绿色荧光蛋白GFP在转化细胞和肿瘤细胞中的表达

目的：在肿瘤基因治疗研究中建立一个用绿色荧光蛋白（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ,ＧＦＰ）为标记基因的合适条件。方法用带有ＧＦＰ突变体的质粒转染到表达细胞,观察ＧＦＰ瞬时表达的情况：１．直接测定ＧＦＰ在ＣＯＳ－７细胞中的表达并观察表达的稳定性;２比较不同启动子驱动的ｐｃＤＮＡ３－ＥＧＦＰ和ｐＳＶＫ３－Ｓ６５Ｔ两种质粒在不同肿瘤细胞中的转染效率;３用ＬａｃＺ基因与ＧＦＰ基因共转染     

含绿色荧光蛋白和HyTK基因双顺反子腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建一种带有绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）和潮霉素磷酸转移酶和ＨＳＶ－ＴＫ的融合基因（ＨｙＴＫ基因）的新型腺病毒载体，用于简便、快速地了解自杀基因在恶性肿瘤中的转染效率和提高疗效。方法利用脑炎心肌炎病毒的内部核糖体进入位点（ｉｎｔｅｒｎａｌｒｉｂｏｓｏｍｅｅｎｔｒｙｓｉｔｅ，ＩＲＥＳ），将ＧＦＰ的ｃＤＮＡ与ＨｙＴＫ真核表达载体重组，构建获得含ＧＦＰ和ＨｙＴＫ基因真核表达载体，在Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ介导下转染ＣＯＳ－７细胞，检测其表达后进一步克隆获得含ＧＦＰ和ＨｙＴＫ基因双顺反子腺病毒载体。结果构建含绿色荧光蛋白和ＨｙＴＫ基因双顺反子腺病毒载体，显示该载体可获得ＨｙＴＫ基因及ＧＦＰ的良好表达。结论含绿色荧光蛋白和ＨｙＴＫ基因双顺反子腺病毒载体的构建为ＨｙＴＫ基因治疗恶性肿瘤用于临床提供了新的治疗工具及随访检测手段。     

EGFP基因在前列腺癌PC—3M细胞系中的转染与表达

目的：研究绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）在前列腺癌ＰＣ－３Ｍ细胞中表达及对其细胞周期的影响。方法：制备含绿色荧光蛋白基因的重组ＤＮＡ,用阳离子脂质体Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ Ｒｅｇａｎｔ转染培养的ＰＣ－３Ｍ细胞,在倒置荧光显微镜下观察ＧＦＰ的表达情况,同时经流式细胞仪测定阳性克隆的细胞周期。结果：转染后有１０％～１５％细胞表达绿色荧光蛋白,且阳性克隆细胞与亲本细胞的细胞周期无明显改变。结论：ＧＦＰ是研究活细胞     

PDGF—B基因的膜型表达产物促进血管平滑肌细胞增殖和胶原合成

考察ＰＤＧＦ－Ｂ基因的膜型表达产物对血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣｓ）增生、胶原合成的影响。制备供转导人ＰＤＧＦ－Ｂ基因的重组逆转录病毒，感染ＮＩＨ３Ｔ３细胞，受染ＮＩＨ３Ｔ３细胞经筛选、扩增后，制备细胞膜上表达产物ＰＤＧＦ－ＢＢ以观察其对ＶＳＭＣｓ生长的影响，并以３Ｈ－ＰｒｏＬｉｎｅ掺入率评估该重组蛋白对ＶＳＭＣｓ胶原合成的影响。结果：重组逆转录病毒介导ＰＤＧＦ－Ｂ基因转移并表达出具有生物学活性的重组ＰＤＧＦ－ＢＢ，免疫荧光细胞化学染色证实其表达；该膜型重组蛋白可促进ＶＳＭＣｓ增殖和胶原合成。     

心肌特异性表达腺病毒载体的构建及鉴定

目的：构建心肌特异性表达的腺病毒载体,使外源基因在心肌细胞中特异性表达。方法：将心肌特异性肌凝蛋白轻链蛋白－２（ｍｌｃ－２ｖ）启动子克隆至腺病毒穿梭质粒,并将绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）基因克隆至此质粒中,同源重组含ＧＦＰ基因的缺陷型腺病毒（ＡｄｍｌｃＧＦＰ）,转染心肌细胞及非心肌细胞。结果：经ＲＴ－ＰＣＲ分析,转染的心肌细胞有ＧＦＰｍＲＮＡ的表达,而转染的非心肌细胞无ＧＦＰｍＲＮＡ的表达;荧光显微镜下观察,可见转染的心肌细胞表达ＧＦＰ,而转染的非心肌细胞不表达ＧＦＰ。结论：构建的心肌特异性表达腺病毒载体可使源基因在心肌细胞内特异性表达。     

基因转移人TGF-β1在NIH/3T3细胞中表达鉴定

目的：研究转移人转化生长因子β１（ＴＧＦ－β１）在真核细胞系中蛋白表达。方法：借助真核质粒表达载体,将人ＴＧＦ－β１转移入小鼠成纤维细胞株（ＮＨ／３Ｔ３）细胞中,经Ｇ４１８筛选,克隆扩增,Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ、ＰＣＲ、ＰＴ－ＰＧＲ鉴定,并经水貂肺上皮细胞（ＣＣＬ－６４）生长抑制法,对克隆细胞分泌ＴＧＦ－β１蛋白进行活性检测。结果：证实了重组人ＴＧＦ－β１基因在ＮＩ     

双诱导模式原核表达系统的建立与应用

将ｙＧ－ＣＳＦ ｃＤＮＡ片段克隆于Ｔ７噬菌体ＲＮＡ聚合酶启动子系统的表达载体ｐＪＧＷ１中，并与可热诱导Ｔ７ＲＮＡ聚合酶产生的质粒ｐＧＰ１－２共同转化大肠杆菌ＤＨ５α，经化学诱导或温度诱导，ｈＧ－ＣＳＦ重组蛋白表达率〉３０％，并具有特异的生物活性。     

体外鼠脑星形胶质细胞损伤后c-fos蛋白、GFAP及其mRNA的动态表达

研究ｃ－ｆｏｓ蛋白、ＧＦＡＰ—ｍＲＮＡ和ＧＦＡＰ在鼠脑星形胶质细胞（ａｓｔｒｏｃｙｅ，ＡＳ）损伤后反应性星形胶质化时的动态变化。用ＡＳ原代培养技术建立体外ＡＳ机械损伤模型．并结合应用免疫组织化学和原位杂交方法．结果：（１） ｃ－ｆｏｓ蛋白于损伤后 ４５ ｍｉｎ即有阳性表达，伤后 ２ ｈ消失； （２损伤边缘的 ＡＳ于损伤后 ６ ｈ开始表达 ＧＦＡＰ－ｍＲＮＡ， １ｄ达高峰，３ ｄ则在损伤边缘少数 ＡＳ中可检出 ＧＦＡＰ－ｍＲＮＡ；（３）损伤后 １ｄ，ＧＦＡＰ表达明显增强，胞体肥大，粗大突起伸向损伤区形成反应性星形胶质化。结论：（ｌ） ＡＳ受损后原癌基因 ｃ－ｆｏｓ首先被激活，ｃ－ｆｏｓ蛋白呈－过性的表达，参与调节ＡＳ的激活；（２）ＡＳ损伤后，ＧＦＡＰ－ｍＲＮＡ的转录增加，ＧＦＡＰ表达增强是由于在转录水平上ＧＦＡＰ－ｍＲＮＡ表达增强的结果；（３）反应性星形胶质化是ＡＳ的自身特性，以ＡＳ肥大为主，ＡＳ受损后，原癌基因ｃ－ｆｏｓ的蛋白参与调节ＡＳ激活的确切机制尚待阐明。     

猪囊尾蚴重组体的培养及其诱导表达

将猪囊尾蚴λｇｔ１１重组体染ＥｃｏｌｉＹ１０９０并经ＩＰＴＧ诱导表达融合蛋白（ＦＰ），观察重组体数量、培养时间及ＩＰＴＧ浓度对ＦＰ产量的影响，结果表明，重组噬菌体数量及培养时间对ＦＰ制备有较大影响，ＩＰＴＧ的２对ＦＰ的制备有调节作用。单克隆ＦＰ经简化－Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ（ＳＷＢ）检测，λＣＣ２检测出率最高，为７３．３％；４个克隆以等比联合应用（λＣＭ），其检出率为８６．７％，高于单克隆ＦＰ的     

人骨形成蛋白2碳端肽在大肠杆菌中的高表达及活性测定

利用基因工程技术生产人骨形成蛋白（ｈＢＭＰ），为其诱骨机理及临床应用研究提供前提条件。作将ｈＢＭＰ２ ｃＤＮＡ３’端７３２ｂｐ片段，克隆入大肠杆菌表达载体ｐＧＥＸ－２Ｔ，经ＩＰＴＧ诱导后，表达产物存在于包涵体中，将其纯化复性后，进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和ＦＰＬＣ分析，并作小鼠体内异位诱骨活性检测。表达的ｈＢＭＰ２与ＧＳＴ的融合蛋白Ｍｒ＝５１ｋｕ，占菌体总蛋白的３０％，纯化、复性后，ＦＰＬＣ分析示尖而     

蓖麻毒素A链与绿色荧光蛋白基因的融合表达和活性测定

目的:表达蓖麻毒素A链(RTA)与绿色荧光蛋白(GFP)的融合蛋白 (GFP-RTA),用于蓖麻毒素A链在细胞内的转运机理研究.方法:采用PCR法从重组质粒pKK233.2-RTA中扩增出蓖麻毒素A链基因,然而将其插入真核表达质粒pEGFPC1,构成GFP-RTA融合基因;GFP-RTA经PCR扩增,与T载体连接,用内切酶从T-GFP-RTA中切下GFP-RTA片段,插入原核表达质粒pET-28a( );在BL21(DE3)中表达GFP-RTA融合蛋白,通过金属螯合和层析纯化,MTT法检测融合蛋白的细胞毒性.结果:测序发现插入的融合基因全长序列完全正确,SDS-PAGE鉴定表达产物分子量正确;经诱导表达后,菌体产生绿色荧光,MTT法表明该融合蛋白呈现与RTA相似的细胞毒性.结论:从大肠杆菌表达的蓖麻毒素A链与绿色荧光蛋白的融合蛋白,具有蓖麻毒素A链和绿色荧光蛋白的生物学活性,可用于蓖麻毒素A链在细胞内的转运途径研究.     

绿色荧光蛋白GFP在转化细胞和肿瘤细胞中的表达

目的　在肿瘤基因治疗研究中建立一个用绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)为标记基因的合适条件。方法　用带有GFP突变体的质粒转染到表达细胞,观察GFP瞬时表达的情况：1．直接测定GFP在COS-7细胞中的表达并观察表达的稳定性;2．比较不同启动子驱动的pcDNAa-EGFP和pSVKa-S65T两种质粒在不同肿瘤细胞中的转染效率;3．用LacZ基因与GFP基因共转染48h后,通过FACS分选测定两种基因在同一细胞中的表达情况。结果　在不同条件下的活细胞中有GFP基因表达,且表达具有稳定性,表达持续约2周左右;CMV启动子和SV40启动子调控的GFP对不同肿瘤细胞株的转染效率有差异。当两种基因共转染后用FACS分选,选出GFP细胞带有LacZ基因细胞在1：4时可达85％以上。结论　通过GFP表达可连续而直接地观察活细胞中的基因表达,利用GFP可快速地挑选带有靶基因的细胞。     

大肠杆菌内同源重组法构建含mIκBα基因的重组腺病毒及其在Hep G2细胞中的表达

OBJECTIVE: To develop a rapid and efficient method for preparing recombinant adenovirus containing human mIkappaBalpha gene by homogenous recombination in E.coli. and detect its expression in Hep G2 cells. METHODS: The mIkappaBalpha gene was cloned into the shuttle plasmid pAdTrack-CMV containing green fluorescent protein (GFP) reporter gene, followed by linearization of the resultant plasmid pAdTrack-CMV- mIkappaBalpha by Pme I digestion and subsequent cotransformation into E.coli BJ5183 cells along with an adenoviral backbone plasmid pAdEasy-1. The recombinant plasmid pAd- mIkappaBalpha was selected for kanamycin resistance and confirmed by multiple restriction endonuclease analyses. Finally, the linearized recombinant plasmid was transfected into 293 cells, in which Ad- mIkappaBalpha were generated within 7 to 10 days. The virus titer in 293 cells and its infection efficiency in Hep G2 cells were detected and calculated with the aid of GFP expression. RESULTS: PCR indicated that the recombinant adenovirus contained mIkappaBalpha gene and the titer of Ad- mIkappaBalpha was 2.7x10(9) PFU/ml. With a multiplicity of infection (MOI) of 10, Ad- mIkappaBalpha could be expressed stably and efficiently in Hep G2 cells and the infection efficiency was 57% at 24 h and 100% at 48 h after transfection. CONCLUSIONS: Homogenous recombination in E.coli can efficiently and conveniently construct recombinant adenovirus containing mIkappaBalpha gene capable of amplification in 293 cells and efficient infection of Hep G2 cells. The recombinant adenovirus may serve as a good gene transfer vector for study the function of mIkappaBalpha gene and therapy for hepatocarcinoma.     

人DNMT3B7原核表达载体的构建和表达

目的:构建人类DNA甲基转移酶(DNMT)3B7原核表达载体,并进行初步表达。方法:根据Genebank中人DNMT3B7 cDNA序列设计并合成特异性引物;提取HCT116细胞总RNA并进行反转录,利用PCR技术扩增出DNMT3B7;将扩增产物克隆到原核表达载体PGEX-4T.3中,并对重组质粒进行鉴定;然后将重组质粒转化E.coli BL21,IPTG诱导表达目的蛋白。结果:PCR扩增得到人DNMT3B7的cDNA片段大小为1.1 kb,重组子利用限制性内切酶进行酶切、PCR鉴定和DNA序列分析得到原核表达载体PGEX-4T.3-DNMT3B7;IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析显示目的蛋白在E.coli BL21中高效表达,分子量约为40 kD。结论:成功构建了人DNMT3B7原核表达载体,完成了其在E.coli BL21中的诱导表达,为进一步在体外研究DNMT3B异构体提供了条件。     

人DNMT3B1原核表达载体的构建和表达

目的构建人DNMT3B1原核表达载体,并进行初步表达。方法据Genebank中人DNMT 3B1 cDNA序列设计并合成特异性引物,提取HCT116细胞总RNA,利用PCR技术扩增出DNMT 3B1,并将扩增产物克隆到原核表达载体PGEX-4T.3中,并对重组质粒进行鉴定。转化E.coli BL21,IPTG诱导表达目的蛋白。结果 PCR扩增得到人DNMT 3B1的cDNA片段大小为2.6 kb,重组子利用限制性内切酶进行酶切、PCR鉴定和DNA序列分析得到原核表达载体PGEX-DNMT3B1I,PTG诱导表达后,SDS-PAGE分析表明目的蛋白在E.coli BL21（DE3）中高效表达,相对分子质量约为100 kd。结论成功构建了人DNMT3B1原核表达载体并完成其在E.coli BL21（DE3）中的诱导表达,为进一步在体外研究DNMT3B异构体提供了条件。     

胰腺癌新基因S100P与绿色荧光蛋白融合基因慢病毒载体的构建

目的:构建胰腺癌新基因SLOOP与绿色荧光蛋白(GFP)融合基因慢病毒载体.方法:实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增获得SlOOP的全外显子片段.使之克隆到带GFP荧光报告基因慢病毒表达载体质粒中,慢病毒包装质粒和穿棱质粒共转染293T细胞,包装成功后收集上清,浓缩,鉴定.取浓缩纯化后的病毒上清感染293T细胞和宿主胰腺癌细胞.荧光显微镜观察293T细胞的荧光表达,RT-PCR鉴定胰腺癌细胞中SLOOP的表达水平.结果:电泳鉴定结果与目的基因表达条带完全吻合,克隆测序结果与NCBI收录的S LOOP基因序列完全一致.重组慢病毒质粒可高效转染293T细胞.荧光显微镜下可观察到大量绿色荧光.共转染后293T细胞上清可高效感染293T细胞,感染后宿主细胞中S LOOP高表达.结论:成功构建了S LOOP与GFP融合基因慢病毒表达载体,为进一步研究SLOOP基因的相关功能提供了适合的稳定转染载体.     

重组GFP-VEGF6a融合肽的构建表达及其抗肿瘤活性

为了探讨血管内皮生长因子6a(VEGF6a)的抗肿瘤及其抑制外周血管生成活性,采用两次加端PCR技术,将VEGF6a片段的基因和绿色荧光蛋白(GFP)基因通过GGGS柔性片段融合,连接至pET28a载体,构建GFP-VEGF6a(GFP6a)融合肽E.coli表达菌。GFP6a融合肽通过乳糖诱导表达和肝素亲和树脂精制得到。建立皮内和皮下移植型肝癌ICR小鼠模型,验证了VEGF6a抑制肿瘤外周血管及抗肿瘤活性。结果表明,与阴性对照GFP比较,GFP6a 200 mg/kg组和20 mg/kg组均明显抑制肿瘤外周血管生成,抑制H22肝癌细胞体内生长,瘤重抑制率分别为70.9%和56.1%(P<0.01)。本研究显示,VEGF6a具有潜在的抗肿瘤活性。     

含绿色荧光蛋白报告基因pUC18筛选载体的构建

目的：以绿色荧光蛋白（GFP）基因为报告基因，将GFP基因克隆入pUC18建立大通量的筛选载体。方法：用PCR方法扩增目的DNA片段，碱裂解法小量制备质粒DNA，用限制性内切酶消化质粒DNA，用低熔点琼脂糖凝胶分离和纯化大片段DNA，GFP基因与pUC18连接，用氯化钙法转化感受态细胞，DNA序列测定，琼脂糖凝胶电泳，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。结果：pUC18-atg-GFP载体意外表达GFP蛋白，新合成的上游引物与原下游引物扩增GFP基因，克隆入pUC18构建pUC18-GFP载体，通过PCR，酶切鉴定和DNA序列分析，GFP基因的读码框架与原设计方案完全一致，该载体自身无GFP表达。结论：筛选载体内的GFP基因与克隆基因的融合基因可表达一种融合蛋白，在琼脂平板上含有该融合基因的克隆在紫外线激发下可发绿色荧光，因此，可表达基因能被挑选出来。     

小鼠HSP27基因腺病毒表达载体的构建与鉴定

目的:为深入研究热休克蛋白27(heat shock protein 27,HSP27)的生理与病理功能,应用PAdEasy腺病毒载体系统构建带荧光蛋白的小鼠HSP27重组腺病毒,并进行鉴定.方法:采用基因技术,将目的基因克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV中,通过PCR、序列测定、酶切鉴定;利用PAdEasy系统进行重组,在293细胞中包装和扩增,然后体外感染小鼠精原母细胞,Westernblot检测HSP27蛋白表达.结果:测序和酶切鉴定重组腺病毒质粒构建正确;经293细胞包装后可观察到绿色荧光,收获高滴度重组腺病毒体外感染小鼠精原母细胞,并且可正确表达HSP27.结论:应用PAdEasy系统重组技术成功构建了小鼠HSP27带荧光蛋白腺病毒载体,并在小鼠精母细胞系进行体外有效表达,为进一步研究HSP27的功能奠定基础.