大鼠嗅粘膜原代培养细胞的分类及细胞社会学特性研究

目的：探讨嗅粘膜的细胞社会学特性，为嗅粘膜混合细胞移植治疗中枢神经系统损伤提供可行性研究资料。方法：自成年大鼠鼻中隔活体剪取部分嗅粘膜制成细胞悬液接种于玻璃培养皿，用含10％胎牛血清的F12培养基培养，动态观察细胞的贴壁、生长及分化过程，并用波形蛋白(vimentin)、层粘连蛋白(Iaminin)、巢蛋白(nestin)、神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)及神经生长因子受体p^75(nerve growth factor receptor p^75，NGFRp^75)抗体作免疫细胞化学染色，对阳性细胞进行形态学鉴定。结果：体外培养的嗅粘膜细胞中包含成纤维细胞、神经干细胞、嗅细胞和嗅鞘细胞等，不同类型细胞的形态及生长特性存在差异。结论：嗅粘膜细胞之间具有协调的细胞社会学关系；成体嗅粘膜混合细胞群移植治疗中枢神经系统损伤的可行性具有细胞社会学基础。     

人胚嗅粘膜嗅鞘细胞的分禽、培养和纯化

目的采用经我们改良的差速贴壁法结合神经营养因子3（NT3）和低浓度血清的培养方法对人胚嗅粘膜嗅鞘细胞进行分离和原代纯化培养，探讨建立嗅粘膜嗅鞘细胞体外培养的方法。方法对差速贴壁后的人胚嗅粘膜嗅鞘细胞交替应用含10％胎牛血清和含2．5％胎牛血清、NT3的DMEM—F12培养基进行原代培养。观察嗅粘膜嗅鞘细胞的形态学变化．采用p75^NTR和GFAP免疫细胞化学染色进行鉴定和纯度检测。结果人胚嗅粘膜嗅鞘细胞形态多呈双极、三极，伴有细长的突起。p75^NTR和GFAP染色均呈阳性反应，体外培养9d时纯度可达83％。结论差速贴壁法结合低浓度血清和NT3应用可以分离培养出人胚嗅粘膜嗅鞘细胞。     

人胚嗅粘膜嗅鞘细胞的分离、培养和纯化

目的 采用经我们改良的差速贴壁法结合神经营养因子3(NT3)和低浓度血清的培养方法对人胚嗅粘膜嗅鞘细胞进行分离和原代纯化培养,探讨建立嗅粘膜嗅鞘细胞体外培养的方法.方法 对差速贴壁后的人胚嗅粘膜嗅鞘细胞交替应用含10%胎牛血清和含2.5%胎牛血清、NT3的DMEM-F12培养基进行原代培养.观察嗅粘膜嗅鞘细胞的形态学变化.采用p75NTR和GFAP免疫细胞化学染色进行鉴定和纯度检测.结果 人胚嗅粘膜嗅鞘细胞形态多呈双极、三极,伴有细长的突起.p75NTR和GFAP染色均呈阳性反应,体外培养9 d时纯度可达83%.结论 差速贴壁法结合低浓度血清和NT3应用可以分离培养出人胚嗅粘膜嗅鞘细胞.     

鼻粘膜嗅区的研究

鼻腔既是呼吸器官的起始部又有嗅觉功能,鼻腔内壁衬有粘膜,根据其组织结构和功能的不同,可将其分为鼻粘膜呼吸区和嗅区两部分.嗅区位于鼻腔上部,即上鼻甲平面以上及其鼻中隔上粘膜横襞[1]以上的部分,富有感受嗅觉刺激的双极嗅细胞.     

鼻腔鼻窦炎动物模型嗅觉神经元凋亡的超微结构观察

目的:观察鼻腔鼻窦炎动物模型嗅觉神经元的结构变化,探讨鼻腔鼻窦炎对嗅觉影响的机制。方法:在小鼠鼻腔鼻窦炎模型的基础上,剥取嗅裂部粘膜,用透射电镜观察细菌接种后第2、5、8、11、14、21和28天嗅粘膜超微结构变化。结果:凋亡的细胞主要为嗅觉细胞,支持细胞很少有凋亡现象。结论:肺炎链球菌性鼻腔鼻窦炎时,嗅粘膜上皮内的嗅觉神经元出现与炎症反应程度相一致的凋亡现象,提示这可能是鼻腔鼻窦炎嗅觉减退或丧失的主要病理基础之一。     

大鼠嗅粘膜内细胞色素P450 2A3的发育表达

目的：研究细胞色素P450 2A3(cytochrome P450 2A3，CYP2A3)在大鼠嗅粘膜表达变化的规律。方珐：应用免疫组化方法观察胎鼠、幼鼠及成年鼠嗅粘膜内CYP2A3的免疫表达。结果：大鼠嗅粘膜内CYP2A3的表达始于孕17d，随胎仔发育表达不断增强，生后3周达一峰值，并持续增长至成年期。固有层Bowman’s腺细胞内CYP2A3表达强度从出生后3周开始超出支持细胞。结论：嗅粘膜内CYP2A3酶表达与嗅感受神经元功能发育基本同步，二者可能存在共同的生长调控因子，而Bowman’s腺细胞是嗅粘膜内CYP2A3酶表达及发挥功能活性的主要部位。     

嗅鞘细胞培养上清胶质源性神经生长因子含量的测定

目的观察嗅鞘细胞培养上清胶质源性神经生长因子(GDNF)的含量随培养时间的变化关系，为选择嗅鞘细胞移植的最佳时间提供理论依据。方法采用差速贴壁纯化培养方法培养嗅球及嗅粘膜嗅鞘细胞，培养21天，3天留取标本一次，采用ELISA法对上清GDNF进行测定。结果GDNF的含量随培养时间的延长逐渐升高，但绝对含量很低。结论培养的嗅鞘细胞能分泌GDNF，细胞移植在14天以后为宜。     

嗅粘膜源性嗅鞘细胞移植联合NGF对脊髓损伤的修复

目的：探讨大鼠嗅粘膜嗅鞘细胞（olfactory ensheathing cells, OECs）移植联合神经生长因子(nerve growth factor, NGF)修复脊髓急性损伤的可行性和疗效,并观察二者的协同作用。方法：自成年Wistar大鼠嗅粘膜取材,采用差速贴壁和阿糖胞苷抑制纯化相结合的方法培养纯化嗅鞘细胞。建立大鼠脊髓半切模型,并随机分成对照组（A组）,OECs组（B组）和OECs＋NGF组（C组）,在不同时段进行肢体活动的BBB评分。8周后取脊髓标本进行组织学检查,评价对脊髓损伤的修复作用。结果：B组和C组2周后BBB评分高于A组（P＜0.05）,C组自4周后明显优于A组和B组（P＜0.01）。组织学检查表明,C组可明显促进轴突再生。结论:OECs联合NGF具有良好的脊髓损伤修复作用,且二者具有明显的协同作用。     

人嗅粘膜内细胞色素P450 2A6的发育表达

目的：探讨细胞色素P450 2A6(cytochrome P450 2A6，CYP2A6)在不同胎龄胎儿嗅粘膜内的发育表达。方法：应用免疫组化法观察CYP2A6在胚胎发育16、18、22、28和38周胎儿嗅粘膜内的表达情况。结果：CYP2A6的表达始于孕18周，在支持细胞核上区胞浆顶端阳性着色，彼此相连呈一条带状，上皮中、下层个别支持细胞核下区也呈现稍弱的免疫阳性反应。到孕22周时，固有层Bowman腺细胞浆内开始出现CYP2A6阳性着色，但此时Bowman腺体数量较少，腺细胞仅单层排列围成腺腔。随胎儿发育CYP2A6表达强度不断增大，孕28周时整个支持细胞的阳性着色更加清晰，固有层内Bowman腺数量明显增多，并且腺细胞呈多层排列，胞浆内CYP2A6阳性强度开始超出上皮层内的支持细胞。孕38周时免疫反应达峰值，其中支持细胞的染色勾画出其独特的极性结构：细胞核上区宽阔，胞浆内CYP2A6染色清晰，而核下区逐渐缩窄，以足状突的形式附着于基膜上。结论：人胎儿发育时期嗅粘膜内有CYP2A6酶表达，并且与嗅感受神经元发育基本同步，二者可能存在共同的调控因子。固有层Bowman腺细胞内CYP2A6的开始表达时间晚于上皮层支持细胞，但却是嗅粘膜内CYP2A6表达的主要部位以及嗅素代谢转化的主要场所。     

嗅粘膜移植联合应用大剂量甲基强的松龙修复急性脊髓损伤

目的探讨嗅粘膜髓内移植联合应用大剂量甲基强的松龙修复脊髓损伤的可行性和疗效,观察甲基强的松龙与嗅鞘细胞的协同作用。方法将Wistar大鼠做成脊髓半切模型,随机分成髓内单独移植嗅粘膜组(OM)、嗅粘膜联合应用甲基强的松龙组(OM MP)、单独应用甲基强的松龙组(MP)和对照组(CG)共四组,分期进行联合行为学综合评分(CBS评分)及组织学检查,评价各组脊髓修复情况。结果CBS评分OM组及OM MP组较MP组及CG组在3周后各时段差别有显著意义(P<0.01);OM组和OM MP组没有明显差别(P>0.05);MP组与CG组有显著差别(P<0.05)。OM组及OM MP组组织学改变与MP组及CG组有显著差别,前两组间无显著差别。结论嗅粘膜髓内移植联合应用大剂量甲基强的松龙修复脊髓损伤具有很好的疗效,但未见MP与OM的明显协同作用。     

功能性鼻内镜手术对慢性鼻窦炎患者嗅觉的影响

目的研究慢性鼻窦炎伴嗅觉障碍患者行功能性鼻内镜手术前后嗅觉功能的改变,探讨慢性鼻窦炎嗅觉功能与鼻内镜手术的关系,并用透射电镜观察手术对嗅区黏膜超微结构的影响,为临床治疗慢性鼻窦炎患者的嗅觉障碍提供理论依据。方法对慢性鼻窦炎伴嗅觉功能障碍患者行功能性鼻内镜手术,于术前及术后6个月观察嗅觉功能变化并切取嗅区黏膜于透射电镜下观察超微结构。结果术后嗅觉及嗅上皮的超微结构均有不同程度的改善,主观嗅觉改善率为97%;异常超微结构由术前的100%降为20%。结论炎症导致的嗅上皮细胞由表及里各层的超微结构异常与嗅觉功能减退有关。功能性鼻内镜手术改善通气功能后及黏膜炎性反应消除后,随着嗅上皮超微结构的恢复,嗅觉也会有不同程度的改善。     

大鼠嗅鞘细胞的纯化及活性检测

目的采用改良差速贴壁联合胰酶限时消化法纯化大鼠嗅鞘细胞,并检测嗅鞘细胞的生物活性。方法分离新生7d的SD大鼠嗅球嗅鞘细胞,分组后采用改良的6h和18h两次差速贴壁法联合不同时段（1、3和5min）胰酶消化法纯化培养,观察不同时段纯化的嗅鞘细胞的形态特点及生长情况;应用FITC标记的神经生长因子受体p75抗体（兔抗鼠NGFRp75抗体）检测嗅鞘细胞并评估细胞纯度;应用CCK-8法和酶联免疫吸附法分别检测嗅鞘细胞在纯化后3～15d的增殖活性和分泌脑源性神经营养因子的含量。结果随着细胞的生长,梭形的嗅鞘细胞逐渐增多;改良差速贴壁联合胰酶限时消化1min、3min、5min法所得嗅鞘细胞纯度分别为（57.52±2.13）%、（78.95±2.60）%、（49.01±0.74）%,3min组最明显,组间两两比较差异有统计学意义（P〈0.05）;改良差速贴壁法联合胰酶限时消化1min、3min、5min法所得嗅鞘细胞在纯化后7、9、11d时增殖的细胞数目和脑源性神经营养因子分泌量显示3min组最优,组间比较差异有统计学意义（P〈0.05）。结论改良差速贴壁（6h＋18h）联合胰酶限时消化3min的纯化方法能获得较高纯度的嗅鞘细胞。     

Discordance between olfactory psychophysical measurements and olfactory event related potentials in five patients with olfactory dysfunction following upper respiratory infection

Background Subjective olfactory tests are easy to perform and popularly applied in the clinic, but using only these, it is difficult to diagnose all disorders of the olfactory system. The olfactory event related potentials technique offers further insight into the olfactory system and is an ideal objective test. This analysis was of subjective and objective data on the olfactory function of twelve patients with loss of smell associated with an upper respiratory infection （URI）. Methods We tested the twelve patients with URI induced olfactory loss by medical history, physical examination of the head and neck, olfactory tests and medical imaging. Olfactory function was assessed by Toyota and Takagi olfactometry including olfactory detection and recognition thresholds and olfactory event-related potentials （OERPs） recorded with OEP-98C Olfactometer. Results An unusual phenomenon was observed in five patients in whom the subjective detection and recognition thresholds were normal, while the expected OERPs were not detectable. Conclusions We suggest that the discordance between olfactory psychophysical measurements and OERPs might be the results of abnormal electrophysiology related with olfactory neuropathy caused by viral URI. In addition, the measurement of OERPs might play a significant role in evaluating olfactory dysfunction.     

嗅神经上皮瘤的临床病理分析

分析嗅神经上皮瘤（嗅神经母细胞瘤）的临床、病理特点,探讨免疫组化技术和电镜在嗅神经上皮瘤诊断中的应用价值。方法对１９例嗅神经上皮瘤进行了临床分析,光镜复查,免疫组化检测,４例做了透射电镜观察。结果嗅神经上皮瘤主要发生于中青年,起病缓慢,首发症状以单侧鼻塞和鼻出血为多见,病理形态为小圆细胞和短梭形细胞呈巢状及弥散分布,菊形团结构少见或缺如;免疫组化检测ＮＳＥ、Ｓｙｎ阳性,ＣＫ、Ｓ－１００等部分阳性,ＧＦＡＰ阴性;电镜超微结构２例在胞质内找到神经分泌颗粒,３例在胞质内发现中间丝、微丝和基膜,１例有细胞连接和神经突起。结论嗅神经上皮瘤这个名称较嗅神经母细胞瘤更确切,诊断除常规病理外,尚需借助于免疫组化检测,分化差的病例只能通过电镜或其他先进的手段来解决。     

帕金森病嗅觉障碍的研究进展

长期以来,帕金森病(PD)的早期诊断一直是个难题,如何早期确诊或发现其特异性检查指标是PD诊断领域研究的重点。PD存在嗅觉功能异常已被人们所认识,其早于运动症状出现,与PD的发病有关。现就PD患者的嗅觉障碍、嗅觉障碍的评价、嗅觉障碍的发病机制、嗅觉检测的意义予以综述,从而说明嗅觉障碍可作为PD早期诊断和鉴别诊断的指标,为临床医师早期诊断PD提供参考。     

新生大鼠嗅球嗅鞘细胞的纯化方法研究

目的 探讨新生大鼠嗅球嗅鞘细胞（OECs）的体外培养和纯化方法，为研究脊髓损伤后神经再生获得丰富OECs来源奠定基础。方法 用原代培养的方法分离、培养新生大鼠嗅球OECs，比较p75抗体吸附、阿糖胞苷抑制、差速贴壁三种方法的纯化效果，根据GFAP免疫细胞化学染色结果统计所得OECs的纯度，同时在相差显微镜下对不同培养时期的OECs的形态进行观察。结果 体外培养的新生大鼠嗅球OECs主要为双极或三级细胞，其突起细长。未经纯化的OECs则成纤维细胞生长迅速而占优势，三种纯化方法均能使接种14d后的OECs纯度均值大于75％。p75抗体吸附法和阿糖胞苷抑制法的纯化率均值略高于差速贴壁法。结论 新生大鼠嗅球OECS的原代培养中细胞纯化是必要的；在脊髓损伤再生研究中，较之p75抗体吸附法和阿糖胞苷抑制法，差速贴壁法是一种简单、经济、实用的OECs纯化方法。     

幽门螺杆菌对体外培养胃粘膜组织的损伤作用

在排除了炎症及免疫反应的条件下,探讨幽门螺杆菌本身因素对胃粘液细胞的损伤作用。方法将胚胎胃粘膜组织与Ｈｐ共培养２,４,６ｈ,利用光镜及电镜对胃粘膜组织进行形态学研究。结果光上液细胞水肿且凋亡增加,电镜观察除见有凋记细胞,凋亡小体外,粘液细胞还出现微绒毛丢失、粘液颗粒减少,细胞内出现多少等的空泡等改变。上述变化随着胃粘液细胞与ＨＰ共培养时间的延长而加重。在共培养６ｈ后,少部分粘液细胞发生坏死。结论Ｈ     

Discordance between olfactory psychophysical measurements and olfactory event related potentials in five patients with olfactory dysfunction following upper respiratory infection

Background Subjective olfactory tests are easy to perform and popularly applied in the clinic, but using only these, it is difficult to diagnose all disorders of the olfactory system. The olfactory event related potentials technique offers further insight into the olfactory system and is an ideal objective test. This analysis was of subjective and objective data on the olfactory function of twelve patients with loss of smell associated with an upper respiratory infection (URI). Methods We tested the twelve patients with URI induced olfactory loss by medical history, physical examination of the head and neck, olfactory tests and medical imaging. Olfactory function was assessed by Toyota and Takagi olfactometry including olfactory detection and recognition thresholds and olfactory event-related potentials (OERPs) recorded with OEP-98C Olfactometer. Results An unusual phenomenon was observed in five patients in whom the subjective detection and recognition thresholds were normal, while the expected OERPs were not detectable. Conclusions We suggest that the discordance between olfactory psychophysical measurements and OERPs might be the results of abnormal electrephysiology related with olfactory neuropathy caused by viral URI. In addition, the measurement of OERPs might play a significant role in evaluating olfactory dysfunction.     

Discordance between olfactory psychophysical measurements and olfactory event related potentials in five patients with olfactory dysfunction following upper respiratory infection

Background Subjective olfactory tests are easy to perform and popularly applied in the clinic, but using only these, it is difficult to diagnose all disorders of the olfactory system. The olfactory event related potentials technique offers further insight into the olfactory system and is an ideal objective test. This analysis was of subjective and objective data on the olfactory function of twelve patients with loss of smell associated with an upper respiratory infection (URI). Methods We tested the twelve patients with URI induced olfactory loss by medical history, physical examination of the head and neck, olfactory tests and medical imaging. Olfactory function was assessed by Toyota and Takagi olfactometry including olfactory detection and recognition thresholds and olfactory event-related potentials (OERPs) recorded with OEP-98C Olfactometer. Results An unusual phenomenon was observed in five patients in whom the subjective detection and recognition thresholds were normal, while the expected OERPs were not detectable. Conclusions We suggest that the discordance between olfactory psychophysical measurements and OERPs might be the results of abnormal electrephysiology related with olfactory neuropathy caused by viral URI. In addition, the measurement of OERPs might play a significant role in evaluating olfactory dysfunction.     

帕金森病嗅觉障碍研究进展

90%以上的帕金森病患者可出现嗅觉障碍,且早于运动症状数年出现,临床可表现为气味辨别、气味识别、气味记忆与再认以及气味感知等方面的缺陷。目前已建立多种检测嗅觉的方法,对帕金森病早期诊断和鉴别诊断有重要意义。帕金森病嗅觉障碍的发生机制涉及许多方面,十分复杂。现从嗅觉系统的解剖生理、嗅觉障碍的表现和检测手段、帕金森病动物模型的相关研究及嗅觉障碍的机制研究几方面进行综述。