转染超抗原SEA肝癌细胞的构建及鉴定

目的用基因重组的方法将葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因转染至肝癌细胞.方法先从产SEA标准菌株中提取并扩增SEA全长基因,将SEA基因克隆及亚克隆至真核表达载体pLXSN构建pLXSN-SEA重组质粒,再将重组质粒转染至人肝癌细胞系BEL-7402细胞,用RT-PCR和ELISA法鉴定.结果从产SEA标准菌株ATCC13565中提取并扩增出SEA基因全长片段;SEA基因克隆和亚克隆至真核表达载体pLXSN,经测序证实所得序列与GenBank中的标准序列完全一致;将pLXSN-SEA质粒转染肝癌细胞BEL-7402,经筛选获得稳定表达的抗性单克隆.RT-PCR扩增出约800bp的基因片段,经ELISA分析细胞培养上清中SEA蛋白的含量在皮克的水平.结论成功构建了重组超抗原SEA基因的克隆载体及真核表达载体,将SEA基因转染至肝癌细胞株BEL-7402细胞后癌细胞能够表达并持续分泌SEA蛋白.     

超抗原SEA抗肿瘤研究进展

超抗原是指一些细菌或病毒编码的蛋白分子，只需极低浓度即可激活大量的淋巴细胞克隆．作为一种强大的T细胞激活剂，超抗原成为肿瘤免疫治疗研究的热点之一．本文对其特性及目前的研究进展作一综述．     

超抗原SEA抗肿瘤研究进展

超抗原是指一些细菌或病毒编码的蛋白分子, 只需极低浓度即可激活大量的淋巴细胞克隆.作为一种强大的T细胞激活剂,超抗原成为肿瘤免疫治疗研究的热点之一.本文对其特性及目前的研究进展作一综述.     

超抗原SEA的基因克隆、原核表达与鉴定

目的：构建pRSET-SEA重组表达载体，转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，诱导表达超抗原葡萄球菌肠毒素A(staphylococcal enterotoxin A，SEA)，进行分离、纯化及western bolt鉴定。方法：采用PCR技术，从产SEA的葡萄球菌标准菌株FRI100基因组DNA中获得SEA全长序列，克隆人pUC19中，进行测序，构建pRSET-SEA表达质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，通过异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG）诱导表达，分离、纯化及western blot鉴定。结果：PCR获得超抗原SEA基因片段，DNA测序结果与文献报道一致；构建了pRSET-SEA表达质粒，并成功地诱导表达出32000u的蛋白；Western blot鉴定所得蛋白能够与SEA单克隆抗体特异性结合。结论：本研究成功地克隆了SEA全长，并进行了原核表达和分离、纯化，获得了SEA蛋白。     

超抗原SEA(D227A)的构建及其免疫活性鉴定

目的 构建SEA(D227A)基因的原核表达载体，并进行表达、分离纯化与免疫活性鉴定。方法 采用PCR技术从产SEA的葡萄球菌标准株中克隆SEA基因，通过下游引物上的点突变，使SEA基因第680位碱基由A突变为C，致使SEA成熟蛋白的第227位氨基酸残基由天冬氨酸(GAT)突变为丙氨酸(GCr)，构建pGEX-SEA(D227A)重组表达质粒，在大肠杆菌DHSa中原核表达，再通过淋巴细胞增殖实验对其免疫活性进行测定。结果 构建的SEA(D227A)基因经测序证实与设计的序列一致；成功地构建pGDX-SEA(D227A)重组表达质粒，转化感受态大肠杆菌DH5α，通过IPTG诱导、GSTrap FF柱分离纯化及凝血酶切除CST后，得到Mr为27000的目的蛋白。淋巴细胞增殖实验显示，100ng/mL重组SEA(D227A)可明显刺激淋巴细胞增殖。结论 成功地构建了SEA(D227A)基因原核表达载体，并在大肠杆菌中得到高效表达，所得重组SEA(D227A)能够刺激淋巴细胞增殖，但作用与野生型SEA相比较温和。该结果为寻找有效、毒副作用低的超抗原提供了线索。     

超抗原-SE抗肿瘤作用的研究进展

葡萄球菌肠毒素(Staphylococcal entero-toxin，SE)是一种外源性超抗原，仅需微量即能高效地刺激T细胞增殖，促使其产生大量的细胞因子及细胞毒作用，提高机体总体细胞免疫水平，达到抗肿瘤的能力。体外细胞水平和动物体内的研究结果表明：SE能够产生强大的杀伤和抑制肿瘤细胞效应，是一种很有前途的新型肿瘤免疫治疗剂。目前已开始应用于肿瘤病人的治疗及对肿瘤病人在进行放化疗时保护机体白细胞降低以及防止其他毒副反应的发生。     

超抗原-SE抗肿瘤作用的研究进展

葡萄球菌肠毒素(Staphylococcal entero-toxin,SE)是一种外源性超抗原,仅需微量即能高效地刺激T细胞增殖,促使其产生大量的细胞因子及细胞毒作用,提高机体总体细胞免疫水平,达到抗肿瘤的能力.体外细胞水平和动物体内的研究结果表明SE能够产生强大的杀伤和抑制肿瘤细胞效应,是一种很有前途的新型肿瘤免疫治疗剂.目前已开始应用于肿瘤病人的治疗及对肿瘤病人在进行放化疗时保护机体白细胞降低以及防止其他毒副反应的发生.     

点突变SEA(D227A)的基因构建、原核表达与鉴定

目的：进行点突变的SEA(D227A)基因原核表达载体的构建，并进行表达、分离纯化与鉴定。方法：采用PCR技术从产SEA的葡萄球菌标准株中克隆SEA基因，通过下游引物上的点突变，使得到的SEA基因752位碱基突变由A突变为c，致使SEA成熟蛋白的第227位氨基酸残基由D(DAT)突变为A(GCF)，构建pRSET：SEA(D227A)重组表达质粒，在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中进行原核表达，再通过Western blot进行鉴定。结果：构建的SEA(D227A)基因经测序证实与设计的序列一致。成功地构建pRSET-SEA(D227A)重组表达质粒，转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，通过IPTG诱导得到分子量约为32kD的蛋白，Western blot显示其能够与抗SEA的单克隆抗体特异性结合，最后采用Ni^2 -NTA柱进行分离纯化。结论：成功地构建SEA(D227A)基因原核表达载体，并在大肠杆菌中得到高效表达，为寻找有效低毒副作用的超抗原提供了线索。     

肝癌靶向性SEA-CD80基因共表达重组腺病毒载体的构建及表达鉴定

目的:构建肝癌靶向性葡萄球菌肠毒素A(SEA)和CD80基因共表达重组腺病毒载体。方法:首先利用现有的腺病毒穿梭质粒pShuttle和pShuttleCMV,构建新的不带CMV增强子/启动子而带有polyA加尾信号穿梭质粒,命名为pShuttle2。将AFP增强子、启动子、SEA及CD80基因分别从已构建的pKSEP载体和pMD18TBIS载体上,分别亚克隆至pShuttle2中,再与腺病毒骨架质粒pAdEasy1共转化E.coliBJ5183。以获得的重组子转染HEK293细胞后制备重组腺病毒,然后感染高表达AFP的肝癌细胞系Hepa16和不表达AFP的黑色素瘤细胞系B16、成纤维细胞系NIH3T3。采用间接免疫荧光法,激光共聚焦显微镜观察和流式细胞术检测SEA和CD80在细胞膜表面的表达。采用3H掺入法检测膜表达的SEA诱导淋巴细胞增殖的活性。结果:以制备的重组腺病毒感染肿瘤细胞后,SEA和CD80能够靶向性地共表达在高表达AFP的Hepa16细胞膜上,而在不表达AFP的B16、NIH3T3细胞膜上不表达。结论:成功地构建肝癌靶向性SEA和CD80基因共表达重组腺病毒载体,为进一步研究SEA和CD80在肝癌靶向基因治疗中的联合应用及其抗肿瘤免疫机制奠定了基础。     

超抗原SED在大肠杆菌中的表达

目的 构建稳定的SED原核表达系统。方法 采用PCR技术扩增葡萄球菌D型肠毒素（SED）超抗原的成熟蛋白编码区DNA序列，构建SED DNA与6个组氨酸基因融合的表达载体pTrcHis-SED，转入E.coli DH5α，IPTG诱导后，用SDS－PAGE和免疫印迹检测融合蛋白的表达情况。目的蛋白用Ni-NTA金属亲和层析法进行纯化，SDS－PAGE和毛细管电泳检测蛋白纯度。结果 成功构建了原核表达载体pTrcHis-SED。分子量约为28000u的6His-SED融合蛋白可在E.coli DH5α中稳定表达。Ni-NTA金属亲和层析后得到纯度较高（＞95％）的SED融合蛋白，且具有免疫学活性。结论 本研究为SED免疫识别研究奠定了实验基础。     

超抗原葡萄球菌肠毒素A拮抗伊马替尼抑制T细胞活化作用的研究

 目的：探讨葡萄球菌肠毒素A(staphylococcal enterotoxin A, SEA)对甲磺酸伊马替尼（imatinib mesylate，IM）抑制T淋巴细胞活化的影响。方法：2 mg／L SEA 和50 nmol/L IM联合作用于Jurkat细胞24 h后，用实时荧光定量PCR技术检测CD3ε和ζ链mRNA表达水平变化；Western blotting技术检测CD3ε和ζ链蛋白水平变化。结果：单纯IM组CD3ε和ζ链mRNA及蛋白表达均表现下调；SEA与IM联合用药组可以逆转IM下调CD3ε和ζ链mRNA及蛋白表达水平作用。SEA拮抗IM抑制作用中，对CD3ε链mRNA表达上调的作用明显大于CD3ζ链。结论:SEA能拮抗IM对T细胞CD3ε和ζ链表达的抑制作用。     

Superantigen and endotoxin synergize in the induction of lethal shock

Endotoxin (lipopolysaccharide; LPS) and superantigens (exotoxins) have been identified as potent inducers of lethal shock. While endotoxin primarily interacts with CD 14 receptors on macrophages, superantigens like the staphylococcal enterotoxin B (SEB) preferentially activate T cells. Both cell types are triggered to release pro-inflammatory cytokines that in turn induce lethal shock. We analyzed whether endotoxin and superantigen interact during the induction phase of lethal shock. We report that LPS and SEB operate synergistically. Lethal doses of both inducers were reduced 100-fold when given in combination. The induced serum levels of tumor necrosis factor, interleukin-6, and interferon-γ (IFN-γ) were elevated and remained high for a prolonged period. Moreover, synergistic action of LPS and SEB induced lethal toxic shock even without presensitization of mice with D -galactosamine (D -GalN). Opposed to D -GalN-pretreated mice, mice injected with LPS and SEB showed less liver damage, but rather apoptosis of epithelial cells in the bowel. Cyclosporin A and treatment with anti-IFN-γ monoclonal antibody blocked the synergistic action of LPS and SEB, indicating that T cell-derived IFN-γ is the mediator of the observed synergism. Concomitant injection of LPS and SEB had no influence on SEB-induced T cell deletion and anergy induction. Since Gram-positive and Gram-negative bacteria can be recovered from septic blood samples, the synergistic action of endotoxin and superantigens might be relevant during lethal septicemia.     

SEA和B7-1基因真核共表达载体的构建及在B16细胞的表达

目的构建葡萄球菌肠毒素A（SEA）和小鼠B7-1基因真核共表达载体。方法采用PCR和RT-PCR方法分别克隆了带B7-1跨膜区的SEA（SEA-B7tm）和小鼠B71基因,中间通过内部核糖体进入位点（Internal ribosome entry site,IRES）序列的连接克隆至真核表达载体pcDNA3.1＋。利用阳离子脂质体将重组质粒转染B16细胞,间接免疫荧光法检测B7-1和SEA分子在B16细胞膜表面的表达情况。结果测序结果与Genebank中公布的SEA、小鼠B7-1 cDNA序列相符,双标记间接免疫荧光检测结果表明B7-1、SEA同时在转染的B16细胞膜上表达。结论成功构建了SEA和小鼠B7-1真核共表达载体,为进一步研究SEA和B7-1联合应用抗肿瘤免疫治疗及其免疫机理奠定了基础。     

A Novel Approach for Cancer Immunotherapy: Tumor Cells with Anchored Superantigen SEA Generate Effective Antitumor Immunity

Murine B16 melanoma cell line is poorly immunogenic and highly aggressive. We recently reported that the transmembrane staphylococcal enterotoxin A (TM-SEA) anchors onto B16 cells and stimulates lymphocyte proliferation. The purpose of the study was to investigate whether vaccination with B16 cells bearing membrane-anchored TM-SEA fusion protein could cause tumor-specific immunity. Mice in the therapeutic vaccination group received B16 tumor inoculations, followed by treatment with B16-TM-SEA vaccine or control vaccines. Mice in the prophylactic vaccination group were given B16-TM-SEA vaccine or control vaccines, followed by challenge with wild type B16 or control EL4 cells. Significant tumor growth inhibition, prolongation of survival, and marked augmentation of NK and CTL activities were observed in mice which received B16-TM-SEA vaccine as compared to controls. Overall, our results suggest that the TM-SEA cellular vaccine is a novel and effective strategy for cancer immunotherapy.     

金黄葡萄球菌肠毒素A诱导的免疫应答

目的 研究超抗原金黄葡萄球菌A型肠毒素(SEA)在体内诱导的体液免疫反应、T淋巴细胞增殖及免疫无应答的规律和作用.方法 利用重组SEA蛋白免疫小鼠,酶联免疫吸咐试验(ELISA)检测特异性抗体及其亚类水平,观察两者的产生过程及变化规律.RT-PCR反应检测免疫后小鼠脾脏内细胞因子的mRNA表达水平,EUSPOT法检测rSEA对脾细胞分泌IFN-γ能力的影响,流式细胞术检测T淋巴细胞表面抑制性受体PD-1的表达.结果 BALB/c小鼠在低剂量的rSEA初次免疫后2周,即产生了高水平的特异性抗体,此时体内以体液免疫应答为主,IgG2a/IgG1＜1;而在免疫早期,Th1型细胞因子的mRNA表达水平高于Th2型,以细胞免疫应答为主.短时期内进行再次免疫后脾细胞的IFN-γ分泌频率显著下降;流式细胞仪在rSEA激活的T淋巴细胞表面检测到了PD-1(programmed death-1)分子的表达,其表达量随时间及免疫次数增加.结论 超抗原SEA初次免疫即能引起强大的体液免疫应答与细胞免疫应答;再次免疫引起了免疫无应答,这与PD-1介导的抑制作用增强有关.     

铜绿假单胞菌外毒素A的抗原性及其与辅助细胞的关系

目的　研究铜绿假单胞菌外毒素A(PE)的某些抗原性及其与辅助细胞的关系。方法用MTT法观察PE在有无辅助细胞参与条件下对鼠脾淋巴细胞的刺激作用 ,并用鼠细胞毒性T细胞株CTLL进行证实。结果　PE在 0 0 1～ 10 0ng/ml浓度范围能刺激鼠脾淋巴细胞增殖 ,PE的丝裂原作用无需粘附细胞的辅助 ,但粘附细胞及其粘附细胞的PE刺激上清能协同PE对鼠脾淋巴细胞的刺激作用。PE在丝裂原作用范围内能刺激CTLL细胞生长 ,并与IL 2有协同作用。PE在体内能使小鼠脾淋巴细胞自发淋转率增高 ,对ConA刺激的增殖反应增强 ,但对淋巴细胞自发分泌IL 2和ConA诱导IL 2的产生水平无影响。结论　PE在无辅助细胞参与条件下也能刺激淋巴细胞增殖     

葡萄球菌肠毒素超抗原广谱抑制性多肽的功能研究

目的在前期筛选出针对SEA、SEB、SEC具有广谱抑制性的多肽P72基础上,通过竞争结合实验和动物模型对多肽P72的抑制机制进行探讨。方法采用竞争结合实验检测多肽P72与MHCⅡ类分子的亲合力;利用"两次攻击(two-hit)法"建立的动物模型研究P72对SEs的体内抑制活性。结果 P72不能与FITC-SEs有效竞争结合Raji细胞上的MHCⅡ类分子,P72对SEA、SEB和SEC致Balb/c小鼠休克效应具有显著的保护作用。结论 P72可能不是与MHC II类分子结合而产生的抑制作用,P72能够在体内抑制SEs的超抗原活性,其具体的抑制机制有待深入研究。