全骨髓法分离培养骨髓间充质干细胞及向神经样细胞分化的研究

目的目前尚缺乏标准的骨髓间充质干细胞（BMSCs）的分离方法,实验通过全骨髓培养法分离纯化骨髓间充质干细胞,并诱导分化为神经样细胞,以寻找一种简便、实用的分离方法。方法取大鼠骨髓,全骨髓培养法结合差速贴壁法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,传代扩增。倒置相差显微镜下观察骨髓间充质干细胞形态及生物学特点,免疫组化染色鉴定细胞。用MTT法间接测定不同代数细胞活力。诱导分化,先用碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）预诱导24h,然后加入丁羟基茴香醚诱导（BHA）和二甲基亚砜（DMSO）诱导。观察诱导过程中细胞的形态变化,并用免疫组化染色法鉴定细胞。结果全骨髓培养法成功分离培养BMSCs,免疫荧光染色示CD90、CD71、CD106表达阳性,CD45阴性。MTT法检测细胞活力示2、4、6代细胞于酶标仪490nm波长处吸光度值均高于第8、10代细胞。细胞经诱导后,细胞呈神经样细胞形态,并且神经元特异性表面标志β微管蛋白（β-Ⅲ-Tubulin）、巢蛋白（Nestin）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）表达阳性。结论采用全骨髓培养法可获得较纯化的骨髓间充质干细胞,其在适宜的诱导分化条件下可诱导分化为神经样细胞。     

红细胞生成素(EPO)对脑源性神经干细胞增殖与分化的调控作用

目的探讨红细胞生成素(EPO)对大鼠海马神经干细胞(NSCs)体外增殖和分化的影响。方法利用无血清培养、单细胞克隆技术,体外培养SD大鼠海马组织源NSCs,在NSCs增殖和分化过程中添加不同剂量EPO,以免疫细胞化学方法对NSCs及其分化后的细胞进行鉴定。结果与对照组相比,不同接种密度条件下的NSCs加入EPO后,增殖期表达Nestin的细胞增加2～4倍,分化期表达Nestin的细胞数明显减少;表达Tuj1和GFAP的细胞出现早,且Tuj1阳性细胞较对照组明显增加(P<0.05),加入antiEPO后Tuj1阳性细胞较对照组明显减少(P<0.01);相同细胞接种密度下,添加不同剂量EPO后Tuj1阳性细胞数呈剂量依赖性增加。结论EPO可促进大鼠海马源NSCs的增殖,并使其呈剂量依赖性的向神经元分化。     

人神经干细胞在宿主鼠脑内分化成神经元呈脑位点特征

目的研究人胎脑神经干细胞植入年幼大鼠脑后的成神经元分化作用,探讨神经干细胞替代治疗小儿脑病的可行性。方法自孕16周的胎脑组织分离培养出神经干细胞球,在小儿脑脊液中培养诱导分化以证明其分化潜能。将培养14d的神经干细胞球移植10d龄鼠的侧脑室内,于移植后第4、7、14天杀鼠取脑,切片,行人神经丝特异性标志的免疫荧光分析,显示神经元的分布和细胞形态。结果培养获得典型神经干细胞球,呈漂浮生长,在小儿脑脊液中能分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。用抗人神经丝混合单抗检测移植物的成神经元分化,移植后的第4天,观察到阳性反应细胞在颗粒层表现为颗粒性细胞,锥体细胞层则出现长突起的锥体细胞,还有连接神经元样中间神经元,小脑内有单层排列的浦肯野细胞。对比各时间点的观察结果,阳性细胞分布位置未变。随着移植后天数的后延,阳性细胞数量呈减少趋势,但锥体细胞的突起明显加长。结论体外培养获得的人神经干细胞脑室途径移植年幼大鼠,在脑内发生迁移,并分化成形态上与其临近宿主细胞一致的神经元。提示宿主脑组织局部微环境在引导移植物分化成神经元中发挥了重要作用。     

脑创伤程度对大鼠伤后胚胎神经干细胞移植的影响

目的 探讨不同程度创伤性脑损伤(traumatic brain injury,TBI)对伤后胚胎神经干细胞(neural stem cells,NSCs)移植的影响. 方法 从孕12～ 14 d胚胎大鼠海马组织中分离NSCs,采用无血清培养法,进行体外培养、扩增和鉴定.大鼠分别于轻型、中型TBI后3d行胚胎NSCs双侧海马区移植;细胞移植14 d后行组织学和TUNEL检测,并对BrdU、NSE、GFAP、GalC、NGF、BDNF蛋白行免疫组化检测. 结果 移植治疗后14 d,轻型TBI组双侧海马区Brdu阳性细胞数明显多于中型TBI组.移植胚胎NSCs脑内分化以GFAP阳性胶质细胞为主.轻、中型TBI后NGF和BDNF蛋白阳性表达增加,其中以轻型TBI组表达最为显著. 结论 轻型和中型TBI对NSCs移植的影响与伤后脑组织局部微环境因素的改变密切相关.     

脑皮层创伤灶注射法移植神经干细胞的实验研究

目的观察食蟹猴自体骨髓源神经干细胞（NSCs）移植到皮层创伤灶内的存活、生长情况。方法取骨髓分离、纯化骨髓基质细胞，培养诱导成NSCs，Nestin染色阳性说明具备NSCs特征。再加入细胞标记物BrdU进行共培养7d待移植之用。移植前将BrdU标记的NSCs收集、离心，制成干细胞悬液。食蟹猴分即时移植和延迟移植组，用微量注射针将NSCs悬液注入到猴脑皮质损伤灶及创面周边脑皮层，移植后1，3，6个月各灌杀2只食蟹猴，做移植区组织切片染色检查。结果即时移植组和延迟移植组都可观察到脑皮层创伤灶内有BrdU标记阳性细胞，而假移植组织切片中则未见BrdU阳性细胞。移植后1，3，6个月染色可见移植细胞早期呈簇状分布，移植后6个月在移植区邻近的脑白质内也可观察到有BrdU阳性细胞，正电子发射电子计算机断层扫描（PET）检查显示移植NSCs后创伤区域脑组织葡萄糖代谢有所恢复。结论移植的骨髓源性NSCs在脑内有存活，并向邻近区域迁移，有助于创伤脑组织修复。     

VEGF、bFGF联合应用对胎鼠大脑皮质神经干细胞分化的影响

目的观察血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)联合应用对胎鼠大脑皮质神经干细胞(NSCs)分化的影响。方法取孕14dSD大鼠,收集胎鼠大脑皮质NSCs,采用无血清培养基传代培养,取P3代细胞,分别加入200μg/LVEGF和(或)20μg/LbFGF进行诱导分化,并设对照组(不加VEGF和bFGF),7d后采用免疫细胞化学方法检测巢蛋白(Nestin)、β微管蛋白-Ⅲ(β-tubulin-Ⅲ)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达情况。结果从胎鼠大脑皮质中分离的细胞在体外悬浮生长,形成致密的球形细胞团,传代后能形成新的细胞球,免疫细胞化学染色显示细胞球nestin表达阳性。诱导分化后的细胞部分表达β-tubulin-Ⅲ,部分表达GFAP。与对照组比较,VEGF和(或)bFGF均可使NSCs向神经元方向分化的比例增加,其中VEGF+bFGF联合作用后NSCs的β-tubulin-Ⅲ阳性率(80.3%)最高,GFAP阳性率(18.6%)最低。bFGF作用后NSCs的β-tubulin-Ⅲ阳性率(60.4%)和GFAP阳性率(38.5%)与VEGF作用后(分别为60.3%、38.7%)比...     

骨髓间充质干细胞移植治疗成鼠脊髓损伤的研究

目的:研究骨髓间充质干细胞移植治疗成鼠脊髓损伤的可行性。方法:选取成年雌性SD大鼠32只,2只用以提取骨髓间充质干细胞,其余大鼠随机分为细胞移植组、PBS缓冲液组及空白对照组。骨髓间充质干细胞分离传代培养后Hoechst33342标记,损伤1周后采取局部注射移植于大鼠脊髓损伤区,移植6周后用免疫荧光法检测细胞的存活与分化。移植后1~6周对各组动物进行Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)评分。结果:细胞移植组BBB评分提高显著,与其他两组差异有统计学意义;免疫荧光显示,移植细胞在体内大量存活,多数细胞神经元特异性标记物NSE、NF-200表达呈阳性,少数细胞GFAP表达呈阳性。结论:局部移植的骨髓间充质干细胞可以转化为神经元样细胞,并有助于大鼠脊髓损伤后的功能恢复。     

神经干细胞体外分化抗原表达的研究

目的:观察体外神经干细胞向神经元分化过程中标志性抗原的表达,为进一步研究神经干细胞体外增殖分化的影响因素提供参照.方法:取12～14天胎鼠大脑皮层,体外培养神经干细胞;于第1次传代后第3天将培养的神经干细胞置于含有分化培养液的培养皿中进行分化;于不同分化时间点(1、4、7、10和14天)采用免疫细胞化学方法检测神经巢蛋白(nestin)、SOX2、doublecortin(DCX)、Tujl、神经元核心抗原(NeuN)各抗原的表达.结果:nestin和SOX2在开始时表达量非常近似,几乎在所有的细胞中两者均同时表达,随时间的推移,两者表达量均逐渐下降,但SOX2表达时间相对nestin持续更长;DCX表达量在分化1周内较高且变化不大,随后开始下降,至分化14天时仅有少数细胞呈DCX阳性;Tujl在分化7天时已有少量表达,随后逐渐增加,分化14天时有38.27%的细胞表达Tujl;在贴壁分化的1周内未见NeuN阳性细胞,但至分化14天时,NeuN阳性细胞占21.11%;在贴壁分化第1天时即有大量GFAP阳性细胞,其表达量随分化时间延长而逐渐下降,但下降趋势较nestin缓和,至分化14天时仍有大量GFAP阳性细胞.结论:神经干细胞体外分化过程中抗原的表达是一个相互交错的过程,未分化状态标志性抗原表达的减少与分化状态标志性抗原表达的增加互相对应.     

食蟹猴骨髓基质干细胞体外诱导分化的实验研究

为观察食蟹猴骨髓基质干细胞（BMSC）体外培养及诱导分化情况，分离食蟹猴的BMSC，以神经干细胞培养液和分化诱导因子进行体外培养和诱导分化。结果发现，分离得到的食蟹猴BMSC能在体外培养中增殖，分化，这些具有克隆能力的BMSC能表达神经干细胞特异性抗原Nestin，并能进一步诱导分化出胶质细胞样细胞和神经元样细胞，免疫细胞化学检测可见有GFAP和NSE抗原表达。提示灵长类BMSC是多分化潜能细胞，具有较强的自我更新和多分化能力，在适当的诱导分化条件下可形成具有神经系细胞（神经元和神经胶质细胞）特征的细胞；BMSC可作为神经干细胞的种子细胞。     

成体小鼠脊髓实质神经干细胞的分离培养及其多能性的鉴定

目的从成年小鼠脊髓实质中分离培养并鉴定成体神经干细胞。方法采用无血清培养基及单细胞克隆技术，从成年小鼠脊髓实质中分离培养获得大量具备单细胞克隆能力的细胞，经免疫荧光染色证实单克隆细胞表达Nestin抗原并在分化后表达各种特异性的神经细胞抗原。结果从成年小鼠脊髓实质中分离培养获得的具备连续克隆能力的细胞可表达神经干细胞的Nestin抗原，并且分化后表达神经元及胶质细胞的特异性抗原。结论成功地从成年小鼠的脊髓实质中分离出具备增殖分化能力的成体神经干细胞，为进一步利用其进行脊髓损伤治疗的研究提供了实验基础。