用杆状病毒系统表达戊型肝炎病毒全长结构基因的研究

目的：获取含有戊型肝炎病毒（HEV）全长结构基因的重组杆状病毒，表达戊型肝炎病毒结构蛋白。方法：将HEV全长结构基因（5147－7126nt）插入杆状病毒表达载体pAcUW51，与线性化杆状病毒DNA（Baculo Gold DNA）共转染Sf9昆虫细胞，挑病毒斑进一步感染Sf9细胞，用SDS－PAGE，Western Blot及免疫荧光检测戊型肝炎病毒结构蛋白的表达及活性。结果：SDS－PAGE分析表明HEV结构基因在杆状病毒系统中高效表达，有相对分子质量约为73000和63000两种形式；Western Blot及免疫荧光检测证明表达产物可与HEV阳性血清特异反应，说明具有HEV特异抗原性。结论：应用杆状病毒表达系统成功表达了HEV结构蛋白。     

人脂联素基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达

目的利用杆状病毒表达系统探讨人脂联素(ADPN)基因在Sf9昆虫细胞中的高效表达。方法利用PCR方法扩增人脂联素基因,与pFastBac1质粒连接,转化入含有穿梭载体bacmid的大肠杆菌DH10Bac中,筛选发生转座作用的重组穿梭载体Bacmid-ADPN并转染Sf 9昆虫细胞,使其表达重组杆状病毒,经SDS-PAGE、Western blot检测表达产物。结果重组杆状病毒感染的Sf 9细胞形态变化明显,能够表达出与脂联素多克隆抗体相结合的蛋白,蛋白分子质量约为30 ku。结论人脂联素基因在真核细胞中成功得到表达,为进一步研究其生物学活性和作用机制奠定基础。     

呼吸道合胞病毒融合蛋白F在重组杆状病毒表达系统中的表达及抗原性研究

目的 利用杆状病毒表达系统对RSV A型Long株F基因进行表达研究,为RSV重组亚单位疫苗的研制奠定基础.方法 用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增F基因,将其克隆到pFastBacHT A载体中,阳性重组质粒转化DH10Bac感受态细胞,PER鉴定获得阳性克隆,碱裂解法提取阳性质粒,转染Sf9昆虫细胞,获得含F基因的重组杆状病毒质粒,重组病毒感染Sf9细胞72 h后,进行SDS-PAGE电泳、间接免疫荧光和Western-blot试验.免疫Balb/c小鼠,用ELISA测定抗体滴度,MTT试验检测T淋巴细胞增殖.结果 目的 蛋白F在昆虫细胞中有特异性表达,能被F蛋白单克隆抗体所识别,该蛋白诱导了高滴度的RSV特异性抗体.结论成功克隆RSV F基因,并在Sf9昆虫细胞中获得表达,该蛋白具有良好的免疫原性,为进一步研究开发RSV重组亚单位疫苗奠定了基础.     

谷氨酸脱羧酶65重组杆状病毒表达载体的构建及其在昆虫细胞中的表达

目的构建谷氨酸脱羧酶GAD65基因的杆状病毒重组供体质粒,包装重组GAD65的杆状病毒,感染昆虫细胞进行表达。方法先将已克隆的GAD65 cDNA与线性化的pFASTBACHTb进行连接,使pFASTBACHTb-GAD65与DH10BAC感受菌进行转座重组,利用抗性及蓝白斑筛选重组Bacmid/GAD65克隆,提取Bacmid/GAD65转染昆虫细胞Sf 9包装杆状病毒,利用病毒感染Sf9细胞进行蛋白表达,通过免疫荧光、SDS PAGE和Western blot检测表达情况。结果获得了重组GAD65的杆状病毒,细胞能表达出与GAD65单抗结合的蛋白,相对分子质量为65kDa左右,细胞可直接分泌GAD65蛋白至上清。结论GAD65能在昆虫细胞中获得良好表达为研究GAD65的作用及免疫治疗奠定基础,。     

重组杆状病毒表达的EIAV Env蛋白与含有env基因重组痘苗病毒的联合免疫

目的：构建新型的马传染性贫血病毒(EIAV)的候选疫苗：方法：利用BAC—To—BAC杆状病毒表达系统，将中国马传贫驴白细胞弱毒疫苗(EIAV DLV)及其亲本株(EIAV LN)env基因导入到杆状病毒基因组中。转染昆虫细胞后，得到的重组病毒用SDS—PAGE和Western blot检测表达产物。以本实验室构建的含有EIAV env基因的重组痘苗病毒，单独或与重组杆状病毒表达的EIAV Env蛋白联合免疫小鼠。结果：构建的重组杆状病毒能正确表达全长Env蛋白。与单独免疫组相比，联合免疫组免疫应答显著增强，其中中和抗体的滴度提高5～9倍。结论：含有EIAV env基因的重组痘苗病毒与Env蛋白抗原联合免疫，能够诱导高滴度的中和抗体。     

手足口病CA16型VP1亚单位疫苗的构建制备及免疫原性初步分析

目的 制备CA16型VP1蛋白疫苗并进行免疫原性初步分析,为手足口病CA16疫苗的深入研究提供资料.方法 利用RT-PCR技术获得CA16 VP1基因,克隆到载体pFastBac HT A,与Bacmid DNA重组,转染Sf9昆虫细胞,重组CA16 VP1蛋白与Al(OH)_3佐剂混合制备重组CA16 VP1蛋白疫苗,腹腔免疫BALB/c小鼠,2次免疫后进行免疫效果初步评价.结果 用间接免疫荧光、SDS-PAGE和Western blot法,证明重组CA16 VP1蛋白在昆虫细胞Sf9中得到表达,用ELISA和微量中和法检测到免疫小鼠血清有特异IgG和中和抗体产生,最佳免疫抗原剂量为20μg,其特异IgG效价为1:1600,中和抗体效价为1:250;通过淋巴细胞增殖试验和细胞因子测定,证明诱导T细胞应答,诱发Th1/Th2型免疫应答.结论 CA16 VP1基因克隆成功,并在Sf9昆虫细胞中获得表达,构建的蕈组CA16 VP1亚单位疫苗具有诱导特异性细胞免疫和体液免疫应答的能力,为今后研制手足口病CA16疫苗奠定了基础.     

在昆虫细胞表达汉坦病毒的核蛋白及其在血清检测中的初步应用

杆状病毒是应用广泛的真核表达系统 ,利用杆状病毒核多角体启动子 ,可以在昆虫细胞高效表达外源基因。由于在昆虫细胞中表达的蛋白可以进行翻译后修饰 ,是表达汉坦病毒结构的理想系统。我们用昆虫细胞分别表达了姬鼠型和家鼠型汉坦病毒的糖蛋白和核蛋白 ,并进行了检测抗体的研究。使用PCR分别扩增姬鼠型汉坦病毒A9株、家鼠型汉坦病毒L99株的M和S片段编码区序列 ,克隆到昆虫细胞表达穿梭质粒pAcUW5 1,在杆状病毒核多角体启动子控制下。将质粒转Sf9细胞 ,通过 3轮空斑筛选重组病毒 ,用Western blot和免疫荧光证实了这些基因在昆虫细胞得…     

汉滩病毒结构蛋白昆虫细胞融合表达产物的免疫原性评价

目的：研究汉滩病毒（HTNV）囊膜糖蛋白G1与核蛋白（NP）部分片段在昆虫细胞中融合表达产物的免疫学特性，为HTNV基因工程疫苗的研制提供依据。方法：构建含有HTNV G1S0.7嵌合基因的重组杆状病毒Bac-G1S0.7，用其感染的Sf9细胞免疫Balb/c小鼠。用间接免疫荧光法、ELISA法、微量细胞培养中和试验及T淋巴细胞增殖试验对被免疫小鼠的体液免疫及细胞免疫应答效果进行检测。结果：Bac-G1S0.7感染的昆虫细胞免疫小鼠后，测得免疫鼠血清抗HTNV抗体滴度最高达1：3200，含有特异性抗HTNV NP及抗HTNV糖蛋白G1的抗体，被免疫小鼠中有部分产生了较低滴度的中和抗体，免疫鼠脾细胞对HTNVNP或糖蛋白的增殖反应指数均高于阴性对照组。结论：G1S.07嵌合基因的昆虫细胞表达产物具有较好的免疫原性，可刺激机体同时产生针对HTNV NP与囊膜糖蛋白G1的细胞及体液免疫应答。     

戊型肝炎病毒ORF2 C端抗原片段的表达及其免疫学特性研究

目的　表达戊型肝炎病毒 (hepatitisEvirus ,HEV)ORF2C端 12 8个氨基酸残基的抗原片段ORF2 3 ,并进行其免疫学特性的研究。方法　用pBV2 2 0载体进行抗原的非融合表达 ,包涵体经变性凝胶过滤层析及离子交换层析纯化后透析复性 ,以Westernblot、ELISA、动物免疫与抗原捕获RT nPCR等方法研究其免疫学特性。结果　获得了ORF2 3的高效表达 ,表达量占菌体总蛋白 5 0 %左右 ,纯化后纯度达 98%以上 ,Westernblot表明表达抗原可与戊肝患者阳性血清特异性结合 ;在HEV感染恒河猴实验中用于IgG抗体的检测 ,具有较好灵敏度与特异性 ;用其免疫豚鼠 ,抗体经ELISA法测定效价为 1∶80 0 0 ;用制备的豚鼠抗血清捕获戊型肝炎病毒颗粒 ,经RT nPCR扩增出特异性片段。结论　ORF2 3抗原片段具有HEV抗体识别的抗原表位 ,能够刺激机体产生抗体 ,抗血清具有一定的识别与结合戊型肝炎病毒颗粒的能力     

人乳头瘤病毒16型结构基因L1在昆虫细胞中的表达及其生物学活性

目的 研究与宫颈癌及人类其它多种组织癌症密切相关的人乳头瘤病毒16型（HPV16）的晚期基因L1的表达及其生物学活性。方法 采用PCR法从pBSSK-B/16L1扩增了来自中国妇女鲍温病组织标本的HPV16晚期基因L1,装入杆状病毒转移载体;在DH10Bac内通过转座子Tn7的介导,使携带有杆状病毒多角体蛋白基因启动子Ppolh的HPV16 L1基因整合入杆状病毒,形成重组杆状病毒;转染昆虫细胞Sf9进行表达;将感染72h的Sf9细胞包埋、切片、染色后,电镜观察。提取L1蛋白,免疫BALB／ c小鼠。结果 重组杆状病毒在Sf9细胞内高效表达出L1蛋白,经Western blot发现能与L1抗体特异地结合;薄层扫描显示所表达的L1蛋白占Sf9细胞总蛋白的比例高达31％。经透射电镜观察表明,在细胞核里有大量的重组杆状病毒形成;并且产生了大量的由HPV16 L1蛋白单体自组装的病毒样颗粒（virus-like particles,VLP)。小鼠免疫实验结果表明,所表达的HPV16 L1蛋白单体自组装的病毒样颗粒（virus-like particles,VLP)。小鼠免疫实验结果表明,所表达的HPV16 L1蛋白具有强免疫原性。结论 此研究为今后L1基因分子流行病学检查、L1蛋白的结构生物学研究、疫苗研制以及HPV相关基础性研究提供了有用的资料。     

人CD4 胞外区蛋白在杆状病毒鄄昆虫细胞系统中的表达纯化及性质鉴定

目的:通过条件优化实现人CD4 蛋白胞外区在杆状病毒-昆虫细胞表达系统中的高效表达,并对纯化获得的人CD4 蛋白胞外区进行抗原性与免疫原性分析。方法:通过选择人CD4 分子胞外片段构建重组杆状病毒(pAc-CD4),然后感染昆虫细胞进行蛋白的表达,采用镍离子亲和层析纯化。运用SDS-PAGE、Western blot、体积排阻色谱、ELISA、SPR 法等分析纯化得到目的蛋白的理化性质和抗原性。通过弗氏佐剂与目的蛋白混合免疫BALB/ c 小鼠,监测小鼠免疫血清的抗体生成。结果:经纯化可获得纯度90%以上的人CD4 蛋白,每升细胞培养液最终可获得11.2 mg 的目的蛋白,且该人CD4 胞外区蛋白具有良好的抗原性。小鼠血清监测结果显示人CD4 蛋白能有效刺激机体产生免疫应答,显示其具有良好的免疫原性。结论:本研究通过杆状病毒-昆虫细胞系统进行高效表达,获得抗原性和免疫原性良好的人CD4 胞外区蛋白,为HIV 受体和感染的研究奠定基础。     

Expression of goose parvovirus VP1 capsid protein by a baculovirus expression system and establishment of fluorescent antibody test to diagnose goose parvovirus infection

Summary.  The gene encoding VP1 capsid protein of a goose parvovirus was cloned into a baculovirus transfer vector and a recombinant baculovirus was produced. The recombinant virus expressed a protein of 88 kDa corresponding to the molecular weight of VP1 protein and the protein was detected by immunoblotting. By indirect fluorescent antibody (IFA) test, the expressed protein was detected in the nucleus of the insect cells as big granules and electron microscopy also showed several big granules in the nucleus infected with the recombinant virus. The IFA test was developed for screening antibody in Muscovy ducks. Received December 18, 1998 Accepted March 21, 1999     

人乳头瘤病毒16型致瘤基因E6在昆虫细胞中表达及其蛋白抗原特性的初步研究

目的研究人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）相关肿瘤患者的ＨＰＶ１６Ｅ６抗体水平及其流行病学意义；探讨用杆状病毒－昆虫细胞表达载体系统表达的ＨＰＶ１６Ｅ６蛋白的抗原性。方法用ＰＣＲ从ＨＰＶ１６基因组中扩增出ＨＰＶ１６Ｅ６完整基因，克隆至转移载体ｐＶＬ１３９３中，重组质粒ＤＮＡ与线性杆状病毒ＤＮＡ共转染昆虫细胞Ｓｆ－９，经噬斑筛选获得带有编码Ｅ６基因的重组杆状病毒株，并在昆虫细胞中表达。结果Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ和高效液相色谱法检测ＨＰＶ１６Ｅ６表达蛋白，其分子量约为１８０００。免疫印迹检测显示其能与兔抗ＨＰＶ１６Ｅ６多抗特异性结合。酶联免疫吸附试验表明此重组蛋白能被人ＨＰＶ１６阳性血清所识别。结论昆虫细胞表达的ＨＰＶ１６Ｅ６蛋白，具有良好的抗原性，可用于检测ＨＰＶ１６Ｅ６特异性免疫球蛋白ＩｇＧ和ＩｇＭ抗体     

汉滩病毒囊膜糖蛋白G2与核蛋白氨基端在昆虫细胞中的融合表达

目的：在Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中，融合表达汉滩病毒的囊膜糖蛋白G2与核蛋白氨基端。方法：构建含有汉滩病毒G2S0．7嵌合基因的表达载体pFBDHTa—G2S0．7，并转化DH10Bac感受态菌。利用其含有的细菌Tn7转座系统，将嵌台基因重组至杆状病毒穿梭质粒hacmid中，并筛选含有G2S0．7嵌合基因的重组杆状病毒，在昆虫细胞中表达该融合蛋白。对表达产物用间接免疫荧光、ELISA和免疫印迹进行检测。结果：构建了的含G2S0．7嵌合基因的重组杆状病毒，感染昆虫细胞后，可表达相应大小的融合蛋白。该蛋白可被抗汉滩病毒核蛋白及糖蛋白G2的特异性单克隆抗体(mAb)所识别。结论：利用杆状病毒表达系统，成功地表达同时具有核蛋白及糖蛋白G2生物学活性的融合蛋白G2S0．7，为进一步研究其免疫学特性奠定了基础。     

丙型肝炎病毒H株包膜糖蛋白在昆虫细胞中的表达

目的 利用杆状病毒表达系统,在昆虫细胞中表达了丙型肝炎病毒（HCV）H株的包膜糖蛋白E,并应用表达产物对HCV感染患者血清中抗膜蛋白抗体进行检测。方法 将HCVH株E基因片段克隆到杆状病毒转移载体上,转染昆虫细胞,表达包膜糖蛋白,经免疫杂交法鉴定表达产物,并用细胞间接免疫荧光法检测患者血清抗膜蛋白抗体的水平。结果 Western blot显示,表达产物中有多条分子量不同、可与HCV RNA阳性血甭反应的蛋白,细胞免疫荧光染色表明,HCV包膜糖蛋白在细胞浆中表达,用表达产物分别检测HCV患者血清,发现仅11.4%血清中含有膜抗体。结论 成功利用昆虫细胞表达了HCV包膜糖蛋白,为HCV疫苗的研究奠定了基础。     

I-Ad / IgG2b Fc 二聚体融合蛋白的构建表达及鉴定

目的:构建I-Ad / IgG2b Fc 杆状病毒表达载体,使其在Sf9 昆虫细胞内表达。方法:利用RT-PCR 从BALB/ c小鼠淋巴细胞中扩增出I鄄Ad α、I-Ad 茁和IgG2b Fc 目的基因序列,运用重叠PCR 将I-Adα和I-Ad β分别与Fos 和Jun 的亮氨酸拉链序列相连,形成I-Adα和I-Ad βJun;利用酶切位点Xba玉将I-Ad -Fos 与IgG2b Fc 段相连,形成I-Ad –Fos-IgG2bFc 重组序列;分别将I-Ad 琢-Fos-IgG2b Fc 和I-Ad 茁-Jun 插入杆状病毒表达载体pFastBacTM Dual 的PPH 和PP10 两个启动子的下游,构建出重组载体pFastBacTM Dual+[I-Ad / IgG2b Fc];采用PCR 及限制性内切酶对所构建的载体进行鉴定并测序;将pFastBacTMDual+[I-Ad / IgG2b Fc]转入DH10Bac 感受态,使其在转座子的作用下形成重组杆粒病毒Bacmid+[I-Ad / IgG2b Fc],利用脂质体转染试剂将重组表达载体转染至Sf9 昆虫细胞,P4 后大量感染Sf9 昆虫细胞,收集上清通过PEG20000 浓缩可得到I-Ad / IgG2b Fc 二聚体融合蛋白,通过双抗体夹心ELISA 及Western blot 对表达的蛋白进行检测。结果:PCR 及酶切鉴定以及测序结果证实所构建的pFastBacTMDual+[I-Ad / IgG2b Fc]重组载体具有正确的序列;双抗体夹心ELISA 和Western blot 结果表明重组杆粒能成功感染Sf9 昆虫细胞,并且表达的融合蛋白具有正确构象。结论:成功构建pFastBacTM Dual+[I-Ad / IgG2b Fc]杆状病毒表达载体,并在Sf9 昆虫细胞中表达,为研究I-Ad 限制性的T 细胞奠定了基础。     

山羊IL-18成熟蛋白在昆虫细胞/杆状病毒中的表达及其活性分析

目的:在昆虫细胞/杆状病毒中表达山羊白介素18(gIL-18)成熟蛋白,并对其生物学活性进行分析。方法:将编码山羊白介素18(gIL-18)成熟蛋白的基因克隆到杆状病毒转移载体pFastBac Dual上,构建重组质粒pFastBac Dual-gIL18,将该重组质粒转化至DH10Bac感受态细胞,经三重抗性与蓝白斑筛选,获得杆状病毒重组质粒Bacmid-gIL18,在Cellfectin作用下,将Bacmid-gIL18转染昆虫细胞sf9,收获感染后不同时间段的细胞,进行SDS-PAGE、Western blot检测和生物学活性分析。结果:重组蛋白获得正确表达具有良好的免疫原性;生物学活性分析表明,重组蛋白能够促进淋巴细胞增殖、诱导淋巴细胞分泌IFN-γ。结论:用昆虫细胞/杆状病毒系统成功表达了gIL-18成熟蛋白,且具有良好的免疫原性和生物学活性,从而为进一步研究gIL-18作为免疫调节剂和免疫佐剂在生产上的应用奠定了基础。     

人源抗人干扰素α1b全抗体在昆虫细胞中的表达、纯化和鉴定

目的克隆、杆状病毒/昆虫表达系统表达人源抗人干扰素α1b(huIFN-α1b)全抗体基因,获得全抗体蛋白。方法利用PCR技术以gIII-scFv融合表达的噬菌粒质粒为模板,分别克隆了5株抗体基因的轻链和重链;经Nco I/Xho I和Sac I/Hind III分别酶切,与经过相同酶切的pAC-K-CH3载体连接构建了昆虫细胞sf9表达载体pAC-K-CH3-H-L;经测序鉴定正确后,转染进入昆虫细胞sf9进行异源表达。采用免疫荧光(IFA)和ELISA对全抗体的表达和结合情况进行初步鉴定。采用Protein-A亲和层析柱对收获的全抗体IgG蛋白进行纯化,将纯化后的抗体蛋白进行SDS-PAGE电泳和Western blotting鉴定。结果成功扩增了人源抗人干扰素α1b抗体轻链和重链基因;免疫荧光(IFA)鉴定表明5株重组质粒在昆虫细胞sf9表达出了全抗体蛋白,ELISA鉴定表明其中3株与huIFN-α1b特异性结合;经Protein-A亲和层析柱纯化后每升细胞培养上清收获了5~20 mg的蛋白,Western blotting鉴定表明3株纯化的全抗体蛋白和huIFN-α1b特异性结合。结论通过杆状病毒/昆虫表达系统获得了3株人源抗人干扰素α1b(huIFN-α1b)全抗体蛋白。     

HIV-1 膜蛋白基因片段杆状病毒转移载体克隆及重组体的构建

目的：构建编码HIV－1外膜糖蛋白的gp120和gp41基因杆状病毒转移载体，并在昆虫细胞中表达gp120和gp41重组蛋白。方法：从HIV－1基因克隆PNL4－3（NY5／LAV）中应用聚合链反应扩增目的基因gp120和gp41，克隆到PGEM－T载体中，限制性内切酶酶切、DNA序列分析鉴定目的基因，再经EcoRI和BamHI双酶切后定向克隆到杆状病毒转移载体PAC－SecG2T中，再次测序鉴定。通过在sf9昆虫细胞中同源重组、空斑筛选、病毒鉴定、SDS－PAGE、Western-blot对重组病毒和重组蛋白进行分析。结果：限制性内切酶酶切和DNA序列分析表明，gp120和gp41正确克隆到杆状病毒转移载体PACSecG2T中；SDS－PAGE和Eestern-blot结果表明在昆虫细胞中成功表达了HIV外膜糖蛋白gp120和gp41。结论：成功构建了PACSecG2T-gp120和PACSecG25-gp41杆状病毒转移载体，并在杆状病毒－昆虫细胞表达系统中表达了HIV－1 gp120和gp41重组蛋白，Western-blot证明具有较好的免疫原性。