Huwe1-shRNA 靶向沉默L2.3神经干细胞的Huwe1表达

【摘要】 目的 探讨Huwe1 shRNA通过慢病毒载体转染L23神经干细胞，是否可以靶向沉默L23神经干细胞的Huwe1基因。方法 将体外培养的L23神经干细胞分成3组：huwe1 shRNA未转染组（control 组）、阴性序列转染组（control shRNA组）、huwe1 shRNA转染组（Huwe1 shRNA组）。Control组：仅常规体外培养L23神经干细胞。不将阴性序列和Huwe1 shRNA通过慢病毒载体转染L23神经干细胞。Control shRNA组：阴性序列通过慢病毒转染体外培养的L23神经干细胞。Huwe1 shRNA组：Huwe1 shRNA通过慢病毒载体成功感染体外培养L23神经干细胞。分别收集三组体外培养的L23神经干细胞，应用western blot 方法分别检测三组L23神经干细胞Huwe1蛋白的表达。 结果 与control组、control shRNA组比， Huwe1shRNA组体外培养的L23神经干细胞huwe1蛋白表达条带显著减弱、变细（P < 005）。与control组Huwe1蛋白的相对表达量比，Huwe1shRNA组Huwe1蛋白的相对表达量是control组的25%（P < 005）。与control 组比，control shRNA组和Huwe1shRNA组在慢病毒载体转染L23神经干细胞，L23神经干细胞存活率无明显下降（P>005) 结论 Huwe1 shRNA通过慢病毒载体转染L23神经干细胞，可以靶向沉默L23神经干细胞Huwe1基因，却不影响L23神经干细胞的存活率。     

针对糖尿病易感基因Vβ13的慢病毒系统的建立及其对T细胞的转导

目的 应用慢病毒介导的RNA干扰技术,有效沉默连接红色荧光蛋白mCherry与靶基因1型糖尿病易感基因Vβ13的表达,建立一种简便有效基因沉默的系统,并初步研究慢病毒感染T细胞的可能性.方法 以Vβ13 mRNA编码序列作为干扰靶点,以慢病毒质粒UTG作为载体,构建靶向Vβ13的shRNA表达质粒,构建携带Vβ13的mCherry红色荧光蛋白的质粒作为验证shRNA有效性的靶点,并转染293FT细胞.通过红色荧光的表达及RT-PCR和Western blot确定最佳沉默Vβ13序列后,将有效的UTG-Vβ13质粒与辅助质粒共转染293FT细胞,低温超高速离心,获取高滴度慢病毒.应用慢病毒感染大鼠T细胞,光镜观察T细胞被慢病毒感染的情况,流式细胞术检测T细胞的绿色荧光表达情况.结果 成功构建Vβ13-shRNA慢病毒载体UTG-shRNA-Vβ13,RT-PCR及Western blot结果显示慢病毒感染的293FT细胞Vβ13 mRNA及蛋白表达相对于对照组显著降低.构建的慢病毒可以成功感染T细胞.结论 红色靶基因-绿色慢病毒系统具有简便的筛选性能;UTG慢病毒对神经干细胞具有较高感染效率.可作为一种良好的基因导入载体,实现慢病毒介导的RNA干扰在T细胞内的有效表达,并为T细胞过继性转移的相关研究提供技术支持.     

慢病毒转染大鼠骨髓间充质干细胞研究

目的分离培养大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow stromal stemcells,BMSCs）并进行慢病毒载体介导的基因转染研究。方法利用密度梯度离心法分离、纯化、扩增培养大鼠骨髓间充质干细胞。以脂质体法进行慢病毒感染大鼠BMSCs。结果分离培养出大鼠BMSCs,并用携带绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的慢病毒成功感染大鼠BMSCs。结论获得大鼠BMSCs并进行慢病毒载体介导的基因修饰,为骨髓间充质干细胞基因治疗研究奠定了基础。     

人FAM172A干扰慢病毒载体的构建及在甲状腺乳头状癌细胞中的表达

目的 构建人FAM172A干扰慢病毒表达载体,并包装成FAM172A干扰慢病毒感染甲状腺乳头状癌细胞予以鉴定。方法 根据人FAM172A mRNA序列设计退火Oligo,与慢病毒载体pL/shRNA/F经酶切、连接、转化、测序鉴定。病毒包装后,转染HEK293细胞测定病毒滴度。将重组慢病毒感染甲状腺乳头状癌细胞,利用荧光显微镜和QPCR检测FAM172A的表达。结果 重组慢病毒载体pL/shRNA/F-shFAM172A经PCR扩增及测序鉴定正确,病毒包装后荧光显微镜观察到FT293细胞中有大量绿色荧光,测定病毒滴度为5×10⁶TU/ml。FAM172A干扰慢病毒感染的甲状腺乳头状癌细胞中FAM172A表达被显著减少。结论 成功制备了人重组FAM172A干扰慢病毒,并在甲状腺乳头状癌细胞中高效减少FAM172A的表达,为进行FAM172A的功能和机制奠定了良好的基础。     

hTERT基因修饰神经干细胞移植修复大鼠脊髓损伤

目的 对神经干细胞的生物学特性进行观察,探讨hTERT基因修饰神经干细胞移植对修复大鼠脊髓损伤的影响。方法 体外培养的大鼠神经干细胞,用病毒PLXSN为载体介导hTERT基因反转录转染神经干细胞,分为阴性转染组、对照组与hTERT转染组3个组。经Western blot法检测分析hTERT蛋白的表达。运用细胞生长曲线、CCK-8比色法两种方法,分析细胞生长的优化作用。将造模成功的72只大鼠随机分为hTERT-NSCs、NSCs与对照组3组,每组各分24只,通过改良的Allen打击法来建立大鼠急性脊髓损伤模型。通过斜板试验,BBB评分给各组大鼠进行运动功能检测。通过HE染色及荧光显微镜研究,PKH-26标记的分布情况及NSC存活取材进行病理切片。术后72h通过RT-PCR分析脊髓损伤区周围MMP9/2、AQP/9基因的表达,运用UNEL法分析细胞凋亡情况。荧光显微镜观察PKH-26标记的分布情况及NSCs存活。结果 hTERT基因转染大鼠神经干细胞后,hTERT基因转染组蛋白水平有高表达、细胞的生长速度出现明显增快,相比与阴性hTERT转染组与对照组,各组间差异有统计学意义(P<0.05)。对照组的细胞凋亡指数略低于阴性转染组,阴性转染组略低于hTERT转染组大鼠下肢运动功能评价。与对照组相比hTERT转染组AQP4/9基因表达均较显著降低。PKH-26标记的阳性细胞数:对照组最少,hTERT转染组最多,阴性hTERT转染组次之,各组差异有统计学意义(P<0.05)。结论 通过PLXSN病毒为载体介导hTERT基因逆转染神经干细胞,可以促进大鼠神经干细胞增殖。hTERT基因修饰神经干细胞移植可促进脊髓损伤大鼠神经突触的再生,降低脊髓损伤区周围AQP/9、神经细胞凋亡和MMP9/2基因的表达,且能够促进大鼠的电生理及肢体运动功能的恢复。     

小鼠CD80和CD86基因RNA干扰慢病毒载体的构建及体外对树突状细胞的作用

 目的 构建小鼠CD80和CD86基因RNA干扰慢病毒表达载体，并在体外观察其对小鼠骨髓源性树突状细胞（dendritic cell，DC）的作用。方法 针对已经筛选确定的CD80基因RNA干扰有效靶序列，合成靶序列的双链DNA，接入pGCL-GFP载体，再与pHelper1.0和pHelper2.0质粒共转染293T细胞，包装产生慢病毒，以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度；同法构建出CD86基因RNA干扰慢病毒载体。慢病毒感染体外培养的DC，通过荧光显微镜检测感染效率，Annexin V/PI双染色法检测感染细胞凋亡和坏死情况，流式细胞仪检测CD80和CD86的表达情况。结果 PCR和测序证实，pGCL-CD80shRNA和pGCL-CD86shRNA慢病毒载体构建正确，病毒滴度均达2×107TU/mL，适合感染DC的MOI值为20，此时慢病毒对DC具有低毒性，感染效率为85.42%。CD80和CD86表达的抑制率分别为82.05% 和77.78%。结论 成功构建出小鼠CD80和CD86基因RNA干扰慢病毒载体，其有明显抑制DC表面CD80和CD86的表达，这为移植物排斥提供了新的治疗手段。     

大鼠脊髓来源神经干细胞NgR的表达

目的：检测大鼠脊髓来源神经干细胞Nogo-66受体（NgR）是否表达。方法：悬浮培养法培养大鼠脊髓来源的神经干细胞，形成神经球后，以免疫荧光法鉴定神经干细胞并检测NgR的表达情况。结果：神经球及单个神经干细胞均显著表达NgR。结论：NgR在脊髓神经发育的干细胞阶段即开始表达。     

人干细胞白血病基因重组慢病毒载体的构建及其在Cajal样间质细胞中的表达

摘要：目的  构建含人干细胞白血病（SCL）基因的重组慢病毒载体,并转染体外培养的Cajal样间质细胞（ICC）,为进一步利用慢病毒表达载体行体内实验奠定基础。方法  通过聚合酶链反应（PCR）将人SCL基质粒内的遗传物质扩增,与慢病毒载体质粒GV287-EGFP结合,构建重组质粒GV287-EGFP/SCL,通过Western blot检测及基因测序对阳性克隆进行鉴定,并测定病毒滴度。体外分离、培养及鉴定ICC,重组慢病毒载体以感染复数（MOI）值为0.5、1.0、5.0、10.0、50.0和100.0时,分别转染ICC,通过激光共聚焦显微镜观察,计算不同MOI值的转染效果,确定最佳MOI值。重组慢病毒载体以最佳MOI值感染ICC作为实验组,以空载体转染的ICC（空载体组）及未转染的ICC（空白组）作为对照,通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测SCL基因在ICC中的表达。结果  经Western blot检测及基因测序鉴定SCL重组慢病毒表达载体构建成功,并成功转染ICC,激光共聚焦显微镜下可观察到强绿色荧光。MOI为10时转染效果最佳,转染效率>85%;RT-PCR结果表明,实验组SCL基因的表达量高于空载体组和空白组。结论  成功制备人SCL基因重组慢病毒载体,并能高效转染ICC,介导SCL基因在ICC中表达。

     

沉默CX3CL1基因对骨髓间充质干细胞生长及其趋化效应的影响

目的 构建大鼠趋化因子CX3C的配体1(chemokine CX3C ligand 1,CX3CL1)基因慢病毒RNA干扰(RNA interference,RNAi)载体,观测其沉默CX3CL1基因对骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells,bMSCs)生长及其趋化效应的影响.方法 首先分离、培养大鼠骨髓bMSCs,并予以流式细胞术检测鉴定.针对CX3CL1基因mRNA序列,筛选3个小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)靶点并予以合成.把合成的siRNA导入bMSCs,Western blot检测其对靶基因编码蛋白的抑制效应,以此明确最佳siRNA.设计与合成针对最佳siRNA序列的短发夹RNA(short hair RNA,shRNA),连入CD513B-1慢病毒载体,构建CD513B-1/CX3CL1 shRNA慢病毒,并行测序鉴定.测序正确者用293T细胞包装成具有高效感染力的CD513B-1/CX3CL1 shRNA重组慢病毒,该重组病毒用于感染bMSCs.分离培养大鼠脾巨噬细胞,将其与被感染的bMSCs共培养.倒置显微镜下观测被感染bMSCs的绿色荧光蛋白(GFP)的表达情况;CCK-8检测被感染bMSCs的生长变化;Real-time PCR检测被感染bMSCs的CX3CL1与核抗原PCNA基因的表达变化;Western blot检测被感染bMSCs的CX3CL1和PCNA蛋白,与被感染的bMSCs共培养的脾巨噬细胞的趋化因子M-CSF和IL-8的表达变化.结果 大鼠bMSCs得以分离、培养和鉴定.筛检得CX3CL1基因的最佳干扰序列:CTCTATGAGCAArTTATTTA;测序证实,成功构建重组慢病毒载体CD513B-1/CX3CL1 shRNA.荧光观察表明,被CD513B-1/CX3CL1shRNA病毒感染的bMSCs明显表达GFP.CCK-8检测结果显示,与对照细胞比较,沉默CX3CL1的bMSCs的生长减慢,48 h开始更为明显(P＜0.01);Real-time PCR、Western blot检测结果证实,CX3 CL1基因的shRNA慢病毒能有效沉默bMSCs的CX3CL1,并下调其核抗原基因PCNA及其蛋白的表达,沉默CX3 CL1的bMSCs能下调与其共培养的脾巨噬细胞的趋化因子M-CSF、IL-8的表达.结论 成功构建CX3 CL1基因RNAi重组慢病毒载体.该病毒载体能有效沉默bMSCs的CX3CL1基因,使bMSCs的生长减慢并下调其核抗原PCNA基因及其编码蛋白的表达.沉默CX3 CL1的bMSCs能下调与其共培养的脾巨噬细胞的趋化因子M-CSF、IL-8的表达.     

慢病毒介导的Math1基因感染神经干细胞研究

目的:探讨慢病毒携带目的基因Math1感染神经干细胞的适宜条件及其影响。方法:以不同感染复数(MOI)的慢病毒分别感染神经干细胞,确定最适感染条件。无血清培养液继续培养,观察感染效率有无下降。结果:随着MOI的增加,慢病毒的效率效率逐渐增加;当MOI为10时,感染效率达(83.83±1.49)%。无血清培养液继续培养30d后,感染效率达(81.27±1.48)%,与继续培养前比较无明显下降(P>0.05)。结论:携带目的基因的重组慢病毒可成功感染神经干细胞,被感染的神经干细胞的生长无明显改变。     

bcl-2基因修饰神经干细胞移植修复大鼠脊髓损伤

目的探讨bcl-2基因修饰神经干细胞移植对脊髓损伤大鼠损伤神经功能恢复的影响。方法体外培养大鼠神经干细胞,经Ad-EGFP为载体介导端B淋巴细胞瘤-2基因(bcl-2)基因转染神经干细胞,分为3组:对照组、阴性转染组、bcl-2转染组。Western-blot检测神经干细胞在转染前后bcl-2蛋白的表达。成年雌性SD大鼠85只,造模成功72只,随机分为对照组,NSCs组,bcl-2-NSCs组,24只/组,按照改良的Allen打击法建立大鼠急性脊髓损伤模型。通过BBB评分、斜板试验进行运动功能评定。造模后7 d通过RT-PCR及Western-blot检测检测脊髓损伤区周围HSP27、c-fos基因的表达,TUNEL法检测细胞凋亡情况。造模后4周取材行病理切片HE染色及荧光显微镜观测EGFP标记的NSC存活及分布情况,通过SEP和MEP观察大鼠神经电生理恢复情况。结果 bcl-2基因转染大鼠神经干细胞后,bcl-2转染组与对照组、阴性转染组相比bcl-2基因和蛋白水平均有表达(P0.05);大鼠下肢运动功能评价bcl-2-NSCs组优于NSCs组,NSCs组优于对照组。造模后72 h,bcl-2-NSCs组细胞凋亡数均明显低于对照组和NSCs组(P0.05)。造模后7 d,与对照组和NSCs组相比,bcl-2-NSCs组HSP27基因和蛋白的表达均较显著升高(P0.05),bcl-2-NSCs组c-fos基因和蛋白的表达较显著降低(P0.05)。造模后4周,HE染色对照组可见脊髓组织缺失及脊髓空洞形成,无神经轴索通过。NSCs组损伤区可见少量神经轴索样结构,脊髓空洞较小,bcl-2-NSCs组可见较多神经轴索样结构,未见脊髓空洞。EGFP标记的阳性细胞数:bcl-2-NSCs组最多,NSCs组次之,对照组未见,且各组之间差异有显著性(P0.05)。造模后4周,SEP和MEP的潜伏期:bcl-2-NSCs组NSCs组对照组,且各组之间差异有显著性(P0.05);波幅:bcl-2-NSCs组NSCs组对照组,且各组之间差异有显著性意义(P0.05)。结论通过Ad-EGFP为载体介导端B淋巴细胞瘤-2基因(bcl-2)基因转染使神经干细胞能够促进体外培养的大鼠神经干细胞增殖。bcl-2基因修饰神经干细胞移植可促进脊髓损伤大鼠神经突触的再生,升高脊髓损伤区HSP27表达,降低脊髓损伤区bcl-2基因的表达和神经细胞凋亡,改善大鼠的肢体运动功能和电生理功能。     

应用RNAi敲减MARCH6基因对乳腺癌MCF-7细胞增殖及#br# 周期的影响

目的：应用慢病毒介导的RNAi技术,在乳腺癌MCF-7细胞中敲减MARCH6基因的表达,研究其对MCF-7细胞增殖及细胞周期的影响。方法：靶向MARCH6基因的shRNA慢病毒转染293T细胞后,在荧光显微镜下观察转染效率;收集慢病毒液感染MCF-7细胞后,应用实时荧光PCR和Western印迹验证RNAi敲减MARCH6基因后,MARCH6基因mRNA和蛋白的表达影响;应用MTT,BrdU细胞增殖实验检测细胞增殖能力的变化;采用增殖指数染色流式细胞术检测细胞周期和增殖的改变。结果：通过在荧光显微镜下观察,MARCH6 shRNA慢病毒质粒成功转染293T细胞,与同明视野对比,可见80%左右的细胞带绿色荧光;感染MCF-7细胞,90%的细胞均带绿色荧光; 实时荧光PCR和Western印迹验证了MARCH6 shRNA慢病毒感染MCF-7细胞后,MARCH6在转录水平和蛋白水平表达均显著下降;MTT实验、BrdU法结果显示MARCH6基因敲减组的MCF-7细胞增殖显著下降(P<0.01),流式细胞术分析显示MARCH6敲减后MCF-7细胞出现细胞周期抑制,细胞分裂处于G1期细胞数明显增多,增殖指数显著降低。结论：敲减乳腺癌MCF-7细胞的MARCH6基因表达后,抑制了MCF-7细胞的增殖,并引起细胞周期G1期阻滞。提示MARCH6通过影响细胞周期的进展,促进乳腺癌细胞的增殖。     

黄芩苷对体外培养神经干细胞分化的影响*

【目的】探索黄芩苷对体外神经干细胞分化的影响。【方法】培养胎鼠脑皮质神经干细胞，应用细胞免疫化学方法，以神经元特异性的微管相关蛋白-2（MAP-2）和星形胶质细胞的胶质纤维酸性蛋白（GFAP）为标记，对分化后的神经干细胞进行区分，评价黄芩苷对神经干细胞分化的影响。【结果】黄芩苷可以促进神经干细胞向神经元分化，其中高剂量组明显优于对照组。【结论】黄芩苷具有促进神经干细胞分化为神经元的作用。     

低表达miR-27a对胶质瘤细胞侵袭和凋亡的影响

目的 探讨下调miR-27a表达后对U87胶质瘤细胞的影响。方法 常规培养U87细胞系,分别用慢病毒干扰质粒miR-27a-3p、miR-27a-5p转染U87细胞（Lt-I）,同时设立无义序列转染组（Lt-NC组）和空白对照组。通过嘌呤霉素处理后筛选出稳定感染的U87胶质瘤细胞。采用实时定量聚合酶链反应（RT-PCR）检测转染后miR-27a-3p、miR-27a-5p在U87细胞系中的表达水平,划痕实验、Transwell侵袭试验检测胶质瘤细胞的侵袭、迁移能力,Western blot法分析转染后的侵袭和凋亡的变化,流式细胞术分析转染前后细胞凋亡的变化,磁共振成像（MRI）和裸鼠皮下胶质瘤模型分析裸鼠肿瘤的形态、直径等特征及随时间的变化规律。结果 相对于未感染慢病毒的空白U87胶质瘤细胞,稳定感染Lt-I的U87胶质瘤细胞miR-27a表达明显下调,同时迁移、侵袭能力降低,而感染Lt-NC组（阴性对照组）则未见此改变。Western blot法检测结果显示,低表达miR-27a细胞侵袭能力降低,同时也促进细胞凋亡。流式细胞术结果显示,敲减miR-27a后,细胞凋亡率增高。磁共振成像（MRI）和裸鼠皮下胶质瘤模型显示,实验组裸鼠肿瘤的生长明显受到抑制。结论 敲减miR-27a可抑制人脑胶质瘤细胞系U87细胞的迁移、侵袭,促进其凋亡,同时抑制其成瘤能力,这可能成为胶质瘤基因治疗的新靶点。     

神经干细胞分化过程中NgR表达的变化

目的 检测大鼠脊髓来源神经干细胞分化过程中NgR的表达情况.方法 悬浮培养法培养大鼠脊髓来源的神经干细胞,形成神经球后,以免疫荧光法鉴定神经干细胞,检测神经球及其分化后不同时间点、不同细胞亚型的NgR表达情况.结果 神经干细胞分化前和分化第1天所有细胞都显著表达NgR,NgR表达阳性率在分化第2天降至82.1%±4.14%,分化第3天降至最低点35.3%±4.31%.分化后形成的细胞中只有神经元和少量未分化细胞表达NgR,星形胶质细胞和少突胶质细胞不表达NgR.结论 在神经干细胞分化成星形胶质细胞和少突胶质细胞的过程中NgR基因表达被关闭,而在其分化成神经元的过程中则始终表达NgR.     

慢病毒转染和电转染原代C57BL/6小鼠神经干细胞的比较

摘要：目的  比较慢病毒与电转染两种技术转染小鼠原代神经干细胞的优劣，获得神经干细胞高效转染的方法。方法  从C57BL/6小鼠脑组织中提取神经干细胞，进行原代培养；分别进行慢病毒转染和电转染，通过观察绿色荧光蛋白在细胞中的表达，比较两种转染方法的转染效果，并用噻唑蓝（MTT）法计算相对存活率，比较两种方法转染后对细胞的影响。结果  慢病毒与电转染两种转染技术转染神经干细胞48 h后，慢病毒的转染率为（77.6±6.6）%，高于电转染法转染率[（29.2±4.8）%]，两者比较，差异有统计学意义（P <0.05）；转染72 h后，慢病毒转染的细胞荧光表达量为（60.0±3.6）%，电转染细胞的荧光表达量仅剩（12.8±2.4）%；MTT法结果显示，电转染组细胞相对存活率为（75.8±2.3）%，慢病毒转染组细胞相对存活率为（70.1±1.4）%，两者比较，差异无统计学意义（P >0.05）。结论  对于原代神经干细胞转染，慢病毒转染法比电转染法具有更高的转染效率及长久稳定性，转染后细胞存活率与电转染法接近，因此慢病毒转染法更能满足研究者的需求。

     

核糖体蛋白S3a RNA干扰重组慢病毒载体的构建及其对细胞凋亡的影响

目的 构建表达小鼠核糖体蛋白S3a 特异性RNA干扰重组慢病毒载体(Lenti-shmRPS3a),分析其对细胞凋亡的影响。方法 设计针对小鼠RPS3a mRNA 4条干扰序列,合成相应的发夹序列,连接入慢病毒载体系统 pLLU2G-eGFP中构建重组质粒,将重组质粒与辅助包装质粒共转染293T细胞组装病毒,检测病毒滴度。病毒感染RAW264.7细胞后,RT-PCR和Western blot检测干扰效果,流式细胞术分析其对凋亡的影响。结果 PCR和测序证明成功构建出Lenti-shmRPS3a慢病毒载体,病毒滴度为6-9×10₇TU/ml;RT-PCR表明Lenti-shmRPS3a的沉默效率高达72.64%、Western Blot证明RPS3a蛋白水平表达降低;流式细胞术证明感染了Lenti-shmRPS3a慢病毒载体的细胞凋亡率较对照组明显升高。结论 表达小鼠核糖体蛋白S3a shRNA慢病毒载体能有效沉默RPS3a基因表达,促进细胞凋亡。     

慢病毒载体介导增强型绿色荧光蛋白转导兔角膜上皮细胞的体外实验研究

目的 观察慢病毒载体(lentiviral vectors, LVs)用于兔角膜上皮细胞基因转染的有效性.方法 兔角膜上皮细胞的原代及传代培养并做细胞鉴定;慢病毒载体介导的增强型绿色荧光蛋白(lenti-EGFP)以不同的感染复数(multiplicity of infection, MOI=0、1、10、50、100、500)转染实验细胞,寻找最佳转染剂量;于转染后24、48、72、96 h运用倒置荧光显微镜观察不同MOI下增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein, EGFP)的表达并计算细胞转染率;RT-PCR 方法检测EGFP基因的表达情况.结果 EGFP于转染48 h即开始有表达,随着转染时间的延长其表达增强.MOI=1、10、50、100时,角膜上皮细胞转染率随着感染复数的增加而增加,分别为(4.5±0.6)%、(30.4±0.9)%、(51.9±1.4)%、(75.4±0.7)%,各组间差异显著(P<0.05);MOI在100与500时,转染率差异不显著(P>0.05),即最适感染复数为100.RT-PCR结果提示转染细胞组EGFP基因有表达.结论 慢病毒载体能够有效转染离体兔角膜上皮细胞.