大鼠脊髓背根神经节内神经前体细胞的观察

目的:探讨大鼠脊髓背根神经节(DRG)内是否存在神经前体细胞.方法:取成年和胚胎大鼠DRG冰冻切片,进行Brdu,Nestin,P75免疫荧光组织化学检测,分别取成年和胚胎大鼠DRG进行原代细胞培养,观察其增殖与分化情况,并行Nestin免疫组织化学和Brdu,P75,NF,GFAP免疫荧光组织化学鉴定.结果:在成年和胚胎大鼠DRG冰冻切片上均见有Brdu/Nestin和Nestin/P75免疫荧光双标细胞.细胞培养观察到取自DRG的细胞有分裂增殖,呈Nestin免疫组织化学阳性反应和Brdu,P75免疫荧光组织化学阳性反应;培养第三代细胞加入胎牛血清后出现分化,分化细胞呈NF和GFAP免疫荧光组织化学阳性反应.结论:大鼠DRG内存在有分裂增殖的神经前体细胞,这些细胞可以分化为神经元和神经胶质细胞.     

神经干细胞的分离培养和鉴定及体外长期培养

目的探索新生SD大鼠神经干细胞的分离培养、鉴定及体外长期培养的方法。方法分离新生SD大鼠海马组织,用无血清培养技术培养神经干细胞,免疫组织化学荧光技术检测其巢蛋白(Nestin)的表达;并用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)掺入试验,免疫荧光双标技术观测神经干细胞的增殖状况。诱导神经干细胞分化,分别用神经元特异性核抗原(NeuN)抗体、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体、2,3-环核苷酸磷酸二脂酶(CNPase)抗体进行免疫组织化学荧光染色鉴定分化细胞。结果获得大量未分化呈巢状悬浮生长的神经干细胞团,并能分化为神经元和神经胶质细胞,且经传代培养10代以上仍具干细胞特性。结论成功培养出胚胎大鼠神经干细胞,培养出的细胞具有增殖、自我更新及多潜能分化能力,可分化为神经元及神经胶质细胞并可作为神经干细胞移植实验研究的供体细胞。     

人胎脑组织神经干细胞的分离培养、克隆和分化

目的 :从人胚胎脑组织中分离出具有自我更新和多分化潜能的神经干细胞 ,并在体外大量扩增。方法 :利用无血清培养技术和单细胞克隆技术从 4月龄人胚脑皮层和中脑中分离培养出神经干细胞 ,加入BrdU让其扩增 ,待形成大量神经干细胞球后 ,部分克隆球进行Nestin和BrdU的免疫荧光标记 ,另一部分神经干细胞球接种于含血清的培养基中让其贴壁分化 ,2周后分别行MAP -2、GFAP和CNP免疫荧光检测。结果 :神经干细胞球Nestin和BrdU免疫荧光检测均呈阳性。神经干细胞球分化后的细胞呈MAP-2、GFAP和CNP阳性。结论 :人胚脑组织中分离得到的神经干细胞具有自我更新和增殖能力 ,并具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的多分化潜能     

施万细胞对共培养的神经干细胞增殖与分化的影响

目的：探讨施万细胞诱导神经干细胞增殖与分化的影响因素。方法：大鼠胚胎神经干细胞单独培养及与新生SD大鼠施万细胞共培养，观察神经干细胞的形态变化，并分别检测特异性标志蛋白S-100、NF和GFAP的表达。结果：相差显微镜下可见共培养组大部分神经干细胞伸出多个细长突起；与单独培养组相比，免疫荧光染色显示共培养组NF表达阳性细胞数多；GFAP表达阳性细胞数少。结论：施万细胞可促进共培养的神经干细胞增殖，并可诱导神经干细胞向神经元方向分化。     

新生大鼠脊髓神经干细胞的分离培养及鉴定

目的　从新生大鼠的脊髓中分离培养神经干细胞并观察其增殖和分化能力。方法　采用细胞培养技术结合间接免疫荧光细胞化学法。结果　分离的细胞生长旺盛 ,单克隆化生成的细胞团 ,BrdU掺入呈强阳性。分离培养获得的细胞团呈Nestin强阳性 ,至今已在体外连续传代 8个月。培养的细胞团经 1%小牛血清诱导可分化为神经元和星形胶质细胞。结论　成功分离培养了新生大鼠脊髓神经干细胞     

大鼠骨髓基质干细胞向神经元样细胞的分化

目的:体外定向诱导大鼠骨髓基质干细胞（BMSCs）向神经元样细胞的分化。方法： 用DMEM培养液冲洗骨髓,收集骨髓细胞接种在培养瓶中体外扩增、纯化。用诱导剂诱导BMSCs分化为神经元样细胞。用免疫组化ABC法鉴定神经丝蛋白（NF-200）、微管相关蛋白（MAP-2）、神经元特异核蛋白（NeuN）、巢蛋白(Nestin) 、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、GAD和ChAT的表达。结果： BMSCs经诱导后,胞体增大,并伸出细长突起,与神经元形态相似。免疫组化显示大部分细胞NF-200,MAP-2,NeuN和Nestin表达阳性,(3±0.8)%的细胞GAD表达阳性,(5±0.3)%的细胞ChAT表达阳性,而GFAP 表达阴性。结论： BMSCs可被诱导分化为神经元样细胞,部分细胞可表达GAD与ChAT。     

蒺藜皂苷诱导SD新生大鼠海马神经干细胞分化的实验研究

目的 探讨蒺藜皂苷对于诱导SD新生大鼠海马神经干细胞(neural stem cells, NSCs)分化的影响作用以及蒺藜皂苷培养液浓度变化对其的影响.方法 采用无血清和单克隆培养方法,将蒺藜皂苷加入离体的海马NSCs的培养液中,应用Nestin、BrdU、NF200、GFAP免疫荧光染色观察NSCs的形态及分化而来的神经元、神经胶质细胞形态,并检测由海马NSCs分化而来的细胞的数量.结果 海马NSCs在无血清培养下,可形成Nestin阳性细胞球.在诱导分化后,免疫荧光染色可见NF阳性细胞、GFAP阳性细胞,而其中20 mg/kg 蒺藜皂苷干预组海马NSCs向神经元的分化比例最高.结论 在蒺藜皂苷的作用下,海马NSCs向神经元分化的数量增多.     

施万细胞对共培养的神经干细胞增殖与分化的影响

目的:探讨施万细胞诱导神经干细胞增殖与分化的影响因素。方法:大鼠胚胎神经干细胞单独培养及与新生SD大鼠施万细胞共培养,观察神经干细胞的形态变化,并分别检测特异性标志蛋白S-100、NF和GFAP的表达。结果:相差显微镜下可见共培养组大部分神经干细胞伸出多个细长突起;与单独培养组相比,免疫荧光染色显示共培养组NF表达阳性细胞数多;GFAP表达阳性细胞数少。结论:施万细胞可促进共培养的神经干细胞增殖,并可诱导神经干细胞向神经元方向分化。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外分化为神经元样细胞的研究

目的：研究大鼠骨髓间充质干细胞(rMSCs)体外扩增不同诱导剂向神经元样细胞诱导分化的潜能。方法：采用贴壁筛选法分离Wistar大鼠股骨rMSCs，体外扩增5-10代后，分别用2-巯基乙醇、硫代甘油等无血清的DMEM培养液诱导hMSCs分化为神经元。用流式细胞仪鉴定rMSCs特异抗原表达，免疫组化鉴定诱导后神经元样细胞的神经元烯醇化酶(NSH)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。结果：大鼠MSCs体外扩增传至5代后，流式细胞仪显示rMSCsCD27、CD44、CD90呈阳性表达；将rMSC加入2-巯基乙醇和硫代甘油等诱导剂3h后，rMSC胞体收缩，突起伸出；免疫组化显示诱导出的神经元样细胞NSE、NF表达阳性，GFAP阴性。结论：大鼠骨髓间充质干细胞在体外-定条件下可以分化为神经元样细胞。     

不同脑区来源的成体大鼠神经干细胞体外增殖特性

目的：探讨成年大鼠神经干细胞的脑内分布及体外培养条件，增殖特性，为自体神经干细胞移植修复神经损伤提供理论依据。方法：分离成年大鼠纹状体，室区（VZ）和室下区（SVZ）的细胞，利用无血清培养技术培养并观察神经干细胞的生长规律，采用SABC法进行神经上皮干细胞蛋白（Nestin)，增殖细胞核抗原（PCNA）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）及胶质纤维酸蛋白（GFAP）检测，并作姬母萨染色，对细胞进行鉴定，结果：由成年大鼠纹状体，VZ和SVZ区获得的细胞群，均可在体外分裂增殖形成神经球，Nestin阳性，进一步分化后分别呈现NSE和GFAP阳性。结论：成年大鼠脑内特定区域具有存在神经干细胞。     

PD大鼠纹状体提取液诱导中脑神经干细胞分化为多巴胺能神经元的研究

目的研究PD大鼠纹状体提取液诱对中脑神经干细胞的诱导分化作用.方法①体外分离、培养大鼠胚胎的中脑神经干细胞,并诱导其分化,巢素(Nestin)、神经丝-200(NF-200)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫组化染色鉴定.②加入纹状体提取液后,分化细胞用抗酪氨酸羟化酶(TH)免疫组化鉴定,并用流式细胞技术检测分化比例.结果①从大鼠胚胎的腹侧中脑部位分离获得了大量未分化、呈巢状悬浮生长的细胞团,且能分化为神经元和神经胶质细胞.②经纹状体提取液诱导后,能够分化出多巴胺能神经元,分化比例达20%左右.结论纹状体提取液能诱导中脑神经干细胞向多巴胺能神经元的分化.     

胚胎大鼠腹侧中脑区域神经干细胞的培养及鉴定

目的:探讨胚胎大鼠腹侧中脑区域神经干细胞(neural stem cell,NSCs)的分离、培养、传代及鉴定的方法。方法:分离E14.5胚胎大鼠腹侧中脑组织,用机械吹打方法形成细胞悬液,接种到含有表皮生长因子(ep i-derm al growth factor,EGF)、碱性成纤维生长因子(fibrob last growth factor-basic,bFGF)、B27(B27 sup lem ent)的DMEM/F12(1∶1)的无血清培养液中培养,待形成原代克隆球后,用有限稀释法进行单细胞克隆和传代扩增,以获得大量来源相同的NSCs克隆球,并且进行B rdu和Nestin检测;然后取培养细胞诱导分化后行GFAP,NeuN,TH检测。结果:E14.5胚胎大鼠腹侧中脑组织细胞培养两周后可以形成较多的悬浮生长的神经球,经单细胞克隆和传代扩增后得到大量的同源细胞克隆球。经过B rdu和Nestin的免疫细胞化学检测90%以上的细胞呈阳性;诱导分化后细胞呈GFAP,NeuN阳性,少量细胞呈TH阳性。结论:从E14.5胚胎大鼠腹侧中脑组织分离得到的细胞具有不断增殖和自我更新的能力,是胚胎大鼠中枢神经系统的NSCs,并可以分化为TH阳性神经元。     

BDNF对大鼠胚胎神经干细胞诱导分化的影响

【目的】脑源性神经营养因子（BDNF）对体外培养大鼠神经干细胞（NSCs）诱导分化的影响。【方法】体外克隆化培养获得的NSCs中分别加入不同浓度的BDNF,采用倒置光显微镜观察细胞克隆形成,透射电子显微镜观察细胞超微结构的变化,免疫组化的方法检测胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达。【结果】在倒置光显微镜下可见细胞接种后5 d形成小细胞球,7 d成为大小不等的细胞克隆。在电镜下可见具有典型的神经干细胞和神经胶质样细胞特征。经BDNF处理7 d后星形胶质样细胞增多,且突起的长度随浓度的增加逐渐延长,尤以40 ng/ml组突起最为显著（P〈0.05）。免疫细胞化学检测GFAP的阳性颗粒位于细胞浆中,经40 ng/mlBDNF诱导后阳性率可达86.1%,与对照组（13.1%）比较有显著性差异。【结论】BDNF可诱导神经干细胞分化为星形胶质细胞。     

两种干细胞体外标记及体内示踪方法的比较研究

目的研究5-溴脱氧尿嘧啶核苷（5-bromo-2-deoxyuridine,Brdu）及PKH26作为人真皮多能干细胞（human dermis multipotent stem cells,hDMCs）标记物进行体内示踪的可行性。方法分别以Brdu和PKH26标记培养的hDMCs,在体外观察其标记效果。将标记的hDMCs以2×10^6个细胞/只尾静脉移植经6Gy全身照射的C57BL/6J小鼠,检测hDMCs在各脏器的定植与分布。结果 Brdu和PKH26在体外均能很好地标记hDMCs,在体内可检测到Brdu标记的hDMCs,尚不能检测到PKH26标记的hDMCs。结论与PKH26相比较,Brdu更适合作为hDMCs体外标记及体内示踪的标记物。     

胎鼠脊髓神经干细胞的分离、培养和鉴定

目的:分离、培养和鉴定胎鼠脊髓神经干细胞,为建立稳定的脊髓神经干细胞系提供基础.方法:应用无血清培养技术从胎鼠脊髓分离、培养神经干细胞,并应用神经干细胞特异性抗体对其进行标记;应用BrdU掺入培养检测其分裂增殖能力;应用神经元和星形胶质细胞特异性抗体分析其多向分化潜能.结果:分离到的细胞具有不断分裂增殖的能力,可被神经干细胞特异性抗体所标记,并在血清条件下分裂为神经系统多种细胞.结论:分离到的细胞具有自我复制能力和多向分化潜能,是中枢神经系统的干细胞,为应用于中枢神经系统损伤治疗提供了基础.     

成人骨髓间质干细胞诱导分化为神经元样细胞及其与细胞分裂的关系

目的探讨成人骨髓间质干细胞(hMSC)向神经元样细胞分化过程中分化与细胞分裂的关系。方法从成人骨髓中分离骨髓间质干细胞(MSC),培养扩增。用参芪液诱导MSC分化为神经元样细胞,经免疫组化鉴定其神经元烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。诱导后进行神经元样细胞计数,掺入Brdu测定,计算标记系数。采用双标记间接免疫荧光法检测神经元样细胞特异性表面标记(NSE、NF)与细胞分裂的标记Brdu的关系。抑制DNA合成,计算Brdu、NSE和NF阳性细胞数。结果MSC经参芪液诱导后,可见神经元样细胞。免疫组化显示诱导出的神经元样细胞NSE、NF阳性,GFAP阴性。MSC诱导分化后的细胞总数增加,诱导分化后12h内细胞增殖较快。30%以上分化的神经元样细胞在表达NSE和NF的同时可见Brdu标记,而另一部分分化的神经元则无Brdu标记。抑制DNA合成,并不会阻止神经元的分化,仍有70%的分化神经元表达神经元特异性标记蛋白NSE。结论MSC诱导分化的部分神经元样细胞可进行细胞分裂,但抑制细胞分裂不影响神经元分化。     

LaZ转基因小鼠腹侧中脑神经干细胞的扩增与诱导分化

目的构建LaZ转基因小鼠腹侧中脑神经干细胞的扩增与诱导分化技术平台,为进行体内移植携带报告基因的神经干细胞研究奠定基础.方法利用无血清培养基,分离并体外培养LaZ转基因胚胎小鼠腹侧中脑神经干细胞,连续稳定传代20代后,以免疫荧光、免疫细胞化学法及组织化学方法检测神经球Nestin和分化后细胞中神经纤维（NF）、胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）、Galc和半乳糖苷酶（X-Gal）的表达.结果从LaZ转基因小鼠腹侧中脑分离的细胞群具有连续形成神经球的能力,其Nestin表达阳性.分化后的细胞可表达神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原.所有细胞半乳糖苷酶组织化学均为阳性.结论LaZ转基因小鼠腹侧中脑神经干细胞可稳定扩增,具有多向分化潜能,分化后细胞携带LaZ报告基因,可用于进一步的移植实验研究.