SPA基因启动子的克隆及转录靶向活性分析

目的：克隆大鼠肺表面活性蛋白A（SPA）基因启动子并构建该启动子的荧光报告系统,探讨该启动子的活性及转录靶向性，为进一步研究SPA 基因的表达调控机制和探讨靶向性基因治疗奠定基础。方法:①从GenBank中获取大鼠SPA 基因序列，对其上游基因组序列进行计算机生物信息学分析，推断其上游序列约163bp的区域具有启动子功能。②利用PCR技术扩增SPA 基因上游启动子序列,将其亚克隆入pGL3-basic 中,构建pGL3-SPA 质粒，将其亚克隆于pGL3-control 中，构建pGL3-SPA-enhancer 质粒。③将构建pGL3-SPA质粒、pGL3-SPA-enhancer 质粒、pGL3-control质粒和pGL3-basic 质粒分别与内参质粒pRL-TK共转染入A549细胞和H441细胞, 用双荧光素酶报告系统检测该质粒在两种细胞中的荧光素酶活性表达。 结果:酶切及测序结果均证实成功克隆了SPA基因启动子序列,并已将该序列正确插入到荧光素酶报告基因系列载体中。重组的pGL3-SPA-enhancer 质粒、pGL3-SPA质粒转染H441 细胞后可以检测到荧光素酶的高表达。结论:成功构建了含有SPA 基因启动子序列的荧光素酶基因报告系统,证实了它在高表达SPA蛋白的细胞中有较高的转录活性， 为下一步研究SPA 基因功能及其转录调控以及探讨基因治疗的靶向性奠定了基础。     

BRCA2基因启动子的克隆和分析

目的构建BRCA2基因启动子的荧光素酶报告质粒,为BRCA2基因调控研究提供基础。方法采用高保真Taq聚合酶,从正常人外周血中扩增出BRCA2启动子并将其插入质粒中。通过基于PCR的定点突变方法在多态性位点rs3092989(-254A/G)获得含-254G等位基因的序列。亚克隆BRCA2启动子片段至pGL3-basic报告基因载体中,构建含BRCA2启动子的重组报告质粒。转染HeLa细胞,评价启动子活性以及-254A/G多态性位点对活性的影响。结果酶切和直接测序法证实所构建质粒含有pGL3-basic及BRCA2基因启动子序列,扩增的含-254A和-254G的BRCA2启动子序列正确。构建的报告基因具有启动子活性,与pGL3-basic质粒相比较,BRCA2启动子的相对荧光单位增加了413倍。rs3092989(-254A/G)多态位点未明显影响启动子活性。结论 BRCA2转录起始位点上游序列具有较强的启动子活性。成功克隆BRCA2启动子并引入相关突变,可为后续的基因转录调控研究奠定基础。     

HBx蛋白对IGF-II基因P4启动子活性的影响

目的:构建乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)表达载体pEYFP-C1-X及人IGF-II基因P4启动子调控的荧光素酶报告载体pGL3-P4,并初步探讨HBx对IGF-II基因P4启动子活性的影响。方法:应用基因重组技术,将HBx基因及P4启动子分别克隆入pEYFP-C1及pGL3-Basic载体,构建重组质粒pEYFP-C1-X及pGL3-P4;将pEYFP-C1-X稳定转染HepG2细胞,进行G418筛选;将体外甲基化pGL3-P4瞬时转染HepG2-EYFP-X细胞,采用双荧光素酶实验检测P4启动子的转录调控活性。结果:(1)经酶切及测序鉴定,重组质粒中的目的片段HBx和P4启动子的大小分别为465bp及1246bp,序列与GenBank数据库一致。(2)获得了表达HBx的细胞系HepG2-EYFP-X,在荧光显微镜下呈现黄绿色荧光。(3)转染HepG2-EYFP-X细胞的甲基化P4启动子的荧光素酶活性明显高于其对照细胞HepG2-EYFP(P0.01)。结论:HBx可增加P4启动子的转录活性。     

乙型肝炎病毒剪接特异性蛋白对病毒自身调控序列的影响

目的 研究双剪接型2.2 kb乙型肝炎病毒(HBV)剪接变异体特异性蛋白TPds对病毒自身调控序列的影响.方法 PCR扩增6种HBV启动子/增强子序列,以Kpn Ⅰ及Xho Ⅰ位点克隆于pGL3-basic,分别构建萤火虫荧光素酶重组报告载体pGL3-BCP(含HBV基本核心启动子)、pGL3-CP1601(含增强子Ⅱ的核心启动子)、pGL3-XP(X基因最小启动子)、pGL3-XP1071(含增强子Ⅰ的X基因启动子)、pGL3-SP1(表面抗原大蛋白基因启动子)、pGL3-SP2(表面抗原中蛋白基因启动子).以FuGENE6将TPds表达载体pcDNA3.1/HisC-TPds或空白载体pcDNA3.1/HisC分别与6种HBV启动子/增强子报告载体共转染Huh7细胞,转染后48 h裂解细胞并检测胞内萤火虫荧光素酶活性,实验重复5次,数据以SPSS11.5软件分析.结果 在一定的质量比值范围内,与pcDNA3.1/HisC空白载体对照相比,pcDNA3.1/HisC-TPds分别与pGL3-CP1601、pGL3-XP1071、pGL3-SP1、pGL3-SP2共转染后,Huh7细胞内萤火虫荧光素酶活性增高,而pcDNA3.1/HisC-TPds分别与pGL3-BCP或pGL3-XP共转染后,胞内荧光素酶活性无变化.结论 TPds蛋白可反式激活HBV启动子SP1、SP2和增强子Ⅰ、Ⅱ,对基本核心启动子和X基因最小启动子无影响.     

人前列腺特异性膜抗原基因启动子/增强子表达载体的构建及组织特异性鉴定

目的：构建前列腺特异性表达的人前列腺特异膜抗原（PSMA）基因启动子/增强子表达载体，并进行组织特异性鉴定。 方法：从人外周血中提取基因组DNA，采用PCR技术分别扩增PSMA上游 1 175 bp 的启动子序列，及第三内含子中258 bp的增强子序列，将两个序列定向克隆至荧光素酶报告基因表达质粒pGL3-Basic，构建前列腺特异性表达载体pGL3-PSMP-PSME。将构建载体用脂质体分别转染前列腺癌PC-3M细胞株及4种非前列腺癌细胞株，48 h后通过检测荧光素酶表达活性，确定克隆的启动子及增强子的活性及其组织特异性表达活性。结果：构建的pGL3-PSMP-PSME质粒经酶切及DNA测序分析鉴定，证实克隆片段的大小、插入方向及其序列正确。细胞转染结果显示， pGL3-PSMP-PSME在PC-3M细胞株中表达活性明显高于其它4种非前列腺癌细胞株。结论：构建的前列腺表达载体具有较高的组织特异性, 为进一步研究PSMA调控序列驱动治疗基因进行前列腺癌的靶向生物治疗奠定了基础。     

阴道毛滴虫LAG1基因启动子区克隆及分析

本研究旨在克隆并分析阴道毛滴虫LAG1基因启动子,为进一步研究在细胞衰老过程中LAG1基因的转录调控提供实验资料。预测启动子所在区域,用PCR技术扩增启动子区序列,并分别克隆入荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic及增强型绿色荧光蛋白报告基因载体pEGFP-1,用脂质体介导的方法瞬时转染EC109细胞,然后测定荧光素酶表达活性及观察绿色荧光蛋白的表达情况。结果表明在构建的6种荧光素酶报告基因表达体系及2种增强型绿色荧光蛋白报告基因表达体系中,表达载体pGL3-455(-455~ 55bp)、pGL3-417(-417~ 55bp)、pGL3-280(-280~ 55bp)、pGL3-202(-202~ 55bp)、pGL3-81(-81~ 55bp)的荧光素酶表达活性相近,均明显高于表达载体pGL3-47(-47~ 55bp)荧光素酶表达活性,而pGL3-47表达载体荧光素酶表达活性极低,与阴性对照活性相近,提示-47~ 55bp区无启动子活性。绿色荧光蛋白的表达情况也类似,pEGFP-81(-81~ 55bp)有明显的绿色荧光蛋白表达,而pEGFP-47(-47~ 55bp)和空载体pEGFP-1未见表达。因此-81~-47bp区域含有阴道毛滴虫LAG1基因转录所必需的基本启动子序列。     

人ADAM17启动子荧光素酶报告质粒的构建与鉴定

目的构建人去整合素-金属蛋白酶17(ADAM17)启动子的荧光素酶报告质粒,对不同位点进行定点突变,分析其转录活性。方法通过生物信息学分析ADAM17启动子区域的叉头转录因子M1(FoxM1)结合位点,以人胃癌细胞系MGC-803基因组为模板,PCR扩增ADAM17基因启动子-1 365～+51片段,连接到荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中;对FoxM1结合的3个位点进行定点突变;转染至293T细胞后用双荧光素酶报告系统分析其转录活性。结果测序结果显示,ADAM17启动子荧光素酶报告基因及其突变体均构建成功;与pGL3-basic组相比,pGL3-ADAM17(-1 365～+51)组介导的荧光素酶活性明显升高(P0.05);与对照组相比,过表达FoxM1组介导的荧光素酶活性明显升高(P0.05),且pGL3-ADAM17(-1 365～+51)组高于突变组(P0.05)。结论成功构建了人ADAM17启动子荧光素酶报告基因及其突变体,初步验证了ADAM17受转录因子FoxM1的转录调控。     

CKLF基因与CKLFSF1基因间的顺式调控元件

目的：探讨CKLF基因与CKLFSF1基因间序列(CCS)的调控作用。方法：运用PCR技术扩增CCS，并将此片段插入含有荧光素酶(luriferase)报告基因载体pGL3-basic，以及pGL3-SV40启动子中，构建受其调控的荧光素酶报告基因载体。应用脂质体介导基因转染技术，将4种重组质粒转染Hela细胞，进行瞬时表达分析。结果：在pGL3-basic和pGL3-basic-CCS质粒中的报告基因luciferase均无表达，但将CCS片段插入至promoter上游后，荧光素酶活性增加近1倍。结论：CKLF与CKLFSF1基因间的序列不具有启动子活性，但该序列中却可能存在调控其下游基因表达的顺式增强子元件。     

人GDDR基因启动子的克隆和报告基因载体构建

目的:克隆人GDDR基因的启动子;构建GDDR启动子的报告基因载体并进行活性分析.方法:设计合成GD-DR启动子引物,采用PCR技术从人基因组DNA中扩增GD-DR启动子;将扩增片段插入T载体并利用酶切与测序进行鉴定;亚克隆该基因至pGL3-Basic荧光报告基因载体;瞬时转染细胞,用双荧光素酶报告基因系统检测报告基因载体的活性.结果:PCR扩增得到人GDDR基因启动子;成功构建pGL3-GDDR-promoter 报告基因载体,测序结果表明启动子序列正确;双荧光素酶报告基因检测系统证实构建的报告基因载体具有启动子活性.结论:成功地构建人GDDR基因启动子的克隆及其报告基因载体的构建,为深入研究GDDR转录表达的调控机制提供基础.     

党参、 黄精和三七提取物增强超氧化物歧化酶基因启动子转录活性的研究 #br#

目的探讨党参、黄精和三七等中药提取物对超氧化物歧化酶( superoxide dismutase, SOD)基因启动子活性的影响。方法使用乙醇超声萃取和旋转蒸发的方法从党参、黄精和三七等中药中制备醇提物;然后从人胚肾293T (HEK-293T)细胞基因组DNA中扩增SOD基因启动子DNA片段并连接入启动子报告质粒pGL3-Basic中,通过荧光素酶活性检测成功构建pGL3-SOD启动子报告质粒;细胞活力测定(MTS法)确定了中药提取物的使用浓度后,将pGL3-SOD启动子报告质粒转染HEK-293T细胞,然后加入党参、黄精和三七等中药提取物,并通过检测荧光素酶活性来测定这些中药提取物对SOD基因启动子活性的影响。结果PCR扩增出1 500 bpSOD基因启动子片段,大小与文献和GenBank数据库报道一致,成功构建pGL3-SOD启动子报告质粒;与转染空载体pGL3-Basic相比,转染pGL3-SOD启动子报告质粒的HEK-293T细胞的荧光素酶活性增强了72倍;党参、黄精和三七中药提取物在50 ~ 400 μg / mL时对HEK-293T细胞的活力影响不明显, 400 μg / mL的党参、黄精和三七提取物增强SOD基因启动子活性分别为1. 79、 1. 72和1. 57倍。结论成功构建pGL3-SOD启动子报告质粒并具有启动荧光素酶活性;党参、黄精和三七增强SOD的活性可能是通过增强其基因的启动子活性水平来实现。     

SREBP1c/cm对PERK启动子转录活性及表达的差异性调控

目的探讨转录因子固醇调节元件结合蛋白(SREBP1c)及其活性形式(SREBP1cm)对人蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)的调控作用。方法构建人PERK启动子截短体报告基因载体,与内参质粒pRL-SV40共转入人胚肾细胞HEK293检测荧光素酶活性;用pc DNA3.1(-)-SREBP1c、pc DNA3.1(-)-SREBP1cm与PERK启动子转录活性核心区域共转293T细胞,双荧光素酶报告基因分析SREBP1c及活性形式SREBP1cm对PERK启动子转录活性的调控;RT-PCR和免疫印迹法检测SREBP1c、SREBP1cm对PERK mRNA和蛋白表达的影响。结果成功构建PERK启动子截短体报告基因载体,确定了PERK启动子转录活性核心区域;双荧光素酶报告基因分析结果显示SREBP1c抑制PERK启动子的转录活性,而SREBP1cm促进PERK启动子的转录活性。SREBP1c抑制PERK mRNA和蛋白的表达(P0.05),SREBP1cm促进PERK mRNA和蛋白的表达(P0.05)。结论 SREBP1c和SREBP1cm对PERK启动子转录活性及其表达具有相反的调控作用。     

小鼠白蛋白基因启动子的克隆及其在不同细胞系中转录活性的检测

目的：对比小鼠白蛋白（mouse albumin promoter, ALB）启动子调控下的增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein, EGFP）在不同细胞系中的转录活性。方法：以小鼠全血基因组DNA为模板,聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）扩增ALB启动子序列,克隆至pEGFP-1中,构建重组体pALB-EGFP;在Lipofectamine介导下将pALB-EGFP、pEGFP-N1转染人胎肝细胞L02、人宫颈癌细胞HeLa、人结肠癌细胞SW480、人胰腺癌细胞Bxpc-3;荧光显微镜和流式细胞仪对各转染细胞中EGFP的表达进行检测。结果：pALB-EGFP构建成功;L02转染pALB-EGFP 72 h后,ALB启动子可起始EGFP的表达,转录活性为人巨细胞病毒（cytomegalovirus,CMV）启动子的1/4,其它转染细胞的ALB不能起始EGFP的转录;稳定筛选后,ALB的转录活性达到与CMV相当的水平。结论：构建的重组载体在肝脏来源细胞中具有较高的转录活性, 为建立肝脏特异性表达目的基因的转基因小鼠模型奠定了基础。     

转录抑制因子ZHX2对AFP启动子的抑制作用

目的：探讨转录抑制因子ZHX2对人甲胎蛋白（AFP）启动子的抑制作用。方法PCR扩增人ZHX2基因，构建ZHX2与绿色荧光蛋白和HA-tag融合表达载体pEGFP-ZHX2、pcDNA-ZHX2-HA，共转染后通过荧光显微镜及Western blot检测融合基因的表达。扩增人AFP核心启动子269bp插入pGl3-Basic，构建报告质粒phAF269。将pcDNA-ZHX2-HA和phAF269共转染HepG2细胞。48h后裂解细胞，双荧光检测分析ZHX2对AFP启动子的抑制作用。结果荧光显微镜及westem blot检测证实pEGFP-ZHX2和pcDNA-ZHX2-HA可在体外有效表达ZHX2融合蛋白，双荧光实验表明报告质粒phAF269具有AFP启动子活性，且pcDNA-ZHX2-HA与phAF269共转染HepG2后可显著抑制AFP启动子的转录作用，此抑制作用具有剂量依赖性。结论：成功构建两种新型转录抑制因子ZHX2融合表达载体，并证实其对人AFP启动子的抑制作用，为进一步探讨肝癌发生中AFP表达调控机制及提高AFP介导的靶向肿瘤基因治疗提供基础资料。     

人Egr-1启动子的克隆及其在肿瘤细胞中的辐射诱导反应

目的:克隆人Egr-1基因的启动子, 插入荧光素酶报告基因载体中, 并检测电离辐射对其活性的影响.方法:采用PCR技术从人乳腺癌细胞系MCF-7基因组中扩增出Egr-1启动子, 将其克隆到pGL3-basic载体中;将重组质粒转染人肿瘤细胞, 测定Egr-1启动子在不同辐射条件下转录活性的改变.结果:成功构建了Egr-1启动子的荧光素酶报告基因;在不同剂量的γ射线照射后, Egr-1的启动子活性均明显高于未照射组;在同一剂量照射后48 h, Egr-1的启动子活性达峰值.结论:本实验构建的Egr-1启动子具有辐射激活的功能, 为进一步研究放射-基因治疗奠定了基础.