小鼠白细胞介素12基因的钓取及其在COS-7细胞中的表达

目的 :钓取小鼠白细胞介素 12 (m IL- 12 ) p4 0和 p35c DNA并检测其在哺乳动物细胞 (COS- 7)中的表达。方法 :RT- PCR法从小鼠腹腔巨噬细胞 m RNA中扩增 p4 0和 p35亚基 ;脂质体Lipofect AMINE将质粒 p NG- m IL- 12转染至 COS- 7细胞 ,ELISA法检测不同时间 m IL- 12表达水平。结果 :1RT- PCR法扩增出特异的 p4 0和 p35亚基 ,p35亚基克隆至 p KS载体测序 ;2 EL ISA法检测转染 p NG- m IL- 12的 COS- 7细胞上清有 m IL- 12分泌。结论 :为进一步研究 m IL- 12的免疫调节机制及其抑瘤作用奠定了基础。     

重组人白细胞介素12基因在COS—7细胞的高效表达

将分别含有重组人ＩＬ－２（ｒｈＩＬ－１２）两个亚单位ｃＤＮＡ的高效真核细胞表达载体，通过ＤＥＡＥ－Ｄｅｘｔｒａｎ改良方法，共转染到ＣＯＳ－７细胞中，结果高效表达了ｒｈＩＬ－１２蛋白，表达量为６００Ｕ／ｍｌ；并研究其对ＰＢＭＣ的促增殖作用和增加ＮＫ细胞毒活性的作用，为进一步研究ＩＬ－１２的生物学功能奠定了基础。     

阳离子脂质体介导的hIL-12基因在COS-7细胞中的表达

目的 观察hIL-12基因在COS-7细胞中的表达。方法 阳离子脂质体Lipofectamine^TM 2000将质粒pCA13-hIL-12转入COS-7细胞,PCR法检测基因转染,ELISA法检测hIL-12的表达。结果 hIL-12基因成功导入COS-7细胞,并且在COS-7细胞中获得表达。结论hIL-12可以在COS-7细胞中获得表达。     

葡萄糖激酶基因真核表达载体构建及在COS-7细胞中的表达

目的构建葡萄糖激酶（GK）基因真核表达载体并于COS-7细胞内表达，为体外构建具有葡萄糖刺激性胰岛素分泌能力的基因工程细胞奠定基础。方法质粒pCMV4-GKZ1以EcoRI、BamHI双酶切，获得GK cDNA，与同样酶切的pcDNA3．1载体连接，建成重组载体pcDNA3．1-GKZ1，经酶切与测序鉴定。Lipofectamine2000介导pcDNA3．1-GKZ1转COS-7细胞。分别以RT—PCR及Western-blot对COS-7／GKZ1细胞中GKZ1基因的转录及表达进行检测。结果构建的pcDNA3．1-GKZ1重组载体经酶切有1450bp的GKZ1 cDNA，序列经测序证实。COS-7／GKZ1细胞RT—PCR扩增出498bp的目的片段，Western—blot可见54kDa的特异性条带，而COS-7／pcDNA3．1细胞上述各项检测结果均为阴性。结论成功构建GK基因真核表达载体pcDNA3．1-GKZ1，并于COS-7细胞中成功转录与表达。     

人NKG2D真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的瞬时表达

目的：构建人NKG2D重组真核表达载体，并研究其在COS-7细胞中的表达。方法：应用RT-PCR，自健康人外周血单个核细胞(PBMC)中获取NKG2D cDNA，应用基因重组技术构建含目的基因的T载体克隆后，构建含目的基因的真核细胞表达质粒，并经酶切和测序证实。然后应用脂质体介导将重组真核表达质粒转染COS-7细胞．用RT-PCR和流式细胞术(FCM)检测转染细胞NKG2D表达。结果：重组真核表达载体中插入片段序列与GeneBank登录的cDNA序列一致。NKG2D在COS-7细胞中获得表达。结论：成功地构建了重组表达栽体pcDNA3．1-NKG2D，并实现了在COS-7细胞中的瞬时表达，为研究NKG2D的生物学活性奠定了基础。     

人DcR3 cDNA克隆及其在COS-7细胞中的表达

目的 克隆人DcR3分子的cDNA,将其重组入真核表达载体,并表达于COS-7细胞.方法 以PCR方法克隆编码人DcR3分子的cDNA,对其序列进行测定.将测序正确的DcR3 cDNA克隆入真核表达载体pAAV-IRES-hrGFP,构建重组表达载体.采用脂质体法转染COS-7细胞,用Western blot检测和激光共聚焦检测重组DcR3分子在COS-7细胞中的表达.结果 PCR方法扩增出一1 000 bp左右的基因片段,插入pAAV-IRES-hrGFP构建重组表达载体后,经序列测定证实扩增的片段为人DcR3分子cDNA.将重组子转染COS-7细胞,Western blotting和激光共聚焦检测到DcR3分子的表达.结论 成功地克隆并在COS-7细胞中表达了DcR3分子.     

重组人白细胞介素12基因在COS－7细胞的高效表达

将分别含有重组人ＩＬ－１２（ｒｈＩＬ－１２）两个亚单位ｃＤＮＡ的高效真核细胞表达载体，通过ＤＥＡＥ－Ｄｅｘｔｒａｎ改良方法，共转染至ＣＯＳ－７细胞中。结果高效表达了ｒｈＩＬ－１２蛋白，表达量为６００Ｕ／ｍｌ；并研究其对人ＰＢＭＣ的促增殖作用和增加ＮＫ细胞毒活性的作用，为进一步研究ＩＬ－１２的生物学功能奠定了基础。     

人NKG2D真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的瞬时表达

目的 :构建人NKG2D重组真核表达载体 ,并研究其在COS 7细胞中的表达。方法 :应用RT PCR ,自健康人外周血单个核细胞 (PBMC)中获取NKG2DcDNA ,应用基因重组技术构建含目的基因的T载体克隆后 ,构建含目的基因的真核细胞表达质粒 ,并经酶切和测序证实。然后应用脂质体介导将重组真核表达质粒转染COS 7细胞 ,用RT PCR和流式细胞术 (FCM)检测转染细胞NKG2D表达。结果 :重组真核表达载体中插入片段序列与GeneBank登录的cDNA序列一致。NKG2D在COS 7细胞中获得表达。结论 :成功地构建了重组表达载体pcD NA3.1 NKG2D ,并实现了在COS 7细胞中的瞬时表达 ,为研究NKG2D的生物学活性奠定了基础。     

大鼠GAP-43基因的克隆及其在COS-7细胞的表达

目的: 克隆大鼠GAP-43基因,构建其真核表达载体,并观察其在哺乳动物细胞COS-7中的表达。方法: 采用RT-PCR方法,以大鼠少突胶质前体细胞RNA为模板,扩增GAP-43基因,定向克隆到pEGFP-N3载体中。以LipofectamineTM 2000试剂转染pEGFP-N3-GAP-43表达载体至COS-7细胞中进行瞬时真核表达。以免疫荧光方法鉴定GAP-43的表达。结果: 从大鼠少突胶质前体细胞中克隆到序列正确的GAP-43全长编码序列。所构建的GAP-43质粒在COS-7细胞中获得高效表达。结论: 大鼠GAP-43基因的克隆、真核表达载体的构建及在COS-7中的表达获得成功,为进一步研究其功能,尤其是探讨其在少突胶质细胞发育中的作用奠定了基础。     

小鼠白细胞介素12研究新进展

小鼠白细胞介素１２研究新进展刘锰综述郑珊珊审阅（中国医学科学院基础医学研究所免疫学研究室，北京）白细胞介素１２（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ１２，ＩＬ－１２），又称天然杀伤细胞刺激因子（ＮａｔｕｒａｌＫｉ－ｌｌｅｒＣｅｌｌＳｔｉｍｕｌａｔｏｒｙＦａｃｔｏｒ...     

重组CD200基因在COS-7细胞中的瞬时表达

目的研究构建于重组真核表达载体pcDNA3-CD200上的CD200基因在COS-7细胞中的瞬时表达。方法体外扩增并酶切鉴定pcDNA3-CD200质粒；常规方法培养COS-7细胞；用电转染基因法将pcDNA3-CD200质粒转入COS-7细胞中，用流式细胞术（FCM）检测转染细胞CD200表达。结果转染COS-7细胞后72h，CD200基因表达阳性的细胞计数率为44．5％。结论成功的利用电转染基因法将重组真核表达载体pcDNA3-CD200转染到COS-7细胞中，并实现了在COS-7细胞中的瞬时表达，为进一步研究CD200的生物学活性以及信号传导奠定了基础。     

重组人白细胞介素-12在昆虫细胞中的表达

采用含hIL－12P35和P40两个亚基基因的重组质粒ρ2Bac－hIL－12ρ35ρ40与野生型林状病毒通过Lipofectin膜融合法进行同源重组，产生的重组杆状病毒感染培养的昆虫细胞Sf9和Sf21，进行重组蛋白的表达。用rhIL－12酶标试剂盒检测，证实rhIL－12的表达峰值约为5mg／L．SDS－PAGE显示2条重组蛋白条带．分子量约为87ku和40ku。PHA淋巴母细胞增殖试驻显示．重组蛋白对淋巴母细胞有一定的增殖能力，并对IL－2的增殖作用有相加性的增强效应。     

鼠白细胞介素-12双亚基共表达质粒的构建及在体内外的表达

目的：构建双亚基共表达鼠白细胞介素－12（mIL-12）真核表达质粒，并观察其在体内外的表达。方法：将mIL-12p35和p40全长编码cDNA构建在pcDNA3.1载体上，然后把p35表达单元（CMV－p35－BGHPA）插入pcDNA3.1/p40载体，使两个目的基因均受各自的启动子CMV控制，构建成mIL-12双亚基共表达质粒pCmIL-12，并进行体内外表达。结果：pCmIL-12在体外转染COS－7细胞后，经ELISA证实有mIL-12表达，其表达上清能在体外明显增强小鼠NK细胞活性。小鼠皮内注射pCmIL-12亦能增强小鼠NK细胞活性。结论：所构建的质粒在体内外均能表达有生物学活性的mIL-12。     

小鼠白细胞介素-12基因在乳酸乳球菌中的表达

目的 在乳酸乳球菌中表达小鼠白细胞介素-12基因.方法 用Nsi Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切pGEM-IL-12质粒后,与经同样酶切的含有乳链杆菌肽A(nisA)启动子的pSEC-E7质粒连接,从而构建成pSEC-IL-12质粒;经电击转化,将重组质粒转入乳酸乳球菌NZ9000中,转化子在含有氯霉素的脑心浸液培养基上培养.用乳链杆菌肽(nisin)诱导白细胞介素-12表达,SDS-PAGE、Western blot鉴定表达产物;用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测IL-12的量.结果 建立了白细胞介素-12乳酸菌基因表达系统.在nisin的诱导下,NZ9000能够产生并分泌白细胞介素-12约80 ng/L.结论 乳酸乳球菌能够表达一定数量的小鼠白细胞介素-12.     

猪白细胞介素12 p35、p40亚基基因的克隆和序列分析

目的:克隆猪白细胞介素(IL)-12p35、p40亚基基因,为制备猪囊尾蚴的复合基因疫苗奠定基础。方法:分别分离成年猪的外周血单个核细胞和脾细胞,培养10h后用IFN-γ(100ng/ml)刺激增殖12h,随后加入细菌脂多糖(1μg/ml)刺激培养3h,分别收集细胞并提取细胞总RNA,用RT-PCR方法扩增猪IL-12p35、p40cDNA编码基因,克隆至pMD18-T载体,经PCR和双酶切鉴定后进行序列测定。结果:猪IL-12p35、p40cDNAPCR产物电泳结果证明所克隆的基因分别为616bp和1011bp,基因测序结果与GenBank报道的基因序列各有一个碱基差异,但编码氨基酸无差异,证实分别为猪IL-12p35、p40cDNA编码基因。结论:成功克隆了猪IL-12p35、p40cDNA编码基因。     

真核表达质粒pDisplay-hGITRaa1-165构建及其在COS-7细胞中的表达

目的:构建含有人GITR胞外段的真核表达质粒pDisplay-hGITRaa1-165,并检测其在真核细胞内的表达。方法:将带有信号肽的GITR基因片段克隆至真核表达载体pDisplay,经酶切鉴定及测序分析,脂质体介导法转染COS-7细胞,通过蛋白质印迹法检测其在COS-7细胞内的表达水平。结果:所构建的真核表达质粒pDisplay-hGI-TRaa1-165转染COS-7细胞后,在其培养上清中检测到目的蛋白的表达。结论:成功表达pDisplay-hGITRaa1-165蛋白,为GITR的生物学功能研究奠定了基础。     

内皮素1串联体的构建及其在COS-7细胞中的表达鉴定

目的:克隆、表达内皮素1(endothlin1,ET1)串联体,提高ET1的免疫原性及其免疫机体后产生抗体的效价.方法:通过pGEX-4T-1载体对ETl的基因进行了串联,并在ETl串联基因下游引入GM-CSF基因,酶切鉴定及序列分析构建重组质粒;再将含有ETI串体与GM-CSF的融合基因连接至真核表达载体pcDNA3.1( )中,同样经过酶切鉴定及序列测定证实;并对构建表达载体转染COS-7细胞,应用间接免疫荧光法及ELISA检测表明目的基因在COS-7细胞中的表达情况.结果:正确构建了ET1重复序列4串体基因与GM-CSF基因重组的克隆载体pGEX-ET1④-GM-CSF以及真核共表达质粒pcDNA3.1-ET1④-GM-CSF;间接免疫荧光法及ELISA检测表明目的基因ETI和GM-CSF在COS-7细胞中都得到了表达.结论:内皮素1串联体的构建及其在COS-7细胞中的成功表达将对ET1的免疫学特性、核酸疫苗的研制以及相关自身疾病免疫治疗的进一步研究奠定基础.     

白细胞介素-24及白细胞介素-12基因治疗小鼠黑色素瘤实验研究

[目的]研究重组质粒pEGFP-N1-白细胞介素(IL)-24基因及pGEG-IL-12基因单独应用与联合应用对小鼠黑色素瘤移植瘤的抑制作用及其机制.[方法]制备黑色素瘤B16细胞荷瘤小鼠模型,并随机分为5个组,分别向瘤体内注射给予脂质体包裹的基因重组质粒pEGFP-N1-IL-24(IL-24组),pEGFP-N1-IL-24和pGEG-IL-12(联合应用组),pGEG-IL-12(IL-12组),pEGFP-N1(空质粒组)及PBS(PBS组).每次给药前测量小鼠背部肿瘤的长径和短径,绘制肿瘤生长曲线.采用HE染色法观察各组肿瘤组织形态;RT-PCR法检测移植瘤组织中IL-24,IL-12,Bax,Bcl-2,VEGF,caspase-3及caspase-12mRNA的表达;Western Blot检测移植瘤组织中Bax,Bcl-2,VEGF,caspase-3及caspase-12蛋白的表达.[结果]肿瘤生长曲线观察结果表明,IL-24组、IL-12组及联合应用组肿瘤体积均明显小于空质粒组和PBS组(P<0.05),联合应用组肿瘤体积最小(P<0.05).HE染色结果显示,空质粒组多数细胞生长差,形态不规则,细胞皱缩,结构稀疏,细胞核溶解、变形,细胞成片坏死.RT-PCR检测结果表明,IL-24组和IL-12组分别有IL-24和IL-12基因mRNA表达,联合应用组同时有IL-24和IL-12基因mRNA表达,而空质粒组和PBS组均未见表达;IL-24组、IL-12组及联合应用组Bax基因mRNA表达水平均明显高于空质粒组和PBS组(P<0.05),联合应用组Bax基因mRNA的表达水平最高,而Bcl-2和VEGF基因mRNA的表达水平则显著降低(P<0.05).Western Blot检测结果表明,IL-24组、IL-12组及联合应用组Bax,caspase-3,caspase-12蛋白的表达水平均明显高于空质粒组和PBS组(P<0.05),联合应用组中Bax,caspase-3,caspase-12蛋白的表达水平最高,而Bcl-2和VEGF蛋白的表达水平则显著降低(P<0.05).[结论]IL-24和IL-12对荷瘤小鼠有治疗作用,二者联合应用治疗效果更强.     

白细胞介素—2的基因克隆及其在啤酒酵母细胞中的表达

用ＰＣＲ方法从白细胞介素－２（ＩＬ－２）ｃＤＮＡ全序列中扩增成熟肽基因片段，酵母中间载体ＰＳＫ４３ＳＢ融合后，重组于酵母游离型表达载体ＹＥＰＨＣ８，获得了高效表达，并对其糖基化进行了研究。     

mIL-12基因转染促进小鼠树突状细胞混合淋巴细胞反应

目的 观察ｍＩＬ－１２基因转染的小鼠树突状细胞（ＤＣ）功能的改变。方法 分离小鼠骨髓单个核细胞与ｒｍＧＭ－ＣＳＦ和ｒｍＩＬ－４培养１周,对培养的细胞进行形态学观察,ＦＡＣＳ检测细胞表面ＤＥＣ２０５、ＣＤ８６表达。以ｍＩＬ－１２重组腺病志染培养的ＤＣ,ＥＬＩＳＡ测定培养上清中ｍＩＬ－１２的水平。混合淋巴细胞反应检测转染细胞的功能。结果培养１周后,得到具有典型ＤＣ形态的细胞,以ｍＩＬ－１２重组腺病毒为