干扰硒蛋白K对小鼠T淋巴细胞钙流和白介素2受体表达的影响

目的 探讨硒蛋白K(Selenoprotein K,Sel K)基因沉默(RNA silence,RNAi)对小鼠T淋巴细胞内钙流和白介素2受体(Interleukin-2 Receptor,IL-2R)分泌的影响。方法 制作小鼠T淋巴细胞干扰载体p GPU-Sel K,用脂质体Lipofectin 2000将干扰质粒和对照质粒转染小鼠T淋巴细胞,Real time PCR和Western Blot分别检测核酸和蛋白水平Sel K的表达,流式细胞仪检测细胞内钙离子浓度,Real time PCR检测IL-2R的分泌。结果 与转染的对照组质粒p GPU-NC比较,转染p GPU-Sel K载体的细胞Sel K在m RNA和蛋白水平表达分别显著降低了42.37%(P0.01)和45.44%(P0.01)。另外干扰组整体细胞内钙离子浓度显著低于对照组(P0.05),细胞分泌IL-2R水平也显著降低(P0.05)。结论 干扰载体p GPU–Sel K可以下调小鼠T淋巴细胞Sel K的表达,抑制细胞的钙流和IL-2R的分泌,从而可能改变小鼠T淋巴细胞增殖分化。     

硒代蛋氨酸对小鼠巨噬细胞增殖及硒蛋白K的影响

目的探究硒代蛋氨酸(Selenomethionine,Se-Met)对小鼠巨噬细胞的增殖及巨噬细胞中硒蛋白K(Selenopro-tein K,Sel K)的影响,并观察Sel K在小鼠巨噬细胞中的定位。方法加硒代蛋氨酸(Se-Met)培养巨噬细胞,用CCK-8法检测巨噬细胞的增殖活力,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质免疫印迹技术检测Se-Met对小鼠巨噬细胞中Sel K m RNA和Sel K蛋白表达的影响;用细胞免疫荧光法观察Sel K在巨噬细胞中的位置。结果 Se-Met能促进巨噬细胞的增殖,其中浓度为1μmol/L Se-Met在处理巨噬细胞24 h和48h后,能显著性地促进巨噬细胞的增殖(P0.01);1μmol/L Se-Met能使巨噬细胞中Sel K的m RNA含量显著增加(24 h处理组,P0.05;48 h处理组,P0.01),另外,Sel K蛋白的含量也有所增加(48 h处理组,P0.05)。浓度为100μmol/L Se-Met在处理巨噬细胞48 h后,能极显著性地抑制巨噬细胞增殖(P0.01)。结果还显示Sel K蛋白与内质网标志物KDEL都存在于巨噬细胞内的相同位置上。结论 Se-Met在促进巨噬细胞增殖的同时,使存在于内质网上的Sel K增加。     

DNA-PKcs影响肝癌耐药细胞BEL7402/5-FU耐药性的机制

目的利用RNA干扰技术探讨DNA-PKcs基因沉默影响肝癌细胞BEl7402/5-FU耐药性的机制。方法将靶向DNA-PKcs的干扰质粒shDNA-PKcs转染肝癌耐药细胞BEL7402/5-FU,利用实时荧光定量PCR及Western blot法检测转染干扰质粒后DNA-PKcs基因的沉默效率;Western blot检测Artemis、磷酸化Artemis蛋白水平的表达。结果实时荧光定量PCR及Western blot检测结果显示转染shDNA-PKcs后,DNA-PKcs mRNA及蛋白水平表达均下调（P〈0.05）;Western blot检测结果显示shDNA-PKcs转染组Artemis蛋白表达水平与对照组相比均有所降低（P〈0.05）,磷酸化Artemis蛋白表达水平在转染前后无明显变化（P〉0.05）。结论 ShDNA-PKs干扰质粒能抑制Bel-7402/5FU细胞中DNAPKcs、Artemis蛋白的表达、但对P-Artemis的表达无影响。     

Ddx3基因在不同日龄小鼠睾丸组织中的表达

目的:观察小鼠睾丸初次生精过程中的发育特点;检测Ddx3基因与蛋白在小鼠睾丸生精过程中的表达模式;探讨Ddx3基因对小鼠睾丸生精的影响。方法:采用HE染色与PAS染色的方法观察不同日龄小鼠睾丸组织的石蜡切片;用荧光实时定量PCR的方法检测Ddx3 mRNA在小鼠睾丸精子发生过程中的表达;采用免疫组织化学和Western blot方法检测DDX3蛋白在小鼠睾丸初次生精过程中的表达特点和细胞内定位。结果:HE染色结果显示4、13、21、35、42和60日龄是小鼠睾丸发生初次生精过程的特定阶段;荧光实时定量PCR结果显示Ddx3 mRNA在4日龄以后小鼠睾丸组织中均有表达,于35日龄开始明显增高,随后表达水平保持稳定;Western blot显示DDX3蛋白在35、42和60日龄小鼠睾丸生精小管中出现特异性表达并逐渐增高;免疫组织化学法显示DDX3蛋白主要在初级精母细胞和精子细胞的细胞质和细胞核中表达。结论:DDX3蛋白在小鼠初次精子发生过程中呈现特异性表达,提示Ddx3基因可能在精母细胞与精子细胞的发育中发挥作用。     

结直肠癌组织APRIL表达检测方法的比较

目的 观察结直肠癌组织中增殖诱导配体(APRIL)表达检测方法,实时荧光定量PCR法、免疫组化染色法的相关性.方法 实时荧光定量PCR法检测29例结直肠癌患者肿瘤组织及自身癌旁组织;免疫组化染色法检测相同29例结直肠癌患者组织及正常结直肠组织12例的APRIL蛋白表达.结果 29例结直肠癌组织中实时荧光定量PCR法检测APRIL阳性率为93.1%(27/29);免疫组化染色法检测APRIL阳性率为89.6%(26/29);两方法比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 实时荧光定量PCR法、免疫组化染色法检测APRIL的表达方法,能为临床提供有诊断参考价值的信息.     

实时荧光定量PCR检测核糖体蛋白S13基因在NK/T细胞淋巴瘤中的表达

目的应用实时荧光定量PCR技术检测NK／T细胞淋巴瘤核糖体蛋白S13（RPS13）基因的表达。方法提取石蜡包埋NK／T细胞淋巴瘤组织总RNA,逆转录为cDNA。应用实时荧光定量PCR技术检测NK／T细胞淋巴瘤RPS13表达水平。结果20例NK／T细胞淋巴瘤RPS13表达水平明显低于对照．结论RPS13基因表达水平明显低于正常人外周血淋巴细胞,这可能在NK／T细胞淋巴瘤发生、发展中起到一定作用。     

内质网应激相关因子PERK和ATF6在结肠癌中的表达及意义

目的 探讨内质网应激相关因子蛋白激酶R样内质网调节激酶(PERK)和活化转录因子6(ATF6)在结直肠癌组织中的表达情况,分析PERK和ATF6在结肠癌发生发展中的作用.方法 选择手术切除结肠癌组织及距离病变组织5 cm以上正常组织,采用实时荧光定量PCR技术(RT-PCR)检测PERK和ATF6的mRNA表达情况,免疫组织化学法(IHC)、Western blot法检测PERK和ATF6蛋白的表达情况,并结合临床病理特征,分析其与结肠癌发生、发展之间的关系.结果 肿瘤组织ATF6和PERK mRNA表达均较正常组织下调(P＜0.05).IHC和Western blot结果显示PERK和ATF6在结肠癌中的表达均显著低于正常组织(P＜0.05).PERK和ATF6主要定位于上皮细胞中.结论 PERK和ATF6在结肠癌中的表达水平下降说明缺乏适当的内质网应激反应可能在肿瘤的发生机制中起作用.     

Rho-GDI在子痫前期蜕膜组织中的表达及其意义

目的探讨Rho-GDI在子痫前期蜕膜组织中的表达及意义。方法采用荧光实时定量PCR(SYBR GREEN I assay)、Western blot和免疫组织化学技术分别对正常足月妊娠妇女(对照组)30例、晚发型重度子痫前期30例及早发型重度子痫前期30例的Rho-GDI mRNA及蛋白进行测定。结果 Rho-GDI主要表达于蜕膜细胞的胞浆、胞核和少许间质。荧光实时定量PCR,Western blot和免疫组化表达等各方法验证结果显示Rho-GDI mRNA及蛋白在正常妊娠组蜕膜组织中表达最高;早发型子痫前期组中次之;晚发型子痫前期中最低。正常组与早发组和晚发组比较,差异均有显著性(P<0.05),但早发组与晚发组间比较的差异无显著性(P>0.05)。结论 Rho-GDI在子痫前期蜕膜组织中表达下调,Rho-GDI可能通过调控滋养细胞浸润和血管平滑肌舒缩状态等环节参与了子痫前期的发生发展。     

人Man2c1转基因小鼠外周血中性粒细胞和CD8+T细胞的调节

目的以转hMan2c1基因小鼠为模型,分析hMan2c1基因在转基因小鼠脾脏的蛋白表达和活性,研究hMan2c1基因对于机体免疫系统的影响。方法Western blot方法检测hMan2c1基因在脾脏的蛋白表达并检测小鼠脾脏α-甘露糖苷酶活性;血常规分析外周血中各种血细胞的比例;以BSA作为抗原观察机体的免疫应答;流式细胞技术观察外周血中CD4 、CD8 、B、NK细胞的数量。结果Western blot结果显示,与野生型小鼠比较,hMan2c1基因在转基因小鼠脾脏组织有明显的表达,α-甘露糖苷酶活性明显增高,中性粒细胞明显升高。BSA刺激后,转基因小鼠外周血免疫细胞中的CD8 T淋巴细胞明显高于野生型小鼠。结论hMan2c1基因在小鼠脾脏表达引起α-甘露糖苷酶活性显著升高,并进一步影响淋巴细胞的生成,增加中性粒细胞和CD8 T淋巴细胞对免疫原的应答。     

受体相互作用相关蛋白140在正常小鼠脑发育过程中的表达

目的了解受体相互作用相关蛋白（RIP）140在正常小鼠脑发育时期的表达情况。方法应用免疫组化方法研究RIP140在脑组织中的定位,并应用实时定量PCR和Western印迹研究RIP140在正常小鼠不同发育时期的动态表达模式。结果免疫组化结果显示RIP140在正常小鼠脑发育过程中始终存在表达,且在大脑皮质、海马、丘脑等部位有明确的表达。实时定量PCR结果显示RIP140 mRNA在正常小鼠脑不同发育时期的表达呈现动态变化模式,Western印迹结果示RIP140蛋白在小鼠脑不同发育时期的表达也呈现动态变化模式,且与mRNA的表达具有正相关性（rs=0．767,P=0．016〈双侧〉）。结论RIP140参与了正常小鼠脑发育和脑功能的行使。     

硒蛋白K基因干扰对T淋巴细胞内质网钙稳定蛋白的影响

目的探讨SelK mRNA干扰效果及其硒蛋白K(SelK)基因干扰后对细胞内质网钙稳态蛋白(endoplasmicreticulum calcium homeostasis protein,CHERP)的表达,观察T淋巴细胞内Ca~(2+)浓度的变化。方法从SelK m RNA(NM_019979.2)的编码序列中符合设计要求的靶位点设计特异性干扰SelK mRNA的RNAi片段,构建shRNA干扰载体靶向干扰SelK RNA,用核酸序列分析方法分析重组片段的正确性,利用荧光定量PCR和Westeron blot鉴定SelK mRNA的干扰效果,采用Real time-PCR的方法检测SelK干扰后细胞内的CHERP的变化。结果阳性重组载体可以被BamH I酶切。酶切片段序列分析重组子质粒结果与所设计片段完全一致,正确率为100.0%。三个ShRNA表现了不同的干扰效果,sh222、sh102和sh101的干扰效率分别为12.13%、16.46%和42.37%,在核酸水平上重组质粒sh101对SelK的干扰效果最佳,与sh222和sh102相比,差异有统计学意义(P0.01)。Western blot检测重组质粒sh101在蛋白水平上的干扰效率为45.4%,干扰组细胞中CHERP的表达与对照组相比抑制率达到40.0%。结论重组质粒sh101对SelK在核酸和蛋白质水平上都有较好的干扰效率,SelK干扰对细胞中CHERP的表达有抑制的作用,或因此打乱了内质网与胞质中的钙离子平衡,从而影响到了细胞内游离的钙离子浓度,是导致T淋巴细胞激活的因素之一。     

姜黄素对人肝癌SMMC-7721细胞裸鼠移植瘤的抑制作用及其机制

目的:探究姜黄素对人肝癌SMMC-7721细胞裸鼠移植瘤的生长抑制作用及其潜在机制。方法:采用人肝癌SMMC-7721细胞建立肝癌移植瘤模型,将20只荷瘤裸鼠均分为对照组和10、50、100 mg/kg姜黄素组,每组5只,均采用腹腔注射给药,分别给予生理盐水及对应剂量姜黄素,每日1次,每次200μL,连续16 d。自给药当天起,隔天观察和记录各组裸鼠体重和瘤体体积;16 d后麻醉裸鼠,分离瘤组织,记录瘤重并计算抑瘤率;采用蛋白免疫印迹法测定瘤组织中内质网应激通路相关蛋白及凋亡相关蛋白的表达水平;采用免疫组织化学法检测瘤体组织中葡萄糖调节蛋白78(GRP78)和需肌醇酶(IRE1)阳性表达水平。结果:不同剂量姜黄素组裸鼠体重增长无显著差异(P>0.05),但50和100 mg/kg姜黄素组裸鼠移植瘤体积生长较对照组和10 mg/kg姜黄素组明显减小(P均<0.05)。10、50和100 mg/kg姜黄素组抑瘤率分别为35.3%、45.7%、54.7%。蛋白印迹结果显示,与对照组相比,50、100 mg/kg姜黄素组GRP78、IRE1、C/EBP同源蛋白(CHOP)以及Cle...     

蛋白C P275S突变导致遗传性蛋白C缺陷症的分子机制研究

目的研究蛋白C（PC）基因P275S突变导致遗传性PC缺陷症的分子机制。方法构建PC基因野生型和P275S突变型表达质粒,并瞬时转染HEK293T细胞和COS 7细胞进行体外表达。ELISA检测转染细胞上清液和细胞裂解液的PC抗原;实时荧光RT-PCR（real time,RT-PCR）检测转染细胞PC mRNA表达量的改变;细胞免疫荧光染色检测PC在内质网和高尔基体内的分布。结果转染细胞上清液和细胞裂解液中的PC P275S抗原分别为野生型PC抗原的22.6%和78.9%;实时RT-PCR结果显示,与野生型PC相比,PC P275S突变体在mRNA水平没有减少;细胞免疫荧光染色显示,野生型PC蛋白在内质网和高尔基体中均有大量分布,而PC P275S突变蛋白主要位于内质网中。结论分泌障碍和细胞内降解是PC P275S导致PC缺陷症的原因。     

乃豆蛋白A通过ERK信号分子对小鼠脾脏细胞表达纤维化蛋白的诱导作用

目的：探讨刀豆蛋白A（ConA）对小鼠脾脏细胞表达纤维化蛋白（FBRS）的诱导作用及可能的分子信号机制。方法：选择雄性BALB／c小鼠,制备小鼠脾脏细胞悬液。采用实时荧光定量PCR检测ConA刺激不同时间脾脏细胞后FBRS的mRNA表达水平,Westernblot检测ConA刺激不同时间后FBRS的蛋白表达水平,以及信号通路阻滞剂对FBRS的蛋白表达的影响和ConA对胞外信号调节激酶（ERK）信号表达的活化作用。结果：ConA能刺激小鼠脾脏细胞FBRS的mRNA和蛋白表达,ERK信号通路阻断剂PD98059可以明显抑制ConA引起的FBRS蛋白表达,且ConA刺激后能够明显活化ERK的表达。结论：ConA可通过活化ERK信号通路,诱导小鼠脾脏细胞FBRS的表达。     

百草枯致大鼠肺纤维化肺组织内质网相关凋亡基因Caspase-12的表达

目的 观察内质网相关凋亡基因半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶12（ Caspase-12） 在百草枯诱导肺纤维化模型大鼠肺组织中的表达。方法 30 只Spragne-Dawley（ SD） 大鼠随机分为对照组、14 d模型组和28 d 模型组。采用百草枯灌胃法复制肺纤维化模型。逆转录-聚合酶链反应（ RT-PCR）检测肺内Caspase-12 mRNA 表达, 免疫组化检测其蛋白表达。HE 和Masson 染色判断肺组织肺泡炎及肺纤维化程度。结果 HE 和Masson 染色结果证实成功复制肺纤维化模型。模型组大鼠肺泡炎和肺纤维化程度较对照组严重（ P 〈0. 01） 。与对照组比较, Caspase-12 表达在14 d 模型组中明显升高（ P 〈0. 01） , 在28 d 模型组中更高（ P 〈 0. 01） 。结论 百草枯中毒大鼠肺内质网相关凋亡基因Caspase-12 表达增高, 提示内质网应激在百草枯中毒引起的肺纤维化中发挥重要作用。     

Th17细胞在小鼠H22原位肝癌模型中的表达和意义

目的 检测小鼠原位肝癌模型中Th17细胞的表达,探讨其在肝癌免疫中的作用. 方法 30只Balb/C小鼠随机分为肝癌模型组（10只）、生理盐水对照组（10只）、空白对照组（10只）,流式细胞术检测小鼠分离纯化后的各组新鲜脾脏Th17细胞的相对比例;实时RT-PCR检测各组肝组织IL-17基因和RORγT基因表达水平.结果 肝癌模型组脾脏Th17/ CD4＋T细胞的比例高于生理盐水对照组脾脏、空白对照组脾脏,差异有统计学意义（P 〈 0.01）,而各对照组之间的比例差异无统计学意义（P 〉 0.05）.肝癌模型组肿瘤组织IL-17 mRNA和RORγT mRNA的表达水平均高于各自对照组,差异有统计学意义（P 〈 0.01）,而IL-17 mRNA和RORγT mRNA在各自对照组之间表达水平的差异无统计学意义（P 〉 0.05）. 结论 Th17细胞在小鼠原位肝癌模型中数量增多,IL-17表达升高,增强免疫反应,但在肝癌免疫中的作用及机制复杂,有待深入研究.     

Poly I∶C刺激对裸鼹鼠体内自噬水平的影响

目的 研究多聚肌苷-多聚胞苷酸钠盐（Poly I∶C）对裸鼹鼠自噬水平的影响.方法 成年裸鼹鼠以及C57BL/6小鼠分别随机分成Poly I∶C给药组和对照组,分别腹腔注射Poly I∶C和生理盐水.Poly I∶C给药12h后,组织切片HE染色观察小肠组织的病理变化,电镜观察细胞结构的变化,实时定量PCR检测小肠组织中炎症相关因子IL-1、ATG5的mRNA表达情况,蛋白印迹检测小肠组织中自噬相关蛋白LC3B、Beclin 1表达情况.结果 Poly I∶C给药后,裸鼹鼠小肠组织未出现显著的病理变化,但C57BL/6小鼠小肠组织腺体部出现广泛性出血;电镜观察发现,裸鼹鼠小肠组织细胞中线粒体增多、变长,自噬体数量显著增加,而小鼠组织细胞线粒体有大量的空泡化,滑面内质网扩张;实时定量PCR检测未发现组织中IL-1、ATG5 mRNA表达有显著变化;蛋白印迹检测发现,给药后裸鼹鼠组织中LC3B蛋白表达显著上调（P＜0.05）,而C57BL/6小鼠则下调（P＜0.05）.结论 Poly I∶C给药引起裸鼹鼠自噬水平上调,同时,裸鼹鼠自噬水平的上调亦可以提高机体的适应能力,进而起到抵抗Poly I∶C损伤的作用.     

内质网应激在肝细胞凋亡中的意义

目的:探讨内质网应激在肝细胞凋亡中的意义。方法:原位二步灌流法分离并培养BALBC小鼠原代肝细胞,化学合成法制备抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-12小分子干扰RNA(caspase-12 siRNA),脂质体包裹转染小鼠原代肝细胞。毒胡萝卜内酯4μmol/L诱导肝细胞凋亡。RT-PCR、Western blot检测抑制效果;MTT比色试验检测细胞活力,反映细胞凋亡。结果:siRNA对小鼠原代肝细胞caspase-12 mRNA在浓度200nmol/L时抑制率为86.22%;对凋亡细胞procaspase-12抑制率为50.04%,与单纯诱导凋亡细胞差异有统计学意义(P<0.01);MTT比色试验检测发现,与单纯诱导凋亡细胞相比,转染siRNA后细胞活力增高51.65%,两者差异有统计学意义(P<0.05)。结论:抑制内质网应激介导细胞凋亡的特异酶caspase-12,能在一定程度上阻抑小鼠原代肝细胞凋亡的发生,内质网应激在肝细胞凋亡中具有重要意义。     

α-突触核蛋白对内质网应激及细胞凋亡影响

目的:构建α-突触核蛋白(α-synuclein,SNCA)和SNCA突变基因(SNCAmu)过表达转染293T细胞,观察内质网应激及细胞凋亡.方法:应用PCR技术扩增目的基因并插入慢病毒载体质粒,重组质粒的构建及包装293T细胞,转染24 h后用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(green fluorescent prot...