慢病毒介导的血红素加氧酶-1对脂肪干细胞在低氧无血清条件下的保护作用

目的探讨慢病毒介导的血红素加氧酶-1(HO-1)对脂肪干细胞(ADSCs)在低氧无血清的条件下的保护作用。方法分离培养SD大鼠ADSCs,取第三代ADSCs分为五组:对照组;单纯低氧无血清组;空载体病毒组;HO-1组;HO-1+ZnPP组。采用DAPI染色检测各组细胞凋亡率;Western blot法检测各组HO-1、Cleaved-Caspase-3的表达量。结果携带HO-1基因的慢病毒转染ADSCs(HO-1组)可明显增加ADSCs中HO-1的表达;ADSCs在缺氧状态下发生大量凋亡,其凋亡率为(27.29±1.18)%,转空载体的细胞凋亡率达(27.47±1.35)%,而转HO-1基因的ADSCs的凋亡率仅为(12.00±1.18)%,HO-1+ZnPP组:凋亡率(25.52±2.98)%。与对照组相比,低氧无血清组与空载体病毒组ADSCs的Cleaved-Caspase-3的表达有显著升高(P<0.05);HO-1组Cleaved-Caspase-3的表达与低氧无血清组与空载体病毒组相比有明显下降(P<0.05);而HO-1+ZnPP组Cleaved-Caspase-3的表达又明显高于HO-1组(P<0.05)。结论提高ADSCs中HO-1蛋白的表达可以通过降低凋亡效应因子Caspase-3的活性显著降低ADSCs在低氧无血清条件下的凋亡率。     

自体脂肪间充质干细胞对晚期肝病影响的初步临床研究

目的 评价经肝动脉途径移植自体脂肪间充质干细胞治疗晚期肝病的临床疗效。方法 筛选本科室21305．1—2006．12期间收治的肝炎后肝硬化患者18例，其中8例为治疗组，经肝动脉途径行自体脂肪间充质干细胞移植治疗；其余10例为对照组，给予综合内科治疗。测定移植前及移植后2、4、8周治疗组与对照组ALT、TBIL、ALB、PTA指标的变化，评价自体脂肪间充质干细胞介入移植对晚期肝病的临床疗效。结果 治疗组与对照组相比，各项实验室指标均明显好转，差异有统计学意义。结论 经肝动脉途径移植自体脂肪间充质干细胞治疗晚期肝病短期疗效确切，其远期疗效有待深入研究。     

Mimicking the functional niche of adipose-derived stem cells for regenerative medicine

Introduction: A stem cell (SC) niche is defined as the microenvironment in which the adult SC resides and includes surrounding cells, low oxygen content and growth factor gradients. Crosstalk between SCs and their niche provides signals that keep SCs quiescent, or modulates their activation.

Areas covered: This review discusses the characterization of niche conditions in the adipose-derived stem cell (ASC) in vivo environment, and introduces key signalling pathways and autocrine/paracrine regulators of ASCs.

Expert opinion: Control of in vivo niche factors (such as low oxygen content, generation of reactive oxygen species and activation of platelet-derived growth factor receptor signalling) should increase ASC yields synergistically and reduce production costs. Additionally, the preconditioning of ASCs with these niche factors prior to transplantation might enhance their regenerative potential. ASC niche is complex, and there are components of the niche that we may not yet understand. Therefore, future research needs to focus on identifying the key regulatory factors of the ASC niche in vivo, and developing a novel method to mimic these niche factors for in vitro manipulation.     

周期性张应力联合淫羊藿苷促进脂肪干细胞成骨分化的实验研究

目的探讨周期性张应力（CTS）联合淫羊藿苷促进脂肪干细胞（ASCs）成骨分化的作用。 方法分离10只Sprague-Dawley(SD)大鼠的ASCs,分别按不同的干预方法将收集的ASCs细胞分为对照组（仅用普通培养基干预）、淫羊藿苷组（仅用淫羊藿苷干预）、1000μ组（仅用1000μ的CTS干预）、2000μ组（仅用2000μ的CTS干预）、3000μ组（仅用3000μ的CTS干预）和联合干预组（用2000μ的CTS联合淫羊藿苷进行干预）。淫羊藿苷的作用浓度为10-7mol/L;CTS的设置参数为频率1.0Hz,应力大小分别为1000μ strain（简称1000μ）、2000μ、3000μ,每刺激5s之后休息15s,每日总刺激时间为2h。干预7d后,收获细胞采用Western Blot法检测碱性磷酸酶（ALP）蛋白的表达;用淫羊藿苷联合2000μ的CTS对ASCs进行干预3d后,收获ASCs细胞用Western Blot法检测其Runt相关基因转录因子2（Runx2）、YES相关蛋白（YAP）和结缔组织生长因子（CTGF）蛋白的表达;分别于干预3d和7d后,采用ALP活性定量检测试剂盒对ALP活性进行检测;干预3d后,利用RT-PCR检测YAP下游靶基因CTGF和锚蛋白重复结构域1（Ankrd1）的表达;干预7d后,利用RT-PCR检测成骨分化相关基因骨桥素（OPN）和Ⅰ型胶原的表达,并对各组所得数据进行统计学分析比较。 结果淫羊藿苷和CTS（1000μ、2000μ、3000μ）均能显著促进ALP蛋白的表达。与1000μ和3000μ应力大小的CTS相比,2000μ的CTS具有最强的促ALP蛋白表达能力;且2000μ的CTS联合淫羊藿苷能显著促进ALP的表达及Runx2和CTGF的表达,且其联合作用时效应更明显;但淫羊藿苷和2000μ的CTS单独作用并不能促进YAP蛋白的表达,只有联合作用时才具有促YAP表达作用。淫羊藿苷和2000μ的CTS单独作用3d和7d后均能显著上调ALP的活性,且其联合作用时上调ALP活性的效应更加明显。淫羊藿苷和2000μ的CTS单独作用7d后,能显著促进成骨分化基因OPN和Ⅰ型胶原蛋白的表达,且联合作用时效应更明显。淫羊藿苷和2000μ的CTS单独作用3d后能显著促进YAP靶基因CTGF和Ankrd1的表达,联合作用时效应更明显。 结论CTS和淫羊藿苷联合作用可以通过上调YAP活性来促进ASCs的成骨分化。     

不同品系大鼠皮下脂肪源干细胞诱导分化能力的比较

目的:对比SD大鼠和Wistar大鼠皮下脂肪源干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)体外诱导分化能力,为ADSCs的进一步应用提供实验依据。方法:SD大鼠和Wistar大鼠各6只取腹股沟脂肪垫,培养扩增ADSCs,相差显微镜下观察两个品系来源的ADSCs的形态。用第4代细胞进行成骨和成脂诱导,分别用茜素红和油红O染色观察向成骨细胞分化后的矿化结节和向脂肪细胞分化后的脂质沉积。结果:两个品系来源的ADSCs在细胞形态上没有显著区别,都能进行成骨和成脂诱导分化。结论:SD大鼠和Wistar大鼠腹股沟脂肪垫来源的ADSCs诱导分化能力差异无显著性。     

骨髓间充质干细胞诱导成骨细胞模拟造血龛支持造血干/祖细胞增殖

目的探讨骨髓间充质干细胞(MSC)诱导的成骨细胞复合人源生物衍生骨,构建三维培养体系,观察模拟的造血龛(hematopietic niche)对脐血CD34 造血干／祖细胞(HSPC)增殖的支持作用。方法分选人骨髓MSC及胎儿颅骨成骨细胞,将培养3代的MSC定向诱导为成骨细胞,分别将①MSC、②颅骨成骨细胞、③MSC与成骨细胞混合物(比例为1:2)及④MSC诱导的成骨细胞作为饲养细胞复合在人源生物衍生骨上,构建三维培养体系,同时用相应的饲养细胞层构建对应的二维培养体系。免疫磁珠分选脐血CD34 细胞,接种于各培养体系,无外源性细胞因子条件下进行培养。显微镜下观察各饲养细胞与人源生物衍生骨复合情况,通过流式细胞术、半固体细胞集落培养观察比较各培养体系支持HSPC的增殖能力。结果倒置相差显微镜、扫描电子显微镜以及免疫荧光标记观察结果显示,已成功地将MSC、颅骨成骨细胞、MSC和成骨细胞混合物及MSC诱导的成骨细胞复合在人源生物衍生骨上,构建了造血干细胞三维培养体系。在无外源细胞因子作用下,脐血HSPC培养2周造血祖细胞集落(CFU-C)与长期培养起始细胞(LTC-IC)分析,三维培养体系各组(①～④)CFU-C明显多于相应二维培养体系各组(①681．00±44．43比438．20±64．24;②729．80±37．72比536．60±35．31;③697．80±54．09比464．80±41．53;④740．20±47．66比513．40±65．56),P<0．05,但三维培养体系各组间差异无统计学意义(P>0．05)。三维培养体系各组LTC-IC也明显高于相应二维培养体系(分别为①68．00±5．11比26．00±3．73;②93．00±6．12比38．60±4．93;③83．40±5．85比36．20±4．52;④126．00±11．89比59．40±4．25),P<0．05,且三维培养体系中MSC诱导的成骨细胞组(④)LTC-IC明显多于其他各组。脐血HSPC培养5周,二维培养体系中饲养细胞层已逐渐崩解、脱落、死亡;而三维培养体系中饲养细胞层生长情况较好。三维体系各组CFU-C集落分析显示,MSC诱导的成骨细胞组(④)与其他三组间差异有统计学意义(①112．00±14．21;②186．17±24．80;③126．67±11．52;④257．00±28．78),P<0．05。结论骨髓MSC诱导分化的成骨细胞复合人源生物衍生骨构建的三维培养体系,对于脐血HSPC体外培养具有类似体内造血龛的支持作用,成骨细胞对造血干／祖细胞生存、增殖具有重要的调控作用。     

脂肪组织来源干细胞的分离培养及鉴定

目的探讨脂肪组织来源干细胞(adipose-derived stem cells,ASCs)的分离、培养、分化和鉴定的方法,为进一步的实验研究提供理论依据。方法酶消化法处理脂类抽吸物,分离培养ASCs,观察细胞形态;四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法测细胞活性并绘制细胞生长曲线,流式细胞仪测定细胞周期,丫啶橙染色检测细胞的衰老;流式细胞仪、免疫组织化学染色法鉴定表面分子表达;成脂定向诱导分化后油红"O"染色定性。结果原代培养的ASCs呈成纤维细胞样贴壁生长,具有很强的增殖能力;细胞周期研究发现ASCs具有干细胞的特性。流式细胞仪检测显示干细胞标志的CD29、CD44、CD34的表达均呈阳性;免疫化学染色发现VШ因子、CD31、CD34,CD105、SMA表达阳性;成脂诱导分化2周后,细胞内可见有大量脂滴,油红"O"染色可见胞浆内有大量红染颗粒。结论自人体脂类抽吸物中通过酶消化法能分离和培养出具有干细胞特性的成纤维细胞样细胞群,该细胞具有很强的增殖活性且不易衰老,能稳定表达干细胞表面标志并能实现定向成脂分化。     

多孔钽棒表面犬骨髓间充质干细胞的附着与增殖

背景：具有高孔隙率及与骨小梁高度相似弹性模量的多孔钽棒,不仅可为股骨头提供有效机械支撑,还可在坏死区域增强再血管化,降低应力遮挡,为骨长入坏死区提供保证。 目的：为评价多孔钽棒的细胞相容性,观察犬骨髓间充质干细胞在多孔钽棒表面的附着与增殖。 方法：采用密度梯度离心法分离培养犬骨髓间充质干细胞,鉴定后取第3代细胞,以1.5×109 L-1的细胞浓度种植在多孔钽棒表面,联合培养5,10,15 d,分别采用倒置显微镜和扫描电镜观察细胞的附着与增殖情况。 结果与结论：①倒置显微镜：1-5d 培养期内骨髓间充质干细胞开始增殖,材料近周细胞量少,远周细胞量较多;6-10 d 细胞明显增多并逐渐向材料移行,部分细胞贴附于材料边缘;14 d以后细胞连接成片,填充材料周边及凹陷,材料边缘部分区域还可见细胞层叠成团,出现细胞钙化灶。②扫描电镜：联合培养5 d,钽棒表面无细胞附着;联合培养10 d,细胞形态多样,分散在钽棒表面,细胞间无连接,有多个突起;联合培养15 d,细胞呈多角形,数量增多,连接成片,延展良好,可见多孔钽棒上的细胞分泌大量胶原纤维,细胞被大量细胞外基质包围,细胞形态多为梭形及多角形。结果表明犬骨髓间充质干细胞在钽棒表面有较好的黏附与增殖能力。     

不同人工骨材料复合骨髓间充质干细胞治疗早期股骨头坏死：争议与进展

背景：临床上采用复合骨髓间充质干细胞的人工骨组织材料治疗早期股骨头坏死取得了一定进展。目的：综述骨髓间充质干细胞的生物学性能及运用其复合不同人工骨组织治疗早期股骨头坏死的研究进展。方法：应用计算机检索2003至2013年PubMed数据库、FMJS数据库,2005至2013年万方数据库、CNKI数据库及 CBM 数据库,检索关键词分别为“bone marrow mesenchymal stem cel s,artificial bone, osteonecrosis of the femoral head;骨髓间充质干细胞,人工骨,股骨头坏死”。结果与结论：应用骨髓间充质干细胞分别复合天然人工骨、珊瑚人工骨、羟基磷灰石人工骨、钙-磷生物陶瓷人工骨及硫酸钙人工骨等治疗股骨头坏死,可降低坏死股骨头内压力,促进局部毛细血管的修复并改善股骨头血供,促进成骨细胞分化增殖等,最终起到延缓甚至避免人工关节置换治疗。但仍有许多问题有待解决,包括干细胞治疗股骨头坏死病理机制的研究还有待进一步深入;由于个体差异、取材部位、体外培养技术等不同,种子细胞的数量和质量存在明显差异性;目前人工骨组织材料还处于探索研发阶段,运用骨髓间充质干细胞复合人工骨组织材料治疗股骨头坏死缺乏大样本随机对照研究,其远期疗效缺乏随访观察统计,并且适应证的选择及疗效评价标准、手术认知度等缺乏统一量化的标准。     

稀土化合物氯化镧影响神经干细胞增殖的探讨

目的初步探讨稀土化合物氯化镧(Lanthanum chloride,LaCl3)对体外培养的NSCs增殖状况的影响。方法采用成球悬浮法分离培养小鼠神经干细胞(mNSCs);将生长状态良好的第3代mNSCs分为空白对照组、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)组、LaCl3组,分别采用常规NSCs培养液、含10ng/ml TNF-α的NSCs培养液、含2.5μmol/L LaCl3的NSCs培养液培养NSCs1～3天。采用神经球计数、神经球体积测量方法以及采用免疫荧光细胞化学方法检测与细胞增殖相关的指标(CyclinD1)来观察NSCs的增殖状况。结果神经球计数和神经球体积测量结果显示,TNF-α组和LaCl3组神经球数量分别为[(74.56±2.6)个/瓶]和[(62.32±2.8)个/瓶],较空白对照组[(42.28±3.5)个/瓶]明显增多,P<0.05;神经球体积分别为[(0.82±0.16)×106(μm3)]和[(0.66±0.12)×106(μm3)],较对照组[(0.26±0.08)×106(μm3)]明显增大,P<0.05。免疫细胞荧光检测细胞增殖结果显示,TNF-α组和LaCl3组中,CyclinD...     

改良法培养骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的实验研究

目的:研究大鼠骨髓基质干细胞的生长特点和在诱导条件下的成骨能力。方法:通过改良的骨髓培养法分离成年大鼠骨髓基质干细胞,应用含地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C的诱导分化培养液定向诱导传代细胞向成骨细胞分化,并检测骨钙素的分泌、碱性磷酸酶的活性和细胞矿化作用。结果:原代培养基质干细胞首先形成细胞集落,12d时集落间接近融合;传代细胞体积变大,约5～7d传代一次。诱导条件下,细胞碱性磷酸酶活性明显增高,并出现了矿化结节。结论:骨髓基质干细胞易于分离培养及体外扩增,成骨能力肯定,可作为骨组织工程的种子细胞     

ADSC移植对大鼠大脑中动脉闭塞脑梗死模型梗死灶周围DCC和NF-200表达的影响

目的分析脂肪来源干细胞(ADSC)移植对大鼠大脑中动脉闭塞脑梗死模型梗死灶周围神经丝蛋白200(NF-200)和结直肠癌缺失蛋白(DCC)表达的影响。方法取36只SD大鼠,其中30只用于构建脑梗死大鼠模型,随机分为假手术组(不插入线栓,注入生理盐水)、脑梗死组(插入线栓,注入生理盐水)、移植组(插入线栓,注入ADSC悬液),三组各10只;剩余6只用于分离培养ADSC。分别于造模后第1、2周,采用荧光显微镜观察ADSC在大鼠脑组织中的迁移情况;通过免疫印迹法测定NF-200和DCC蛋白在大鼠脑梗死病灶周围皮质中的表达情况;采用免疫荧光法测定NF-200和DCC在大鼠脑梗死病灶周围皮质中的分布情况。激光扫描共聚焦显微镜下观察DCC蛋白在梗死灶周围皮质中的定位。结果经荧光显微镜观察可见,移植组脑组织中可见PKH-26标记的ADSC,且多见于脑梗死周围皮质中。经免疫印迹法检测可知,相比假手术组,脑梗死组造模后第1、2周脑梗死病灶周围皮质中NF-200蛋白表达明显下调,DCC蛋白表达明显上调(P<0.05);与假手术组比较,移植组造模后第1周脑梗死病灶周围皮质中NF-200蛋白表达明显下调(P<0.05),造模后第1、2周DCC蛋白表达明显上调(P<0.05);移植组与假手术组造模后第2周NF-200表达的比较,并无显著差异(P>0.05);相比脑梗死组,移植组造模后第1、2周脑梗死病灶周围皮质中NF-200和DCC蛋白表达水平均显著上调(P<0.05)。经免疫荧光组织化学染色法检测可知,脑梗死组与移植组脑梗死病灶周围皮质中NF-200和DCC蛋白的表达较假手术组更加明显,且移植组更加明显;NF-200蛋白在大鼠脑梗死病灶周围皮质中主要定位于神经元轴突中,DCC蛋白呈现条索状表达。激光扫描共聚焦显微镜下观察可见,DCC蛋白主要定位于大鼠脑梗死病灶周围皮质中NF-200阳性的神经元轴突中。结论通过颈动脉注射途径移植的ADSC可移至大鼠脑梗死病灶周围皮质中,且其促进神经元轴突再生修复的作用机制可能与诱导脑梗死病灶周围皮质NF-200和DCC表达密切相关。     

骨髓间充质干细胞及其载体在股骨头坏死治疗中的研究与进展

背景：骨髓间充质干细胞作为一种多能干细胞在股骨头坏死治疗中的应用越来越多,而单纯干细胞移植及注入往往效果不佳,联合支架材料或其复合物可更好地发挥作用。 目的：综述骨髓间充质干细胞联合载体治疗股骨头坏死的临床及实验研究现状,并展望发展前景。 方法：以＂股骨头坏死、骨髓间充质干细胞、载体或支架材料;osteonecrosis of the femoral head,avascularnecrosis, bone marrow mesenchymal stem cells,carrier or scaffold material＂为检索词,应用计算机检索1989至2013年中国知网及PubMed数据库关于骨髓间充质干细胞及其载体在股骨头坏死治疗方面的临床及实验文献报道,归纳综述各种载体的特性及局限性。 结果与结论：理想的载体可促进及诱导骨髓间充质干细胞修复股骨头的能力,现有的载体种类繁多,包括自体松质骨、异体骨、天然生物材料、有机材料、生物陶瓷、纳米材料等,各有利弊。所以人们通过将材料复合的手段来寻找理想的载体和支架材料,但仍有一些问题需要深入研究与解决,如支架材料来源没有统一的生产标准、规格及公认的制作方法;如何控制及避免支架植入后的免疫反应及炎症反应;如何保证降解速率与股骨头区域的骨与软骨生成速率一致;如何全面的检测植入后的细胞毒性、生物相容性及治疗效果等。     

干细胞若干定义的相关探讨

背景：近10年来干细胞研究所取得的巨大进展,不仅影响和促进了生物学及其相关基础科学,而且还在医学、药物开发、农业等许多领域得到广泛的应用,目前已成为研究的热点问题。目的：在干细胞的定义上还存在一些需要探讨的问题,明确定义将有利于干细胞研究的快速发展。方法：回顾干细胞的发展和概念提出,特别是通过中英文权威定义的比较,提出作者的看法。结果与结论：干细胞的定义上还存在一些问题值得探讨,特别是一些中英文表述不同影响了理解。例如,“多能干细胞”对应译成两个单词：PluripotentStemCell和MultipotentStemCell,然而Pluripotent和Multipotent两个单词的英文意义不同。为了学术交流和沟通,作者提出将PluripotentStemCell称为“万能干细胞”,而保留MultipotentStemCell为“多能干细胞”的定义。以上结论供广大同仁探讨,以利于抛砖引玉。     

病灶清除植骨联合骨髓单个核细胞治疗早期股骨头坏死：髋关节功能评价

背景：已有多项研究表明骨髓干细胞的数量减少和活力降低与股骨头坏死的发病机制密切相关,因此移植足够数量的骨髓干细胞更有利于解决坏死区的修复重建问题。目的：分析病灶清除植骨联合骨髓单个核细胞治疗早期股骨头坏死的临床疗效。方法：2011年3月至2012年7月收治25例33髋股骨头坏死患者,男15例,女10例;年龄18-55岁,平均34.6岁;病程8-20个月,平均14个月。病因：激素性5例7髋,酒精性4例5髋,特发性16例21髋。ARCO分期：ⅡA期8髋,ⅡB期15髋,ⅡC期9髋,ⅢA期1髋,治疗前Harris评分为（55.2±6.5）分,目测类比评分为（6.81±1.19）分,MRI测量股骨头坏死体积为（13.38±5.1）cm3。经过病灶清除植骨及自体骨髓单个核细胞移植,随访观察Harris评分、目测类比评分和MRI测量股骨头坏死体积。结果与结论：治疗后患者切口均Ⅰ期愈合,所有患者均获随访,随访时间12-18个月,平均15个月。治疗后3,6个月,1年Harris评分明显高于治疗前,目测类比评分和坏死体积值明显低于治疗前,差异有显著性意义（P〈0.05）。治疗后1年时Harris评分为（85.6±7.8）分,目测类比评分为（2.38±0.73）分,坏死体积为（7.23±3.3）cm3。髋关节功能评估：优15髋,良11髋,可4髋,差3髋（最终进行全髋关节置换）。结果表明病灶清除植骨联合自体骨髓单个核细胞移植治疗早期股骨头坏死近期疗效肯定,远期效果仍有待进一步观察。     

干细胞移植治疗脊髓损伤：问题与前景

背景：目前,脊髓损伤的治疗仍然是世界性难题,采用干细胞移植的方法治疗脊髓损伤是近年来脊髓损伤修复研究的热点之一。目的：综述干细胞移植治疗脊髓损伤基础与临床的研究进展及应用前景。方法：应用计算机检索索PubMed数据库及CNKI数据库2000年以后收录文章,检索词为“脊髓损伤,干细胞,细胞移植”,“spinal cord injury,stem cel ,cel therapy”,筛选干细胞移植治疗脊髓损伤基础与临床研究,排除Meta分析等二次性文献,排除重复或较陈旧的文献,纳入52条篇归纳总结。结果与结论：文章对干细胞种类及生物学特性、干细胞移植治疗脊髓损伤的基本机制、干细胞移植技术、干细胞治疗的疗效等进行了总结,并提出干细胞移植治疗脊髓损伤所面临的问题及展望。