关节软骨细胞的保护作用。方法取30只6月龄雄性新西兰大白兔,随机分为假手术组(SHAM组,10只)、造模组(ACLT组,10只)和辛伐他汀组(ACLT+SIM组,10只),采用右膝关节前交叉韧带切断术(ACLT)制作骨关节炎模型,ACLT+SIM组每天予辛伐他汀10 mg/kg灌胃。实验持续8周,所有动物在最后一次灌胃的第2天处死。采用酶消化法提取右膝关节软骨细胞进行体外培养,另取SHAM组左侧关节软骨细胞进行IL-1β(10μg/L)诱导的单纯体外关节炎细胞模型制作并予以辛伐他汀(1×10-6mol/L)干扰,分别作为IL组及IL+SIM组。培养2周后提取所有细胞RNA,采用实时荧光定量PCR(Realtime RT-PCR)方法检测骨关节炎发生与保护相关的基因MMP-1、MMP-3、MMP-13a、ggrecan mRNA的表达,同时ELISA法检测细胞上清中及Western Blotting法检测细胞MMP-1的表达,15~19 d CCK-8法检测各组细胞增殖能力。结果体内部分:Aggrecan mRNA的表达在SIM+ACLT组、ACLT组均显著低于SHAM组,余检测mRNA的表达在SIM+ACLT组、ACLT组均显著高于SHAM组;MMP-1的表达在SIM+ACLT组、ACLT组均显著高于SHAM组;细胞增殖的检测结果IL+SIM组与IL组均显著低于SHAM组,余组间无差别。体外部分:IL+SIM组Aggrecan的mRNA表达显著高于IL组,余mRNA的表达在IL+SIM组显著低于IL组(P<0.05),ELISA、Western Blotting检测MMP-1蛋白量与此一致。IL+SIM组与IL组均显著低于SHAM组,但IL+SIM组与IL组无差别。结论口服辛伐他汀不能显著影响兔膝关节不稳定诱发的骨性关节炎模型关节软骨细胞中与骨关节炎发生及保护相关的部分基因的表达,体外给药则可以降低关节炎模型软骨细胞促进骨关节炎发生的相关基因MMPs的表达。辛伐他汀在体内体外均不能刺激软骨细胞的增殖。     

大鼠胸主动脉平滑肌细胞的培养与鉴定

目的改进大鼠血管平滑肌细胞（VSMC）的培莽方法。方法采用机械刮除、差异贴壁等手段进行组织贴块法原代培养,胰蛋白酶消化传代,并应用相差显微镜和即用型SABC免疫组化染色试剂盒对细胞进行形态学和免疫组化鉴定。结果镜下培养细胞呈典型的“谷-峰状”生长,免疫组化染色显示胞浆内α—actin阳性表达。结论拳法可获纯度高、结构和功能良好的VSMCs。     

四法联用中药胶囊对糖尿病大鼠胰岛A、B细胞的影响

目的:探讨四法联用中药复方降糖作用的机制。方法:以SD大鼠为对象,用链脲佐菌素(STZ)复制实验性糖尿病大鼠模型,应用免疫组化方法观察四法联用中药胶囊对糖尿病大鼠胰岛A、B细胞的影响。结果:四法联用中药胶囊对糖尿病大鼠胰岛A细胞无明显影响;给予四法联用中药胶囊4周后,治疗组大鼠胰岛B细胞与模型组比较体积较大,颗粒增多,胰岛内阳性细胞数量明显增多。结论:四法联用中药胶囊降糖作用机制可能在于其对损伤的胰岛B细胞有一定的修复作用。     

糖尿病大鼠高同型半胱氨酸血症模型研究

目的探讨糖尿病大鼠高同型半胱氨酸(hcy)血症模型的建立。方法SD大鼠禁食不禁水14~18 h后以60 mg/kg的剂量腹腔注射1%链脲佐菌素,72 h后断尾取血测随机血糖,血糖大于16.7 mmol/L者为糖尿病模型造模成功,将糖尿病大鼠筛选按血糖随机分为模型组和空白组,模型组以1%高蛋氨酸饲料喂养,正常组和空白组以普通饲料喂养,共计1个月。结果hcy水平各组间比较均有显著性差异(P<0.05)。结论给予链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠1%高蛋氨酸饲料喂养1个月可以诱发高蛋氨酸血症。     

猪的冠状动脉内皮细胞体外培养方法

目的:建立实验小型猪的冠状动脉内皮细胞体外培养方法。方法:冠状动脉血管块短暂酶消化后采用植块法进行培养。结果:植块培养2日细胞从植块中移出;培养6日植块周围细胞呈铺路石样特征,传代/纯化一次后5日细胞单层贴壁生长,融合成片。细胞因子Ⅷ免疫荧光检测内皮细胞表达阳性,纯度100%。结论:成功建立猪冠状动脉内皮细胞体外培养方法,此方法操作简单、快速,得到细胞纯度高。     

伸筋易骨矫形手法对兔膝关节软骨细胞代谢及Sox9表达的影响

[目的]探讨伸筋易骨矫形手法对兔膝关节软骨细胞代谢及Sox9表达的影响。[方法]将膝骨关节炎(KOA)模型兔随机分为3组,治疗组采用伸筋易骨矫形手法治疗,对照组采用关节腔注射玻璃酸钠治疗,模型组不做干预,同条件饲养,取材后分离膝骨关节软骨细胞体外培养,镜下观察并通过四甲基偶氮唑盐比色法(MMT)对比3组软骨细胞增殖情况;通过蛋白免疫印迹分析3组软骨细胞Sox9的表达变化。[结果]镜下观察治疗组、对照组关节软骨的增殖速度均快于空白组,其中治疗组增殖速度最快,MMT法检测治疗组软骨细胞增殖能力高于对照组(P0.05),蛋白免疫印迹分析显示治疗组Sox9表达高于对照组(P0.05)。[结论]伸筋易骨矫形手法具有提高软骨细胞增殖速度,增强软骨细胞增殖能力,同时该手法可以提高损伤软骨组织Sox9的表达水平,从而促进软骨细胞的合成代谢。     

一种药物注射剂类过敏反应高内涵检测方法的初步建立

类过敏反应是药物注射剂最常见的不良反应,但现有检测方法尚存在诸多不足。该研究采用荧光标记和高内涵筛选技术建立了一种类过敏反应体外检测方法,应用RBL-2H3细胞脱颗粒模型,以细胞膜特异荧光染料FM4-64标记细胞脱颗粒囊泡回收来确定阳性细胞数,以细胞核特异荧光染料Hochest 3334标记细胞核来确定细胞总数,从而计算药物刺激后的细胞脱颗粒率。为了考察高内涵检测方法可靠性,首先采用阳性药物Compound 48/80验证了高内涵检测方法与传统过敏介质β-氨基己糖苷酶释放和小鼠耳廓皮肤蓝染检测方法间一致性,结果显示高内涵检测方法与传统检测方法高度一致,且灵敏度高于传统检测方法;然后采用30批次临床报告过敏症状丹红注射液进一步验证高内涵检测方法的可靠性, 结果提示高内涵检测结果与临床报告高度一致,而且高内涵方法一定程度上能够克服注射液自身颜色干扰问题。可见,类过敏反应高内涵检测方法是一种灵敏、可靠、简便且可实现高通量筛选的新方法,适用于药物注射剂类过敏反应评价,能够为临床安全用药提供指导。     

高糖条件下牛视网膜毛细血管周细胞增殖与凋亡的研究

目的观察高糖对牛视网膜毛细血管周细胞(pericyte,PC)增殖和凋亡的影响。方法建立牛视网膜毛细血管周细胞体外培养模型,将传至第三代的周细胞用常规培养液制作细胞悬液、计数并接种于96孔培养板(或培养瓶)中,待细胞贴壁后,分组加入含不同葡萄糖浓度(5.5、10、20、30、40mmol/L)的DMEM培养液,分别培养2～8天后收集细胞。用MTT法、流式细胞仪(FCM)检测,研究高糖对周细胞的影响。结果①高糖10mmol/L培养4、6、8天组和高糖20、30L、40(mmol/L)培养2、4、6、8天组周细胞增殖均有明显抑制作用,其抑制率以40mmol/L、8天组最高(P<0.01)。②高糖10、20、30、40mmol/L培养2～8天均能促进周细胞的凋亡,其凋亡细胞数以40mmol/L、8天组最多(P<0.01)。结论①高糖对周细胞的增殖有明显抑制作用,高糖以剂量依赖性方式使周细胞减少,随着葡萄糖浓度升高和时间延长,周细胞形态学改变更明显,高糖对周细胞增殖的抑制率也增大。②高糖能促进周细胞凋亡,其凋亡百分率随糖浓度的增高和培养时间的延长而增加。     

川芎嗪对糖尿病大鼠视网膜毛细血管和细胞凋亡的影响

目的：观察川芎嗪（TMP）对糖尿病（DM）大鼠视网膜毛细血管和细胞凋亡的影响，探讨TMP治疗糖尿病视网膜病变（DR）的机制。方法：将链脲佐菌素诱发DM模型的36只大鼠随机分成单纯DM组和TMP治疗组（每组18只），同时设同批次同种属大鼠10只作为空白对照组，治疗组给予TMP治疗，单纯DM组和空白对照组不予治疗。各组大鼠取眼球作视网膜消化铺片，以TUNEL染色法标记凋亡细胞，用PAS染色显示毛细血管。同时，测量毛细血管面积密度和凋亡细胞密度。结果：与空白对照组相比，单纯DM组大鼠视网膜毛细血管面积密度和凋亡细胞密度均明显升高（P〈0．01）；TMP治疗组大鼠视网膜毛细血管面积密度和凋亡细胞密度较单纯DM组显著降低（P〈0．01），但仍高于空白对照组（P〈0．05）。结论：TMP对DR有一定的治疗作用，其机制可能是通过抑制毛细血管增生和细胞的凋亡。