双重荧光标记验证静脉移植碱性成纤维细胞生长因子基因修饰骨髓间充质干细胞在脑缺血模型大鼠脑内的存活及分化

背景：碱性成纤维细胞生长因子可以促进骨髓间充质干细胞的增殖和向神经细胞方向分化，并被认为是胶质细胞的分裂原。 目的：以双重荧光标记验证静脉移植碱性成纤维细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞在脑缺血模型大鼠脑内的存活及分化情况，及其向神经元样细胞和神经胶质细胞分化的趋势。 设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2005-07/2006-03在中南大学实验动物中心实验室完成。 材料：选用50只SD大鼠，按随机数字表法分为4组：假手术组（n=10），脑缺血/再灌注损伤模型组（n=10），骨髓间充质干细胞治疗组（n=15），碱性成纤维细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞治疗组（n=15）。 方法：除假手术组外，其余3组制备局灶性脑缺血再灌注模型。分别将骨髓间充质干细胞或碱性成纤维细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞通过静脉移植至实验性脑缺血大鼠体内，脑缺血再灌注损伤组大鼠注入相同体积的DMEM培养基。 主要观察指标：应用5-溴-2-脱氧尿苷-神经元特异核蛋白及5-溴-2-脱氧尿苷-胶质纤维酸性蛋白双重荧光标记法观察移植细胞在脑内的存活和分化情况，比较各组大鼠脑缺血后的神经功能评分及脑梗死体积变化。 结果：移植7 d后，碱性成纤维细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞组大鼠脑内5-溴-2-脱氧尿苷阳性细胞数、5-溴-2-脱氧尿苷-神经元特异核蛋白双标阳性细胞数均高于骨髓间充质干细胞治疗组（P < 0.05），两组间5-溴-2-脱氧尿苷-胶质纤维酸性蛋白双标阳性细胞数差异无显著性意义（P > 0.05）。再灌注7 d后，静脉移植骨髓间充质干细胞和碱性成纤维细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞均能改善脑缺血后大鼠的神经功能、减少脑梗死体积，碱性成纤维细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞的作用明显优于骨髓间充质干细胞。 结论：碱性成纤维细胞生长因子诱导的骨髓间充质干细胞静脉移植后可在脑内缺血区存活，并分化为比例更合适的神经元和神经胶质细胞，发挥神经修复作用。     

碱性成纤维生长因子和神经生长因子联合应用培养成年大鼠海马神经干细胞向神经元样细胞的分化

背景：影响神经干细胞向神经元分化的因素很多,各种营养因子可以不同程度地刺激神经干细胞向神经元分化,如何使神经干细胞大量分化为神经元是研究的热点问题。 目的：观察联合应用碱性成纤维生长因子和神经生长因子对成年大鼠海马神经干细胞为神经元的影响。 方法：无菌条件下分离大鼠脑海马组织,传至第4代克隆球直径约为200 μm时,滴加DMEM/F12+2% B27+20 μg/L表皮生长因子+20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子,进行单细胞克隆培养,传代的神经干细胞分成空白对照组、碱性成纤维细胞生长因子组、神经生长因子组、碱性成纤维细胞生长因子+神经生长因子组。观察传代后的克隆球进行神经干细胞免疫细胞化学染色鉴定,计数神经元特异性烯醇化酶阳性细胞率,检测神经干细胞向神经元的分化情况。 结果与结论：①单细胞克隆培养后,克隆球细胞表达巢蛋白,诱导分化后神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白均呈阳性表达。②与空白对照组神经干细胞分化为神经元的比例比较,碱性成纤维细胞生长因子组、神经生长因子组、碱性成纤维细胞生长因子组+神经生长因子组均明显提高(P < 0.05),且碱性成纤维细胞生长因子组+神经生长因子组神经元的比例最高(P < 0.05)。提示,碱性成纤维细胞生长因子可以提高神经生长因子诱和神经生长因子均可促进神经干细胞向神经元分化,且二者联合应用效果更佳。     

血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子在缺血预处理大鼠局灶性脑缺血再灌注区域的表达

背景：脑缺血预处理可增加碱性成纤维细胞生长因子的表达,可能导致脑缺血耐受的产生。大鼠大脑中动脉缺血再灌注给予血管内皮生长因子能够起到神经保护作用。 目的：观察缺血预处理对缺血再灌注大鼠血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子表达的影响。 方法：将SD大鼠随机分为缺血预处理组、模型组和假手术组。缺血预处理及模型组线栓法阻塞大脑中动脉制备脑缺血模型。预处理组在脑缺血-再灌注前3 d用插入尼龙线阻塞大脑中动脉,缺血2 h后再灌注22 h。模型组第一次手术将线栓前推5 mm,不阻断血流,其他同预处理组。假手术组仅插入尼龙线不阻塞大脑中动脉。用苏木精-伊红染色法观察3组间神经细胞变化。用抗生物素-生物素-过氧化物酶复合物法检测各组血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子蛋白的表达。分别比较3组神经功能评分、光镜下脑缺血再灌注区神经细胞形态、血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的表达。 结果与结论：与模型组比较,预处理组神经功能评分明显低于模型组(P < 0.01)。光镜下观察结果显示,与模型组比较,预处理组缺血面积及缺血程度均减轻,血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子表达均明显升高(P < 0.05)。结果提示缺血预处理可能通过增强血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子而对缺血再灌注大鼠神经细胞起保护作用。     

重组胸腺素β4通过调节血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子促进皮肤创伤愈合

背景：由于机体自身修复愈合的能力极其有限，一旦发生损伤或者病变很难自愈。近年来，胸腺素β4促进创伤愈合的作用受到关注，为创伤愈合药物的研究提供了一个新方向。 目的：通过制作大鼠皮肤全层创伤模型，观察局部给予重组胸腺素β4对创面血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子表达的调节作用，并分析其剂量效应。 设计、时间及地点：细胞因子水平的随机对照动物实验，于2007-03/2008-01在南开大学医学院解剖教研室完成。 材料：胸腺素β4由北京诺思兰德生物技术有限公司提供。 方法：纳入雄性SD大鼠60只，采用直径8 mm的自制打孔器在大鼠脊柱两侧脊肋角处各制备1个全层皮肤缺损模型。将大鼠随机分为胸腺素β4 40，120，360 mg/L组及对照组，每组15只。分别于模型制备后即刻、每天早7：00、晚7：00给每个伤口表面滴加相应剂量的胸腺素β4 50 μL及等量磷酸盐缓冲液。 主要观察指标：于造模后2，4，7 d，每组每时相点取5只大鼠背部全层皮肤标本行苏木精-伊红和三原染色观察组织形态学变化，采用免疫组织化学法检测血管内皮生长因子及碱性成纤维细胞生长因子的表达。 结果：创面组织形态观察结果示，与对照组相比，胸腺素β4各剂量组造模后毛细血管增多，成纤维细胞、胶原纤维、网状纤维增多，排列较规则，以胸腺素β4 120 mg/L组最明显。胸腺素β4处理后4 d血管内皮生长因子表达最多，造模后7 d表达减少，胸腺素β4 120 mg/L组血管内皮生长因子表达强度保持在较高水平，阳性血管面积大于 40，360 mg/L组(P < 0.05~0.01)。胸腺素β4 120 mg/L组造模后2 d碱性成纤维细胞生长因子表达较强，造模后4，7 d表达逐渐减弱(P < 0.01)。 结论：实验中120 mg/L胸腺素β4可使血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子持续稳定较高表达。在愈合早期促进血管再生，促进肉芽组织生长和成纤维细胞的增殖、分化，在愈合晚期，下调血管内皮生长因子的表达，同时抑制碱性成纤维细胞生长因子过度表达。     

bFGF对血管性痴呆大鼠海马乙酰胆碱含量及胆碱酯酶活性的影响

目的皮下注射碱性成纤维细胞生长因子于血管性痴呆大鼠,研究用药前后大鼠乙酰胆碱含量及胆碱酯酶活性的变化。方法制作VD大鼠模型,随机取用VD大鼠模型12只,分治疗组6只,痴呆组6只。另外,取假手术组6只。皮下注射碱性成纤维细胞生长因子于治疗组中的血管性痴呆大鼠。治疗5周后,以Morris水迷宫定位航行试验和空间探索试验来检测大鼠的学习记忆能力,观察乙酰胆碱含量及胆碱酯酶活性的变化。结果治疗组大鼠学习记忆能力较痴呆组明显提高,治疗组乙酰胆碱含量较痴呆组明显提高,胆碱酯酶活性明显降低。结论皮下注射碱性成纤维细胞生长因子能明显提高血管性痴呆大鼠乙酰胆碱含量,降低胆碱酯酶活性。     

脑缺血再灌注神经干细胞原位激活的研究

目的 探讨大鼠局灶性脑缺血再灌注后不同时间、不同脑部位神经干细胞(NSC)原位激活的变化规律。方法 建立一侧大脑中动脉闭塞缺血再灌注模型,用5-溴脱氧尿苷(BrdU)标记脑内增殖细胞,免疫组化(SP法)技术检测大鼠缺血再灌注不同时间段缺血周边皮质、双侧侧脑室下区(SVZ)、海马齿状回下区(SGZ)具有增殖能力细胞BrdU表达变化。结果 对照组脑组织双侧SVZ、SGZ可见少量BrdU阳性标记细胞;单纯脑缺血2 h组脑组织BrdU阳性细胞数未见明显增加;再灌注3天组,缺血侧皮质、双侧SVZ和SGZBrdU阳性细胞明显增多(P<0.05),7天时达到高峰(P<0.001),11天时下降,且缺血侧与对侧相比,双侧SVZ呈对称分布,而SGZ以缺血侧增加为主(P<0.05)。结论 一侧大脑中动脉闭塞缺血再灌注可致成年大鼠脑内NSC原位激活,且NSC增殖于缺血后1周达到高峰,激活部位以双侧SVZ、缺血侧海马和周边皮质为主。     

全骨髓贴壁法获纯化骨髓间充质干细胞向神经干细胞的诱导分化*★

目的：来源于骨髓间充质干细胞的神经干细胞是最近研究的一个热点。实验拟进一步验证通过全骨髓贴壁法分离纯化骨髓间充质干细胞并诱导分化为神经干细胞的效率，并对其的体内外标记进行了观察。 方法：实验于2006-11/2007-05在青岛大学医学院附属医院脑血管病研究所完成。①实验材料：选取出生4周左右Wistar大鼠，雌雄不拘，SPF级，体质量200 g左右，由青岛市实验动物和动物实验中心提供，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。②实验方法：选用出生4周左右Wistar大鼠，由其股骨和胫骨分离纯化骨髓间充质干细胞，加碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子诱导其分化为神经干细胞，并进行免疫组织化学鉴定。以5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）标记神经干细胞，在24孔板中进行细胞免疫组织化学和免疫荧光鉴定。将标记的神经干细胞定位注入大鼠基底节区, 1周后取脑作石蜡切片, 进行免疫组织化学和免疫荧光染色。 结果：获得了较纯化的骨髓间充质干细胞，经诱导72 h后，部分细胞增殖分裂成小圆形,呈团簇状半悬浮状态。继续培养 72 h可见细胞呈现典型神经元样改变，细胞伸出两个或多个突起, 胞体呈多角形或不规则形, 折光性较强, 细胞突起之间相互连接成网状,可见细胞核及核仁，经诱导后有巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白阳性细胞表达。采用BrdU掺入DNA合成期的神经干细胞，1周后体内外标记阳性率> 85%。 结论：采用全骨髓贴壁法可获得较纯化的骨髓间充质干细胞，其在适宜的诱导分化条件下可诱导分化神经干细胞。BrdU可作为神经干细胞体内示踪的理想标记物。     

联合应用碱性成纤维细胞生长因子和脑源性神经营养因子对成年大鼠脑海马神经干细胞分化为神经元的影响

背景：调控神经干细胞分化的微环境因素很多,数种因素可以不同程度地刺激神经干细胞向神经元分化,如何使神经干细胞更有效地分化为神经元尤为关键。 目的：观察碱性成纤维细胞生长因子与脑源性神经营养因子联合应用对成年大鼠脑海马神经干细胞分化为神经元的影响。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2008-05在中国医科大学神经解剖研究室完成。 材料：清洁级雄性SD大鼠3只,由中国医科大学实验动物部提供。 方法：无菌条件下分离大鼠脑海马组织,胰蛋白酶消化后采用无血清培养技术体外培养神经干细胞,传至第4代克隆球直径约为200 µm时,滴加含B27、表皮生长因子及碱性成纤维细胞生长因子的DMEM/F12进行单细胞克隆培养。传代的神经干细胞分成4组：空白对照组加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养液,碱性成纤维细胞生长因子组、脑源性神经营养因子组、联合组分别在空白对照组培养液的基础上加入10 µg/L碱性成纤维细胞生长因子、200 µg/L脑源性神经营养因子、10 µg/L碱性成纤维细胞生长因子+200 µg/L脑源性神经营养因子,培养1周。 主要观察指标：免疫细胞化学染色鉴定神经干细胞,检测神经干细胞分化为神经元的比例。 结果：单细胞克隆培养后,克隆球细胞表达巢蛋白,诱导分化后神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白均呈阳性表达。与空白对照组比较,碱性成纤维细胞生长因子组、脑源性神经营养因子组、联合组神经干细胞分化为神经元的比例均明显提高(t =3.409~7.558,P < 0.05),且联合组升高幅度尤为显著。 结论：适宜浓度的碱性成纤维细胞生长因子和脑源性神经营养因子联合应用,比其单独应用具有更强的促神经干细胞向神经元分化的作用。     

壳多糖与外源性碱性成纤维细胞生长因子联合应用修复创面愈合的评估

目的：壳多糖具有抗菌消炎和收敛作用。碱性成纤维细胞生长因子具有促进血管生成、促进神经生长等功能，是创伤愈合和上皮形成的重要调节物。实验联合应用壳多糖和碱性成纤维细胞生长因子，观察其对创面愈合的影响。 方法：实验于2006-04/2007-01在河北省人民医院实验室及河北医科大学第四附属医院实验室完成。实验室标准均为生物安全二级(BSL-2)。①实验材料：48只雄性健康Wistar大鼠由河北医科大学实验动物中心提供，体质量200~250 g，清洁级，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。②实验方法：以切割法制备大鼠创伤模型，造成全层皮肤创面。将48只Wistar大鼠随机分为对照组、壳多糖组、生长因子组、壳多糖+生长因子组,并分别给予蒸馏水、100 g/L壳多糖、1 000 IU/mL碱性成纤维细胞生长因子、100 g/L壳多糖+1 000 IU/mL碱性成纤维细胞生长因子药液治疗，每组12只。③实验评估：以创面愈合时间和速率、新生毛细血管、炎症细胞和细胞渗出的变化以及血管内皮生长因子在创面组织中的表达来评价修复效果。 结果： 48只大鼠全部进入结果分析。①壳多糖+生长因子组创面愈合时间最快（P < 0.01）。②与其他3组比较，壳多糖+生长因子组第3天有较多毛细血管生成，第14天成纤维细胞排列整齐。③壳多糖+生长因子组血管内皮生长因子表达在术后第10天达到最高峰，至伤后第14天仍保持高水平，且明显高于其他3组（P < 0.01）。 结论：壳多糖+碱性成纤维细胞生长因子促进伤口愈合，缩短愈合过程，提高愈合质量，两者联合应用可更大限度发挥各自功效。     

微囊化兔许旺细胞移植脊髓损伤大鼠：碱性成纤维细胞生长因子表达和后肢运动功能的变化

背景：研究表明微囊化兔许旺细胞移植于大鼠损伤脊髓后,能减轻炎症反应,促进脊髓再生,但具体作用途径尚不完全清楚。 目的：观察微囊化兔许旺细胞移植于损伤大鼠脊髓后,碱性成纤维细胞生长因子的表达以及后肢运动功能的恢复。 方法：取家兔坐骨神经以双酶消化法制成许旺细胞悬液后,再用气体喷入法制成海藻酸钡-许旺细胞微囊。同法制备不包被许旺细胞的空囊。SD大鼠随机分为4组：细胞组、空囊组、微囊组建立脊髓半横断损伤模型,分别于损伤处植入明胶海绵吸附的10 μL许旺细胞悬液、10 μL空囊、10 μL海藻酸钡-许旺细胞微囊;正常组不做任何干预。采用BBB评分观察大鼠后肢运动功能恢复情况,制作脊髓标本切片通过苏木精-伊红染色和尼氏染色行病理学检查,免疫组织化学染色观察碱性成纤维细胞生长因子的表达变化。 结果与结论：造模后即刻大鼠右后肢出现瘫痪;材料移植后7,14,28 d,微囊组大鼠后肢运动功能明显恢复,BBB评分明显优于细胞组、空囊组(P < 0.05或P < 0.01)。碱性成纤维细胞生长因子阳性细胞主要见于神经元细胞的胞浆及胶质细胞的胞核内。材料移植后第1,3,7天,胶质细胞主要在脊髓损伤附近处表达,其中第3天表达量最大;第14天在神经元细胞的胞浆内可见碱性成纤维细胞生长因子表达,微囊组表达程度明显高于细胞组、空囊组;之后各组表达程度均明显下降。提示微囊化兔许旺细胞移植于损伤大鼠脊髓后,可以抑制异种移植后免疫排斥,减轻炎症反应,增加碱性成纤维细胞生长因子表达,促进后肢功能恢复和脊髓再生。 关键词：脊髓损伤;移植;碱性成纤维细胞生长因子;运动功能;微囊;许旺细胞;生物材料 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.08.011     

视频脑电图在小儿癫痫诊断中的应用

目的评价视频脑电图(video-EEG)在小儿癫诊断中的应用价值。方法对126例具有发作性症状的患儿进行连续8h的包括清醒、睡眠、诱发试验及必要的认知测验的视频脑电图监测。结果经发作期视频脑电图证实,39例初诊为癫性发作的患儿中14例(35%)为非癫性发作;15例其他症状发作中13例(86%)为非癫性发作。64例样放电患儿中51例(80%)确定发作类型,22例(34%)确定癫类型。视频脑电图可发现短暂轻微的癫发作及样放电引起的一过性认知损伤。结论视频脑电图在排除非癫性发作、确定癫性发作的类型、评价脑电-临床关系方面可提供准确可靠的证据,进一步提高癫的临床诊断水平。     

Role of glutathione in repair of free radical damage in hippocampus in vitro.

Depletion of glutathione (GSH), an intrinsic antioxidant, increases vulnerability to free radical damage in a number of cell systems. This study investigates the role of GSH in limiting electrophysiological damage and/or recovery from free radical exposure in slices of guinea pig hippocampus. Synaptic potentials (PSPs) and population spikes (PSs) were recorded from field CA1. Free radicals were generated from 0.006% peroxide through the Fenton reaction. Analysis of the input-output curves showed that peroxide treatment decreased PSPs and impaired ability of the PSPs to generate PSs as previously reported. Recovery was nearly total within a half hour. Treatment with 5 mM buthionine sulfoximine (BSO) for 2 h depleted hippocampal GSH to 79.2% of control values. The extent of free radical damage was not increased. Recovery, however, was only partial. GSH was further depleted by oxidation with diamide or covalent bonding with dimethyl fumarate (DMF) immediately before and during the peroxide treatment. Neither diamide nor DMF treatment in BSO-incubated tissue enhanced peroxide-induced electrophysiological deficits. Following these treatments, however, tissue showed little recovery from free radical damage. We conclude that glutathione is essential for repair processes in hippocampal neurons exposed to oxidative damage.     

Neuroprotective properties of memantine in different in vitro and in vivo models of excitotoxicity

The pathogenesis of stroke, trauma and chronic degenerative diseases, such as Alzheimer's disease (AD), has been linked to excitotoxic processes due to inappropriate stimulation of the N-methyl-D-aspartate receptor (NMDA-R). Attempts to use potent competitive NMDA-R antagonists as neuroprotectants have shown serious side-effects in patients. As an alternative approach, we were interested in the anti-excitotoxic properties of memantine, a well-tolerated low affinity uncompetitive NMDA-R antagonist presently used as an anti-dementia agent. We explored in a series of models of increasing complexity, whether this voltage-dependent channel blocker had neuroprotective properties at clinically relevant concentrations. As expected, memantine protected neurons in organotypic hippocampal slices or dissociated cultures from direct NMDA-induced excitotoxicity. However, low concentrations of memantine were also effective in neuronal (cortical neurons and cerebellar granule cells) stress models dependent on endogenous glutamate stimulation and mitochondrial stress, i.e. exposure to hypoxia, the mitochondrial toxin 1-methyl-4-phenylpyridinium (MPP+) or a nitric oxide (NO) donor. Furthermore, memantine reduced lethality and brain damage in vivo in a model of neonatal hypoxia-ischemia (HI). Finally, we investigated functional rescue (neuronal capacity to migrate along radial glia) by memantine in cerebellar microexplant cultures exposed to the indirect excitotoxin 3-nitropropionic acid (3-NP). Potent NMDA-R antagonists, such as (+)MK-801, are known to block neuronal migration in microexplant cultures. Interestingly, memantine significantly restored the number of neurons able to migrate out of the stressed microexplants. These findings suggest that inhibition of the NMDA-R by memantine is sufficient to block excitotoxicity, while still allowing some degree of signalling.     

Storage of lipofuscin in neurons in mucopolysaccharidosis

Summary A histochemical and ultrastructural study was made on the brain of a 23-year-old man with Sanfilippo's syndrome. In accordance with previous reports the cortical nerve cells contained a PAS-positive lipid storage substance. This showed intense autofluorescence in UV-light and was positive with various stains for lipofuscin. The storage material appeared ultrastructurally as inclusion bodies composed of short lamellated membranes, granular material, and vacuoles. In addition, concentrically and transversely lamellated membranous cytoplasmic bodies were observed in the nerve cells. It is concluded that the PAS-positive lipid storage material in the neurons was composed partly of lipofuscin in addition to other lipids presumably glycosphingolipids.Supported by a grant from the Expressen Prenatal Research Foundation