系统性红斑狼疮血管炎相关自身抗原的血清学筛选

目的 通过重组cDNA表达文库的血清学分析(SEREX)技术获得系统性红斑狼疮(SLE)血管炎相关自身抗体所对应自身抗原的cDNA序列.方法 收集SLE病人血清作为筛选血清,采用SEREX技术筛选人微血管内皮细胞(HMVEC)cDNA文库.结果 通过两轮筛选获得11个阳性克隆.通过生物信息学分析发现这11个阳性克隆cDNA序列编码三种不同的自身抗原,分别为SSA、SSB和YB-1.其中YB-1尚未被报道过与SLE血管炎相关.结论 首次发现YB-1与SLE血管炎相关.通过SEREX技术,我们可能找到有助于SLE诊断、治疗和判断预后的自身抗原.     

原发型肝癌组织cDNA文库的构建及抗原基因的筛选

目的 构建人原发型肝癌组织cDNA文库,以SEREX方法从cDNA文库中筛选肝癌抗原基因.方法 采用确诊的原发型肝癌患者新鲜手术切除癌组织构建cDNA文库,测定原始文库滴度,进行蓝白筛选以确定文库的重组率.以肝癌患者的血清,采用血清学方法筛选所构建的cDNA文库,阳性克隆经PCR检测鉴定后进行序列分析.结果 成功构建了混合原发型肝癌cDNA文库经测定原始文库滴度为7.42X106pfu/mL,含3.96×106个重组子,重组率为93%,扩增文库滴度为3.92×109pfu/mL,cDNA插入片段大小在0.5～3.0 kb之间.文库经3轮血清学筛选共获得31个阳性克隆,分别代表了24个独立的cDNA插入片段(抗原基因).其中17个与已知基因高度同源,另外7个基因与GenBank中已知基因的部分同源,其中有3个是新基因.利用SMART技术构建了高质量的人原发型肝癌组织cDNA表达文库,有利于以cDNA文库为基础的进一步的实验研究.结论 应用SEREX技术初步筛选原发型肝癌组织cDNA文库,共得到17个原发型肝癌相关抗原基因,其中有3个是新基因,可能为原发型肝癌的免疫学研究提供新的研究分子.     

SEREX方法鉴定胃癌肿瘤相关抗原基因

目的采用重组cDNA表达文库血清学分析法(SEREX法)寻找胃癌相关肿瘤抗原的编码基因.方法抽提胃癌细胞株SGC7901和1例胃癌组织标本PolyA+RNA,分别构建2个胃癌cDNA表达文库,用含有抗体的胃癌患者血清对2个文库进行筛选,并对筛选所得到的阳性克隆进行测序和生物信息学分析.结果经测定2个原始文库滴度分别为1.6×106pfu和2.5×106pfu,重组率为95%和98%.2个文库经3轮筛选共获得14个胃癌肿瘤相关抗原编码基因,其中一个为未知基因.13个已知基因编码产物包括代谢酶、RNA转录和翻译调控蛋白、蛋白代谢相关分子、自身免疫疾病相关抗原及未知功能蛋白分子.结论胃癌相关肿瘤抗原编码基因的筛选和鉴定,为胃癌的临床诊断和特异性免疫治疗提供了靶点,有助于对胃癌发生机制的深入理解.     

卵巢癌相关抗原cDNA表达文库的筛选

目的：从卵巢癌腹腔积液肿瘤细胞cDNA表达文库中筛选卵巢癌相关抗原。方法：采用SEREX方法从卵巢癌腹腔积液肿瘤细胞构建的cDNA表达文库中筛选阳性克隆。血清学筛选出的阳性克隆与SSH所得的差异表达基因探针进行杂交,最终得到特异性较高的阳性克隆。对这些克隆进行酶切鉴定、测序分析。结果：经二轮血清学筛选和DotBlot杂交,最终得到55个在血清中有相应IgG和（或）IgM自身抗体的卵巢癌差异表达的候选肿瘤抗原克隆。经核苷酸测序、序列分析和相似性比对,结果表明这55个EST片段代表45个基因,可分为6类：①3个与已知卵巢癌相关基因相似的基因,如BARD1等;②15个与其它肿瘤相关基因相似的基因,如TM4SF1等;③6个在一些特殊组织中表达的基因,如FXR1（fragileX-relatedgene1,脆性X染色体相关基因1）等;④8个与一些特殊功能蛋白基因相似的基因,如TIZ;⑤5个与胚胎来源的基因相似的基因,如PKHD1等;⑥8个在GenBank中无相似序列的新基因,如OV-189等。结论：SEREX方法与SSH方法相结合筛选肿瘤抗原的技术路线是一种行之有效的、能筛选具有较高特异性肿瘤抗原的策略。本研究为进一步研究这些抗原在卵巢癌的发生、发展及诊断方面的应用奠定了基础。     

肺癌相关抗原的血清学筛选与鉴定

目的:筛选和鉴定肺癌肿瘤相关抗原,为肺癌早期诊断提供血清学标志物,并为研制肺癌疫苗提供候选抗原.方法:5份异体肺癌患者血清采用重组cDNA表达文库的血清学分析(SEREX)技术对肺癌cDNA表达文库筛选;对阳性克隆插入片段进行测序、生物信息学分析.结果:①筛选出70个阳性克隆,插入片段大小为300～2 800 bp.②测序:70个阳性克隆代表63个不同的基因.③生物信息学分析:1个基因与肺癌的发生、发展关系密切;34个基因报道与细胞的分化、代谢及信号转导等有关系,与其他肿瘤的发生、发展有关;26个基因的生理功能未见文献报道;2个插入片段未发现有同源基因,推测可能为新发现的基因.结论:使用SEREX技术成功鉴定了一组肺癌相关的肿瘤抗原.     

SEREX方法鉴定胃癌肿瘤相关抗原基因

目的采用重组CDNA表达文库血清学分析法(SEREX法)寻找胃癌相关肿瘤抗原的编码基因。方法抽提胃癌细胞株SGC7901和1例胃癌组织标本PolyA+RNA,分别构建2个胃癌cDNA表达文库,用含有抗体的胃癌患者血清对2个文库进行筛选,并对筛选所得到的阳性克隆进行测序和生物信息学分析。结果经测定2个原始文库滴度分别为1.6×106pfu和2.5×106pfu,重组率为95%和98%。2个文库经3轮筛选共获得14个胃癌肿瘤相关抗原编码基因,其中一个为未知基因。13个已知基因编码产物包括代谢酶、RNA转录和翻译调控蛋白、蛋白代谢相关分子、自身免疫疾病相关抗原及未知功能蛋白分子。结论　胃癌相关肿瘤抗原编码基因的筛选和鉴定,为胃癌的临床诊断和特异性免疫治疗提供了靶点,有助于对胃癌发生机制的深入理解。     

鼻咽癌相关肿瘤抗原基因的筛选及鉴定

目的 通过筛选鼻咽癌肿瘤抗原，为鼻咽癌提供一个早期诊断指标；同时为进一步研究鼻咽癌的免疫治疗莫定基础。方法 应用鼻咽癌细胞株异种免疫血清，采用血清学筛选重组cDNA表达文库（SEREX）技术对鼻咽癌cDNA表达文库进行筛选，对阳性克隆测序并进行生物信息学分析。Western Blot检测鼻咽癌及正常人血清中阳性克隆的抗体。结果 共筛选出18个阳性克隆，其中包括MAGE基因、CREM基因、β2-微球蛋白以及核糖体蛋白等已知基因或表达序列标签（EST），另外有6个基因或EST在GenBank数据库中没有同源性，可能是新基因或EST。选取NPC-14、NPC-15、NPC-18克隆进行鼻咽癌患者及正常人群血清的检测，结果显示鼻咽癌患者的阳性率明显高于正常人群。结论 所获得的未知基因产物有可能成为早期诊断鼻咽癌的血清学标志物。     

大鼠睾丸异种抗原的血清学筛选

目的 通过重组cDNA表达文库的血清学分析(SEREX)技术获得来自大鼠睾丸文库有潜在治疗价值的异种同源抗原的cDNA序列。方法 将人卵巢癌细胞株免疫兔后收集的抗血清作为筛选血清,采用SEREX技术筛选大鼠睾丸cDNA文库。结果 通过两轮筛选获得10个阳性克隆。通过生物信息学分析认为这10个阳性单克隆cDNA序列编码7种不同的蛋白,其中OV-2、OV-4为肿瘤相关序列,OV-6、OV-7为编码未知蛋白的序列。结论 用异种免疫血清筛选异种同源肿瘤抗原拓宽了SEREX技术的应用范围,是一种行之有效的方法。     

应用SEREX技术筛选与鉴定鼻咽癌相关抗原

目的:应用SEREX技术筛选与鉴定鼻咽癌相关抗原,为鼻咽癌的早期诊断、免疫治疗和预后监测提供候选的生物学指标和理论基础。方法:从鼻咽癌新鲜活检组织中提取mRNA,构建cDNA表达文库。用鼻咽癌患者的血清筛选所构建的cDNA表达文库,获得的阳性克隆经扩增后提取噬菌粒DNA进行测序。所得序列与GenBank数据库中已知基因进行同源比较,分析其生物学特性。结果:所构建的cDNA原始文库含1×106个重组体,蓝白斑试验显示重组率为93%。用鼻咽癌血清对表达文库进行筛选,共获得21个阳性克隆,分别代表14个不同的cDNA插入片段。12个插入片段的DNA序列分别与基因库上的基因有不同程度的同源性,其中6个基因与鼻咽癌或其它肿瘤的发生、发展关系密切;另6个基因的生理功能未见文献报道。2个插入片段未发现有同源基因,推测可能为新发现的基因。结论:SEREX技术是目前筛选肿瘤抗原最简便、有效的手段之一。本文研究发现的抗原将为鼻咽癌的研究提供进一步的理论基础。     

中华眼镜蛇毒腺cDNA表达文库的建立和分析

目的: 为研究开发眼镜蛇毒药用基因工程产品,筛选克隆及表达相关药用功能基因,构建中华眼镜蛇毒腺cDNA表达文库. 方法:一步法提取总RNA,Oligo(dT)纤维素层析柱纯化mRNA,逆转录PCR合成双链cDNA,分级分离除去小片段后,收集大于500 bp的cDNA片段,取10 ng cDNA与质粒载体pSPORT1连接、转化. 结果:获得克隆总数为2×105的眼镜蛇毒腺cDNA表达文库,重组率97%. 利用PCR技术从该文库扩增了心脏毒素-3(CTX-3)和磷脂酶A2(PLA2)基因的cDNA. 通过对文库克隆的序列测定和初步生物信息学分析,获得24个中华眼镜蛇毒腺EST序列. 结论:所建立的毒腺cDNA表达文库质量较高,可用于进一步筛选、克隆蛇毒药用功能新基因.     

人食管癌细胞cDNA表达文库的构建和鉴定

目的 构建人食管癌细胞cDNA噬菌体表达文库。方法 从食管癌细胞中提取总RNA,利用磁珠吸附法分离其中的mRNA,逆转录合成cDNA第一链,再通过碱基互补配对原则合成第二链,对双链cDNA进行末端修饰,连接EcoRⅠ适配子,磷酸化EcoRⅠ适配子5′端,除去不合要求的cDNA片段,将符合要求的与载体（噬菌体T7 Select10-3b）连接,然后进行体外包装建成初步的cDNA文库,并对文库进行鉴定。结果 食管癌细胞cDNA原始表达文库的滴度为2.01×106 pfu/mL,重组率高达100%,插入片段的大小范围在300～1 500 bp之间。结论 本实验成功构建了人食管癌T7噬菌体展示cDNA表达文库,并经过了初步鉴定,为下一步利用重组表达cDNA克隆的血清学分析技术（SEREX技术）鉴定食管癌相关抗原奠定基础。     

曲古霉素A诱导人乳腺癌细胞MCF-7凋亡反义cDNA文库的构建和效应基因的初步筛选

目的 构建曲古霉素A诱导人乳腺癌细胞凋亡反义cDNA文库,以筛选曲古霉素A抗肿瘤的效应基因.方法 收集经曲古霉素A处理不同时间点的人乳腺癌细胞MCF-7,提取poly(A)+RNA,将逆转录合成的cDNA反向插入载体PCEP 4中以构建反义cDNA文库.文库DNA随机转入人宫颈癌细胞HeLa中,以转染PCEP 4卒载体细胞为对照组,用200 nmol/L曲古霉素A和200μg/ml潮霉素同时筛选,至对照组细胞全部死亡,文库组仍有存活细胞时停止曲古霉素A筛选.存活克隆扩增后提取Hirt DNA并转化感受态细胞,获得的转化克降扩增后进行酶切鉴定并测序,得到多个EST片段,经生物信息学分析后选择感兴趣的EST片段进行初步功能验证.结果 构建的反义cDNA文库含有2 × 106重组子,重组效率>90%;经DNA测序和生物信息学分析提示第27号存活克隆是锌转运蛋白LIV1,该克隆在功能验证时表现出对曲古霉素A非常显著的抵抗效应.结论构建的反cDNA文库容量较大,质量较高;基因LIV1可能是曲古霉素A抗肿瘤的效应基因之一.     

Balb／c小鼠胚胎皮肤无瘢痕愈合相关基因cDNA文库构建

目的筛选、克隆Balb／c成年小鼠和小鼠胚胎皮肤的特异表达基因,构建成年小鼠和小鼠胚胎皮肤差异表达的cDNA文库。方法应用Trizol法抽提样本的总RNA,进一步获得mRNA,结合PCRcDNA合成法将合成的双链cD-NA产物与载体连接构建cDNA文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,菌液进行PCR扩增,筛选有插入片段cDNA克隆。结果成功地构建了Balb／c小鼠皮肤无瘢痕愈合相关基因差异表达的cDNA文库,从中挑取85个克隆进行菌液PCR分析,结果显示57个克隆得到300—9Kp插入片段。结论通过RT—PCR方法并合成双链cDNA是一种自微量总RNA中构建高特异性的差异表达cDNA文库的有效方法。cDNA文库的构建有助于筛选、克隆小鼠胚胎皮肤无瘢痕愈合相关的特异表达基因。     

人肝脏高凝状态相关基因的筛选

目的 筛选人肝脏高凝状态（PTS）相关基因的全长cDNA序列。方法 采用差异筛选法对本室建立的PTS大鼠肝脏差异表达基因消减cDNA文库进行筛选；以获得的差异cDNA克隆为模板，采用PCR方法扩增目的片段；以PCR产物作探针，用噬菌斑原位杂交法筛选人肝脏cDNA文库，经初筛、二筛和三筛后，将获得的阳性克隆转入E．coli BM 25．8，使λTripIEx环化成质粒pTripIEx，经酶切鉴定后进行DNA测序。结果 从人肝脏cDNA文库中筛选获得4条全长cDNA序列，经序列测定及生物信息学分析发现，其中3条的表达产物分别为纤维蛋白原、纤维蛋白原相关蛋白、10号染色体开放阅读框架104mRNA；另1条与氨基甲酰磷酸合成酶1同源。结论 以PTS大鼠肝脏差异表达基因cDNA为探针，从人肝脏cDNA文库中筛选获得4条PTS相关cDNA全长序列。     

大肠癌抗原基因的筛选与初步分析

目的 筛选鉴定大肠癌抗原基因,并进行生物信息学的初步分析。方法 采用自体或异体大肠癌患者血清。应用SEREX方法对大肠癌cDNA噬菌体表达文库进行免疫筛选。阳性克隆噬菌体在扩增、提取、纯化DNA后,用PCR方法和EcoRⅠ、HindⅢ双酶切鉴定cDNA片段的大小。阳性克隆eDNA插入pUCm-T载体测序。序列生物信息学分析采用NCBI的All GenBank＋EMBL＋DDBJ＋PDB Sequences Database进行BLAST基因比对分析。结果 筛选出11个阳性克隆,cDNA片段大小分别为1100、1300、1000、2000、1200、1200,700、900、600、1200和1000bp,代表9个抗原基因,7个与已知基因同源。有3个阳性克隆为同1个基因片段,与干扰素诱导的跨膜蛋白．1基因同源．具有抗增殖作用：另6个阳性克隆分别与不同的基因同源,分别是：BAC clone RP11-453E17“肿瘤解剖计划”基因,功能尚不清楚;软骨．毛发发育不良区基因,发生软骨-毛发发育不良综合征;入5号染色体克隆的序列,有插入突变,功能尚不清楚;类似抗肿瘤坏死因子α抗体的轻链Fab段基因,与IgG1抗体的y链（重链）和k链（轻链）的编码和调控其生物功能有关,可能与肿瘤的生长有关;β2微球蛋白的mRNA,与肿瘤细胞的增殖有关;醛缩酶A基因,异常表达可能促进肿瘤细胞的增殖;尚有2个阳性克隆的cDNA序列没有同源性,功能有待进一步研究。结论 用SEREX方法筛选大肠癌cDNA表达文库,可直接获得有价值的大肠癌抗原基因,对大肠癌发病机制的研究以及探讨早期诊断方法有重要意义。     

紫外线致弱尾蚴免疫兔血清筛选血吸虫成虫cDNA文库

目的 :寻找照射致弱尾蚴中起免疫保护作用的抗原分子 ,为血吸虫病疫苗研究提供新的候选抗原。方法 :用紫外线照射致弱尾蚴免疫兔血清筛选日本血吸虫 (Schistosomajaponicum ,Sj)成虫cDNA文库 ,并对阳性克隆的插入基因片段进行PCR扩增及测序分析。结果 :经三轮筛选 ,获 10个阳性克隆 ,其插入的SjcDNA片段大小为 1 5～1.8kb。初步测序获 5个部分序列 ,其中 2个序列分别与Sj动力蛋白轻链 5 (DLC 5 )及Sj线粒体基因明显同源 ,其余 3个序列为未知的新基因片段。结论 :获得的阳性克隆插入基因片段可能为编码抗日本血吸虫感染的抗原基因