人肝再生增强因子相互作用蛋白基因的克隆

目的：寻找与人肝再生增强因子(hALR)相互作用的蛋白质．探讨其在肝再生过程中的分子生物学机制。方法：采用酵母双杂交系统，以hALR作诱饵蛋白筛选预转化的人肝cDNA文库，对阳性克隆进行生物信息学分析。结果：筛选出6组与hALR具有特异性相互作用的蛋白基因，分别是：血清白蛋白、金属硫蛋白、Na／K-ATPase、硒蛋白P和两个未知功能基因的cDNA序列。结论：初步克隆了与hALR相互作用蛋白基因，为以后深入研究这些蛋白质与hALR之间的相互作用，进一步揭示hALR的作用机制奠定了基础。     

人era基因酵母双杂交诱饵载体的构建及其激活作用的检测

ｅｒａ基因是细菌生存繁殖所必需的重要基因,与细胞周期和细胞分裂有关。ｅｒａ基因首先在大肠杆菌被发现,由于其编码的氨基酸序列与人及酵母的ＲＡＳ蛋白有部分相似之处,故命名为Ｅ．ｃｏｌｉＲＡＳ－ｌｉｋｅｅｒａ基因１。ｅｒａ基因不仅广泛存在于原核生物中,而且在真核生物如蠕虫、小鼠和人的组织中都发现有与细菌ｅｒａ高度同源的基因存在２－４。人ｅｒａ基因的全长ｃＤＮＡ于１９９８年被克隆,与原核ｅｒａ基因具有很高的同源性。人ＥＲＡ蛋白与大肠杆菌ＥＲＡ蛋白的氨基酸序列有３０％相同,两者的相似性为５…     

抗人肝再生增强因子单克隆抗体的研制

目的　利用纯化的重组人肝再生增强因子(hALR)制备抗hALR的单克隆抗体,建立hALR的检测方法。方法 采用杂交瘤技术制备单克隆抗体,经ELISA和免疫印迹证明其特异性。结果获得了4株分泌抗hALR特异性抗体的杂交瘤 细胞系;无血清培养液效价为1×10-2,腹水效价为1×10-5;亚类鉴定表明2株单克隆抗体为IgGl,另2株为IgG2b;免疫印迹 显示抗体结合抗原的分子量与hALR相符,为特异性抗hALR抗体。结论通过杂交瘤技术,获得了抗hALR的单克隆抗体 为以后的工作奠定了基础。     

肝再生增强因子的研究进展

肝再生增强因子的研究进展@黄志刚$邯郸医学高等专科学校医学检验系!河北邯郸056002 @刘殿武$河北医科大学公共卫生学院!河北石家庄050017肝再生增强因子;;基因克隆;;肝再生~~     

PTA1酵母双杂交载体的构建

血小板／Ｔ细胞活化抗原１（ｐｌａｔｅｌｅｔａｎｄＴｃｅｌｌａｃｔｉｖａｔｉｏｎａｎｔｉｇｅｎｌ,ＰＴＡ１）是一种表达于活化Ｔ细胞、ＮＫ细胞及血小板表面的白细胞分化抗原和粘附分子,于１９９７年将其基因克隆成功〔１〕,又被称为ＤＮＡＸ辅助分子１（ＤＮＡＸａｃｃｅｓｓｏｒｙｍｏｌｅｃｕｌｅ１,ＤＮＡＭ１）〔２〕。ＰＴＡ１参与血小板的活化和混合淋巴细胞反应中杀伤性Ｔ细胞的诱导。序列分析表明,ＰＴＡ１是一种穿膜糖蛋白,全长３１８ａａ。其中胞膜外区２３２ａａ,包括信号肽和２个Ｉｇ样结构域,穿膜区２５ａａ…     

应用酵母双杂交系统发现hALR与Na,K-ATPase间的相互作用

目的:采用酵母双杂交系统寻找与人肝再生增强因子(hALR)相互作用的蛋白质, 探讨ALR的作用机理。方法: 构建hALR诱饵质粒pGBKT7-hALR, 醋酸锂法转化AH109酵母菌, 转化菌在SD/-Trp-His培养基上培养及滤纸法β一半乳糖苷酶活性检测排除自身激活作用后, 与人肝cDNA文库质粒预转化的酵母菌Y187进行接合试验, 接合产物在QDO培养基上筛选, 阳性克隆进一步在含X-α-Gal的QDO平板上鉴定, X-α-Gal活性呈阳性的克隆, 进行PCR及酶切鉴定排除完全相同克隆, 进一步进行回交试验排除假阳性, 对阳性克隆进行序列测定和生物信息学分析。结果:得到数个阳性克隆, 序列分析结果表明其中1个阳性克隆是Na⁺, K⁺-ATPaseβ亚基部分基因, 长669bp, 3'端非编码区224bp, 编码区长445bp, 编码Na⁺, K⁺-ATPaseβ亚基C端的147个氨基酸残基。结论:应用酵母双杂交系统筛选出Na⁺, K⁺-ATPase与hALR具有相互作用。     

人TLR4胞外区cDNA克隆及其酵母表达载体的构建

研究表明：TLR4是哺乳动物LPS作用的受体，介导LPS的生理和病理效应[1～3］。有关研究取得明显的进展，但对于其识别的配体目前还未阐明。新近发现并广为应用的酵母双杂交技术给上述研究提供了新的机遇。因此，本研究克隆TLR4胞外区cDNA，并构建酵母双杂交系统的靶基因，为进一     

抗人肝再生增强因子抗体识别部位的确定

目的：确定抗人肝再生增强因子单克隆抗体所识别的抗原表位。方法：采用蛋白质预测软件预测人肝再生增强因子的抗原决定簇,根据预测结果合成肽进行竞争ELISA验证单克隆抗体所识别部位。结果：人肝再生增强因子的第6～15,68～80以及105～112位氨基酸残基是其抗原表位。结论：采用计算机软件预测,并在此基础上经合成肽验证的方法是一种可靠的抗原表位确定方法。     

BI-1作为酵母双杂交系统诱饵的载体构建

目的 用人BI-1完整编码区构建酵母双杂交系统的诱饵蛋白载体,排除自身激活作用,并证实其能否在酵母细胞中的表达,验证它能否用于酵母双杂交系统。方法 以人正常肺组织cDNA为模板,扩增BI-1完整编码区,经EcoRI、SalI双酶切后克隆到酵母双杂交系统诱饵载体pGBKT7上,构建诱饵蛋白载体pGBKT7-BI-1,转化酵母细胞,通过β-半乳糖苷酶活性分析验证有无自激活,Western验证其表达。结果 DNA测序显示BI-1编码区内无突变,β-半乳糖苷酶活性分析显示转入pGBKT7-BI-1和阴性对照的酵母菌落没有激活报告基因LacZ,而阳性对照菌落呈现蓝色。结论 含有BI-1完整编码区的诱饵载体不存在自身激活作用,并能在酵母细胞中表达BI-1蛋白,能够应用于酵母双杂交系统筛选相互作用蛋白。     

人肝再生增强因子单克隆抗体的制备:以非纯化的大肠杆菌表达抗原筛选杂交瘤

目的 :利用杂交瘤技术、以非纯化的大肠杆菌表达重组蛋白作为筛选抗原 ,制备小鼠抗人肝再生增强因子(hALR)的单克隆抗体。方法 :用实验室纯化的重组hALR 硫氧环蛋白融合蛋白免疫BALB c小鼠 ;小鼠脾细胞与SP2 0骨髓瘤细胞融合后经HAT选择培养基筛选杂交瘤 ;以重组质粒pQE30 hALR与空质粒pQE30在大肠杆菌中诱导表达后的细菌裂解产物作为筛选抗原和对照抗原 ,用ELISA方法筛选能分泌抗hALR单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞克隆 ;进一步以ELISA方法和免疫印迹方法检测该杂交瘤细胞产生的抗体对真核细胞表达的重组hALR及人体血清中天然hALR的反应性。结果 :成功筛选出一株能稳定分泌抗hALR单克隆抗体的杂交瘤细胞 ;其产生的抗体能对真核细胞表达的重组hALR及人体血清中天然的hALR发生特异的抗原抗体反应。结论 :大肠杆菌表达的重组蛋白在以空质粒表达产物作为对照下 ,不经过任何纯化步骤也能够用于单克隆抗体制备中的杂交瘤筛选 ;hALR单克隆抗体为深入研究hALR提供了研究手段。     

酵母双杂合系统AD端阴离子交换蛋白C-末端表达质粒的构建

利用PCR方法，从阴离子交换蛋白1（AE1）全长cDNA中扩增出约350bp c末端cDNA片段，测序后将其克隆至pGADT7载体上，用醋酸锂法构建好的pADT7-AE1-c末端转染酵母菌HA109，观察其在选择性培养基上的表达情况。结果表明，获得了530bp AE1c－末端cDNA,pGADT7-AE1-c末端对酵母无毒性，不能激活检测基因，可作为酵母双杂合系统中的靶基因。     

酵母双杂交系统用于TPO分子间相互作用的研究酵母双杂交系统用于TPO分子间相互作用的研究

目的 探索促血小板生成素（Thrombopoietin,TPO）分子间相互作用及其存在位置。方法 构建了含有不同TPO区段的酵母双杂交系统融合表达质粒,转化酵母菌SFY526,分析β－关乳糖苷酶活性以推测TPO分子间的相互作用。结果 全长TPO－pGBT9与全长TPO－pGAD424、全长TPO－pGAD424与TPO（N）－pGBT9与TPO（N）－pGAD424之间有相互作用,全长TPO－pGBT9与TPO（C）－pGAD424、TPO（N）－pGBT9与TPO（C）－pGAD424、TPO（C）－pGBT9与TPO（C）－pGAD424之间无相互作用。结论 自然状态下TPO在N端结构区可能存在相互作用,C端结构域不参与此过程。     

酵母双杂合系统BD端血型糖蛋白A 表达质粒的构建

目的:获得血型糖蛋白A(GPA)cDNA片段,并构建酵母双杂合BD端表达质粒。方法:利用RT-PCR方法,从K562细胞mRNA中扩增GPAcDNA片段,约410bp。测序后将其克隆至pbridge载体上。用醋酸锂法将构建好的pbridge-GPA转染酵母菌AH109,观察其在选择性培养基上的表达情况。结果:克隆到的410bpGPAcDNA编码的氨基酸序列基本与公布序列相同。pbridge—GPA转染酵母菌后,在SD/Gal/—His/Ura培养基上出现1mm大小白色菌落。结论:获得了血型糖蛋白AcDNA克隆,pbridge—GPA对酵母无毒性,不能激活检测基因,可作为酵母双杂合系统中的靶基因。     

酵母双杂交随机环肽库的构建、鉴定与扩增

目的 :构建含 16个氨基酸的酵母双杂交随机环肽库。方法 :以PCR扩增人工合成的随机DNA模板 ,经BamHI和EcoRI酶切后 ,克隆入酵母表达质粒pGADT7GH ,构建酵母双杂交随机环肽库并检验其库容及随机性 ,扩增、抽提并纯化酵母双杂交环肽库质粒。结果 :构建了酵母双杂交随机环肽库 ,库容为 1.2 8× 10 7,氨基酸分布与理论频数无显著差异 ,并扩增获得大量高纯度的环肽库质粒。结论 :成功地构建酵母双杂交随机环肽库 ,并获得大量高纯度的环肽库质粒。     

应用酵母双杂交系统筛选E2F1相互作用蛋白

目的:应用酵母双杂交系统从人正常胃黏膜细胞的cDNA文库中筛选E2F1转录因子的相互作用蛋白。方法:以pGBKT7-E2F1为诱饵质粒筛选人正常胃黏膜细胞的cDNA文库,得到阳性克隆,反复验证,并对验证后的阳性克隆进行测序及同源性分析。结果:从人正常胃黏膜细胞的cDNA文库中筛选得到20个阳性克隆,经测序和同源性分析,筛除假阳性克隆,最终得到18个不同的候选基因序列。其中,17个为可知基因序列,它们分别是:组织蛋白酶B、SIVA1、干扰素调节因子7、鸟苷酸激酶1、ATP酶抑制因子1、核糖体蛋白SA、纤溶酶原激活物抑制剂1 mRNA结合蛋白、精氨琥珀酸合酶1、卵泡抑素类似物3、金属硫蛋白2A、内质网钙结合蛋白1、WNT1可诱导信号通路蛋白2、CDC42 效应蛋白1、可溶性半乳糖凝集素结合蛋白1、中胚层发育候选2、外切酶体成分7和含EGF腓骨蛋白样胞外基质蛋白 1,尚有一未知基因片段。结论:应用酵母双杂交系统成功筛选出18种E2F1相互作用蛋白,为进一步探讨E2F1影响胃癌细胞生物学行为的分子机制奠定了基础。     

Expression of augmenter of liver regeneration (ALR) in human liver cirrhosis and carcinoma

AIMS: To determine the expression of a protein termed augmenter of liver regeneration (ALR), recently found to have a specific and beneficial effect on the process of liver regeneration in normal and diseased human liver. METHODS AND RESULTS: ALR expression in normal and cirrhotic human livers with various underlying diseases as well as in tissue samples of hepatocellular carcinoma (HCC) and cholangiocellular carcinoma (CCC) was analysed by immunohistochemistry and quantitative reverse transciptase-polymerase chain reaction (RT-PCR). Expression analysis of ALR in total liver protein extracts by Western blotting showed mainly dimeric ALR protein. Immunohistochemically, cytosolic and perinuclear immunosignals were found in hepatocytes and cholangiocytes in normal, cirrhotic or cancerous liver tissue and only weak signals in some endothelial cells in normal livers. Quantitative mRNA analysis revealed significantly increased ALR expression in cirrhosis compared with normal liver tissue. In HCC and CCC ALR mRNA expression was also significantly enhanced compared with normal liver tissue, but expression levels did not differ from the matching non-neoplastic tissue in the same patient. CONCLUSIONS: The findings suggest an important role for ALR in hepatocellular regeneration in liver cirrhosis as well as in hepatocarcinogenesis and therefore its potential value in the clinical diagnosis of hepatic cirrhosis and cancer.     

酵母双杂交技术筛选小鼠脑cDNA文库中鼠巨细胞病毒即刻早期蛋白M122相互作用蛋白的研究

目的 应用酵母双杂交技术筛选小鼠脑cDNA文库中与鼠巨细胞病毒即刻早期蛋白M122相互作用的宿主因子,为进一步研究巨细胞病毒的致病机制奠定实验基础.方法将诱饵质粒pGBKT7-M122转化酵母菌AH109,Western blot检测诱饵蛋白在酵母细胞中的表达.阳性重组AH109菌株与小鼠脑cDNA文库进行配合,在色氨酸、亮氨酸、组氨酸和腺嘌呤缺陷培养基(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade)和铺有Ⅹ-α-gal的SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade平板上进行筛选,提取阳性酵母菌质粒,转化大肠杆菌后提取质粒测序,对测序结果进行序列比对和分析.将阳性文库质粒与诱饵质粒共同转化酵母AH109感受态细胞,重新验证其在酵母中的相互作用,同时阳性文库质粒与空载体pGBKT7亦被用同样的方法转入AH109感受态细胞,以排除阳性文库质粒的自激活作用.结果筛选出与M122蛋白相互作用的21种已知基因编码的蛋白质和3种未知基因编码的蛋白,其中21种已知蛋白分别为:突触融合蛋白8(syntaxin 8,Stx8)、磷酸葡萄糖变位酶2(phosphoglucomutase 2,Pgm2)、Shaker型电压依赖性钾通道的β1亚单位(potassium voltage-gated channel,shaker-related subfamily,beta member 1,Kcnab1)、19型胶原蛋白(collagen,type ⅪⅩ,alpha 1,Col19a1)、古蛋白1(archain 1,Arcn1)、胞嘧啶核苷酸激酶(cytidylate kinase,Cmpk)、热休克蛋白DnaJ同系物A亚家族成员1[DnaJ(Hsp40)homolog,subfamily A,member 1,Dnaja1]、Na+、K+ATP转运酶β3亚单位(ATPase,Na+/K+ transporting,beta 3 polypeptide,Atp1b3)、SH3结构域GRB2样相互作用蛋白1[SH3-domain GRB2-like(endophilin)interacting protein 1,Sgip1]、锚蛋白重复域17(ankyrin repeat domain 17,Ankrd17)、无义介导的mRNA 降解因子Smg-7同系物(Smg-7 homolog,nonsense mediated mRNA decay factor,Smg7)、精子相关抗原9(sperm associated antigen 9,Spag9)、FK506结合蛋白1A(FK506 binding protein 1a,Fkbp1a)、MYST组蛋白乙酰转移酶4[MYST histone acetyltransferase(monocytic leukemia)4,Myst4]、透明质酸和蛋白多糖连接蛋白1(hyaluronan and proteoglycan link protein 1,Hapln1)、自噬相关蛋白3(autophagy-related 3,Atg3)、精氨酸/色氨酸富集的剪切因子5(splicing factor,arginine/serine-rich 5,Sfrs5)、C3HC型锌指蛋白(zinc finger,C3HC-type containing 1,Zc3hc1)、硫氧还蛋白相关的跨膜蛋白1(thioredoxin-related transmembrane protein 1,Txndc1)、接头蛋白复合物AP-1亚单位(adaptor protein complex AP-1,gamma 1 subunit,Aplg1)和Cul1蛋白(cullin 1,Cul1).回返验证实验进一步证实这些蛋白与M122蛋白能够在酵母细胞AH109发生相互作用,但Aplg1和Cul1被证实具有自激活作用.结论 筛选到的其中19种已知基因编码的蛋白可能与巨细胞病毒的致病机制相关,但仍需进一步的验证.     

应用酵母双杂交技术筛选与RANK蛋白新基序IVVY相互作用的蛋白

目的: 应用酵母双杂交技术筛选小鼠巨噬细胞中与核因子κB受体激活因子(RANK)蛋白上新基序IVVY相互作用的蛋白,以探寻RANKL/RANK系统中介导破骨细胞形成的RANK下游新信号转导蛋白。方法: 应用GAL4酵母双杂交系统3,构建仅包含编码新基序⁵³⁵IVVY⁵³⁸ 的一小段RANK的cDNA片段为诱饵质粒pGBKT7-IVVY,并与巨噬细胞cDNA文库质粒pGADT7-library共转化AH109酵母,筛选与RANK蛋白新基序IVVY相互作用的蛋白,通过回复性杂交实验验证其可靠性,并对阳性克隆进行测序和基因同源性分析。结果: 筛选出4个可能与IVVY基序有相互作用的蛋白,包括Ring1和YY1结合蛋白(RYBP)、ATP结合盒、E2F转录因子和热休克蛋白8,其中表达RYBP的阳性克隆出现频率高、速度快。结论: 应用酵母双杂交技术成功地筛选出4个可能与IVVY基序相互作用的候选蛋白,其中RYBP可能性最大。