“核转染”技术对树突状细胞功能的影响

目的:研究"核转染"方法对DC活率、细胞表面分子及细胞因子分泌水平的影响。方法:体外诱导单核细胞分化为DC后,通过"核转染"方法将p/IRES-EGFP质粒转染至细胞核内,同时设立未转染DC为对照组。应用台盼蓝染色计算转染后细胞的活率;荧光显微镜下观察转染效率;流式细胞术检测细胞表面分子CD80、CD83、CD86、HLA-DR及CD11c等的表达;ELISA法检测DC培养上清IL-12及TNFα-的分泌水平。结果:DC转染后随时间推移,细胞活率下降;荧光蛋白在转染后4小时即有表达,表达量逐渐增加,24小时转染效率为56%±12%,48小时转染效率为45%±15%;转染后细胞表面分子CD80、CD83及CD86表达随时间推移逐渐降低,CD11c及HLA-DR表达水平稳定;转染可诱导DC分泌IL-12及TNFα-水平增加。结论:"核转染"是一种有效的转染DC的方法,并可诱导DC分泌多种细胞因子。     

TGF-β1基因转染对大鼠树突状细胞生物学特性的影响

目的 研究转化生长因子β1(TGF-β1)基因转染对大鼠树突状细胞生物学特性的影响。方法 将TGF-β1基因导入体外培养的大鼠树突状细胞，经过G418筛选后，采用Western blot和水貂肺上皮细胞(Mv1)生长抑制试验，了解转染细胞TGF-β1的表达及其生物学活性。通过混合淋巴细胞反应，观察转染的树突状细胞对T淋巴细胞增殖的影响。结果 FGF-β1基因转染的树突状细胞可以分泌TGF-β1，而且具有特异性抑制Mv1增长的生物学活性。在混合淋巴细胞反应中，TGF-β1基因转染的树突状细胞对T淋巴细胞的增殖有抑制作用，而空载体pcDNA3对照组与未转染组的树突状细胞具有强烈的激发T细胞增殖的能力。结论 利用构建的TGF-β1表达质粒转染大鼠树突状细胞，转入的TGF-β1基因可以在树突状细胞内稳定表达，并且使树突状细胞的生物学特性发生相应的改变。     

转染HPV16E6基因人树突状细胞疫苗的制备及生物学特性

目的：制备来源于人外周血并转染HPV16E6基因的树突状细胞（DC）疫苗，检测其细胞形态、分子表型及诱导的免疫效应。方法：细胞因子扩增人外周血DC，Lipofectamine转染HPV16E6制备DC疫苗。动态形态学观察，免疫细胞化学及流式细胞术检测分子表达．体外诱导并测定CTL活性。结果：转染DC呈形态迥异的多突起状，其E6蛋白、CD80、CD86和CD83分子的表达率依次为47．3％、82．5％、79．8％和85．7％，诱导杀伤Caski细胞的活性明显高于对照组（P〈0．01）。结论：转染DC疫苗保持了功能成熟DC的形态特征，且内源性表达E6蛋白，能诱导高效的特异性抗肿瘤免疫应答。     

转化生长因子β1基因转染对大鼠骨髓树突状细胞免疫功能的影响

目的 研究人转化生长因子β1(TGFβ1)基因修饰对大鼠骨髓树突状细胞(DC)免疫功能的影响。方法 构建TGFβ1-pcDNA3质粒并转染未成熟DC。检测转染后DC的TGFβ1表达及其功能变化,输注1周后柃测TGFβ1-DC在受者脾和淋巴结的分布、T细胞凋亡水平及T细胞端粒酶表达。结果 TGFβ1-pcDNA3质粒转染DC能有效抑制DC的成熟和分化,并下调Dc的多种功能。TGFβ1基因转染不仅能降低DC对LPS的反应,同时抑制DC在MLR中刺激T细胞增殖的能力。TGFβ1-DC输注受者后,1周内可在脾和淋巴结内形成微嵌合,并有效诱导T细胞的凋亡,抑制T细胞端粒酶的活性和表达。结论 TGFβ1基因能有效抑制DC的多种功能,可用于诱导机体免疫耐受。     

转染人CTLA-4细胞的对树突状细胞B7分子表达的影响

从PHA活化的人外周血T细胞中抽提总RNA,经RT-PCR扩增出CTLA-4的全长基因,构建逆转录病毒载体pEGZ-Term/CTLA-4,经PCR及电泳鉴定后感染包装细胞293T。收集培养上清感染L929细胞。用Zeocin选择培养。经免疫荧光及流式细胞术进行筛选,获取稳定表达CTLA-4分子的细胞株CTLA-4/L929。将CTLA-4/L929经丝裂霉素处理后与体外细胞因子诱导的树突状细胞共同孵育。分别于24、48及72h,用直接免疫荧光法和流式细胞术分析树突状细胞B7-1和B7-2分子的表达。研究结果显示,构建的重组逆转录病毒载体pEGZ-Term/CTLA-4的PCR产物长约700 bp,与人CTLA-4基因的长度一致。经Zeocin选择及多次亚克隆化培养,CTLA-4基因转染细胞CTLA-4/L929稳定表达膜型CTLA-4分子。以其为刺激细胞与树突状细胞共同培养后,可明显下调树突状细胞B7-1的表达,但对B7-2的表达没有影响。本研究获得的CTLA-4基因转染细胞株,为进一步探讨CTLA-4及其配基分子在免疫应答中的作用与机制提供了手段。     

基因修饰树突状细胞诱导移植免疫耐受研究进展

在移植免疫反应中，树突状细胞(DC)作为专职抗原提呈细胞，既可活化T、B细胞生产免疫应答，同时某些类型DC由于缺乏共刺激分子或表达某些抑制性细胞因子而能诱导移植免疫耐受。针对DC提呈抗原及活化T、B细胞的多个环节，目前有许多策略将不同目的基因转染不同来源的DC，让其表达不同的表面分子或分泌免疫抑制因子，以诱导移植免疫耐受。     

RNA转染的树突状细胞疫苗及其在肿瘤治疗中的研究进展

树突状细胞（DC）是目前发现的功能最强的专职抗原提呈细胞（APC）,是机体免疫应答的主要启动者,在免疫应答的诱导中发挥关键作用,已成为肿瘤免疫治疗的新载体。近年来,人们发现转染肿瘤细胞的RNA制备的DC疫苗具有很多独特的优点,在肿瘤的治疗中占有重要的地位。     

K562细胞总RNA转染对人树突状细胞抗原提呈、成熟及功能影响的初步研究

探讨人的树突状细胞(dendriticcell,DC)体外经K562细胞株总RNA转染后,能否诱导出p210蛋白表达,并诱导特异性CTL,为DC疫苗的临床应用提供理论基础。自健康人浓缩白细胞制剂分离有黏附特性的单核细胞,经GM-CSF、IL-4培养5d后,获得未成熟的DC(imDC);体外以脂质体DOTAP或直接电穿孔转染K562细胞总RNA。抽提后即时以及转染24h后的DC内RNA进行RT-PCR检测,Westernblot分析p210蛋白表达,流式细胞仪检测,以及诱导CTL杀伤K562细胞功能检测等。结果显示,RT-PCR检测表明:DC经K562细胞总RNA转染后,细胞内出现Bcr-Abl的cDNA条带,24h后消失。Westernblot实验表明:转染24h后,开始表达p210特征性蛋白。与对照组相比,转染K562细胞总RNA的DC,在24h后CD80、CD83、CD86、HLA-DR等表面标志均不同程度表达增高,并可促进T细胞对K562的杀伤活性。该研究从多方面角度说明应用肿瘤总RNA负载DC来制备DC疫苗的可行性,提示改良的DC疫苗抗肿瘤可能的应用前景。     

脂质体介导质粒转染角朊细胞的影响因素

探讨利用脂质体介导真核表达质粒转染体外培养的人角朊细胞的最佳转染条件。体外分离培养正常人角朊细胞 ,培养至 6 0 %、70 %、80 %、90 %及 10 0 %融合时 ,应用不同浓度的LipofectAMINE包被真核表达质粒pCMV·SPORT β gal,分别转染 6、8、10、12及 2 4h。细胞经转染后再培养 48h ,行 β 半乳糖苷酶原位染色 ,镜下观察并计算阳性转染率。被转染的阳性细胞 ,可见质粒 β 半乳糖苷酶基因的良好表达 ;当细胞融合率为 80 %、90 % ,以12 5 μL/ 10 0 μL的LipofectAMINE包被 1 5 μg/ 10 0 μL的pCMV·SPORT β gal,转染时间为 8h的转染率最高 ,可分别达到 (31 35± 1 35 ) %、(32 32± 2 4) %。该实验说明LipofectAMINE可有效地介导真核表达质粒转染培养的人角朊细胞 ;转染率与细胞生长状态、脂质体包被质粒的浓度比例、及转染时间直接相关。     

常用病毒载体转染对树突状细胞的影响

树突状细胞是功能最强的抗原提呈细胞 ,在介导免疫应答和维持免疫耐受中起着极其重要的作用。用携带目的基因的病毒载体转染树突状细胞已广泛应用于抗肿瘤和诱导耐受等方面的治疗。但在病毒载体转染树突状细胞过程中 ,病毒本身常能影响树突状细胞作为抗原提呈细胞的功能。因此 ,了解各种病毒载体的特点和对树突状细胞产生影响的作用机制 ,并选用合适的病毒载体 ,成为针对 DCs进行基因治疗成功的关键     

腺病毒载体介导gfp基因在树突细胞的转导及其影响因素的分析

目的：研究腺病毒载体介导外源基因在人树突细胞转染的有效方法。方法：绿色荧光蛋白（gfp）报告基因重组腺病毒的构建采用直接连接法。人树突细胞的制备通过分离人外周血单核细胞，然后在体外经过诱导过程再生。结果：经腺病毒介导实现了gfp基因在树突细胞的转导和表达。病毒滴度对转导效率影响较大，只有使用高滴度（MOI〉100）的重组腺病毒才能获得较高的转导效率（40％以上）；脂质体和多聚赖氨酸可以明显提高转导效率（提高50％左右）。转导效率最高可达65％左右。结论：由腺病毒介导进行树突细胞的转基因需要较高的病毒滴度；脂质体和多聚赖氨酸可以提高基因的转导效率。     

老年大鼠组织mRNA分析中内参基因的选择

 目的 探讨用于老年大鼠组织基因mRNA表达分析的内参基因选择。方法 用实时反转录PCR技术评价5个管家基因3-磷酸甘油醛脱氢酶（G3pd）、?-肌动蛋白 (ACTB)、H3组氨酸3B（H3f3b）、酸性核糖体磷蛋白P0（Arbp）和18S核糖体RNA (18S)的表达水平。结果 老年大鼠肾组织中表达最稳定的是管家基因ACTB,心脏和肺组织中表达最稳定的是G3pd;而Arbp在不同组织之间的表达差异最小。结论 老年大鼠组织间基因表达mRNA分析应使用至少两个参照基因：一个是核糖体基因18S,另一个适合的内参基因是Arbp。     

绿色荧光蛋白转基因小鼠骨髓基质细胞体外诱导分化为神经元样细胞

目的 研究绿色荧光蛋白转基因小鼠骨髓基质细胞(GFP-GM-BMSCs)在体外无血清培养基+神经细胞因子诱导条件下,向神经细胞分化的能力。方法 用贴壁法体外培养GFP-GM-BMSCs,取第3代GFP-GM-BMSCs,用含浓度均为20μg/L的表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的无血清培养基（neurobasal-A+2%B27）诱导分化。第5天用免疫细胞荧光方法检测巢蛋白(nestin)的表达,第10天用神经元烯醇化酶 (NSE)、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫细胞化学方法鉴定阳性细胞。结果 GFP-GM-BMSCs经无血清培养基+神经细胞因子诱导后,细胞胞体变圆,伸出细长突起, 有的突起连接成网,呈神经元样形态。诱导第5天,nestin阳性表达的细胞为40.24%+5.09%;第10天,NSE阳性、GFAP阳性的细胞分别为36.43%+5.27%和49.73%+6.28%。 结论 GFP-GM-BMSCs在体外含EGF、bFGF的无血清培养基中,能分化成神经元样细胞。     

GFP共表达检测重组型Caspase-3对HeLa细胞凋亡的诱导作用

目的探讨由野生型人caspase-3大小亚基颠倒构建的重组型caspase-3的促细胞凋亡活性。方法用RT-PCR法获得人caspase-3基因。通过重组PCR进行改造,构建小亚基位于大亚基之前的两种重组型caspase-3基因,它们所对应的蛋白质的N端,分别带有或没有其自身识别的四肽序列。将上述基因克隆入绿色荧光蛋白(GFP)表达载体pIRES2-EGFP中,转染人HeLa细胞,在荧光显微镜和电镜下观察转染细胞的形态和结构。结果成功地获得了野生型caspase-3基因及两种重组型caspase-3基因。构建了重组型caspase-3基因的表达载体。转染HeLa细胞后,重组型caspase-3基因在细胞中得到表达,随后引起细胞荧光强度下降,生长状况变差甚至死亡。电镜观察显示,许多细胞呈现凋亡的典型特征。结论重组型caspase-3可促进HeLa细胞的凋亡。     

Loading of dendritic cells for immunotherapy

Dendritic cell therapy has been optimized a lot aiming to induce a strong and broad immune response in terms of the recognized epitopes by both CD8⁺ and CD4⁺ T cells and the use of the patients' complete unique set of HLA molecules. We here give an overview of our approach for antigen loading and maturation of dendritic cells and describe the consequences to evaluate the immune response after treatment as well as the Brussels experience in clinical trials.     

环孢素A受体在多发性硬化病人外周血单个核细胞中的表达

目的 通过对多发性硬化患者外周血单个核细胞中环孢素Ａ受体ｍＲＮＡ表达的研究，为临床采用环孢素Ａ辅助治疗该病提供一定的依据。方法 采用逆转录ＰＣＲ方法，结果经凝胶图像分析。结果 患者组即多发性硬化患者外周血单个细胞存在有ＣｙＰｍＲＮＡ的表达，与对照组相比较降低，尚无明显统计学差异（Ｐ〉０．０１）。结论 多发性硬化患者外周血单个核细胞中存在有ＣｙＰ，ＣｓＡ与细胞内的ＣｙＰ结合后是否产生生物活性还与其蛋     

Dopaminergic differentiation of grafted GFP transgenic neuroepithelial stem cells in the brain of a rat model of Parkinson's disease

Neuroepithelial stem cells (NEPs) possess multipotent potential for self-renewal and neuronal differentiation. Using green fluorescent protein (GFP) positive NEPs, we explored, firstly, the survival and differentiation of grafted NEPs in the host rat and, secondly, whether or not transplantation of NEPs is a feasible therapeutic option for treating Parkinson's disease. NEPs were harvested from the neural tube of enhanced GFP transgenic embryos. In culture, GFP(+) NEPs generated abundant neurospheres and differentiated into both neurons and glia. When stereotaxically transplanted into the 6-hydroxydopamine (6-OHDA)-lesioned striatum of rats, NEPs survived and tyrosine hydroxylase (TH)-positive cells were detected in the graft. Furthermore, these grafted GFP(+) NEPs significantly ameliorated Parkinsonian behavioral symptoms compared with controls which were treated only with normal saline. Our results suggest that transplanted NEPs accomplish dopaminergic differentiation may be used for treating Parkinson's disease.     

Distinct mRNA microarray profiles of tolerogenic dendritic cells

Dendritic cells are crucial to the activation as well as suppression of the immune response. Previous reports have illustrated that APC interacting with antigen-specific T suppressor cells become tolerogenic, inducing T helper anergy. To characterize the molecular changes occurring in tolerogenic APC, the mRNA profile of KG-1 dendritic cells exposed to allospecific T helper and T suppressor cells were analyzed. This study now provides evidence that immature dendritic cells stimulated by T suppressor cells differentiate into mature dendritic cells with a distinct phenotype. The identification of Ts induced pathways of dendritic cell differentiation is critical to the development of new therapeutic strategies.