多房棘球绦虫重组BCG-EmⅡ/3疫苗对小鼠脾细胞凋亡的影响

目的:检测多房棘球绦虫重组BCG-EmⅡ/3疫苗对原头蚴攻击小鼠脾细胞凋亡的影响.方法:用重组BCG-EmⅡ/3疫苗分别通过皮下注射和鼻腔粘膜接种免疫BALB/C小鼠8周后,用50个多房棘球绦虫原头蚴腹腔注射进行攻击,攻击感染后18周剖杀小鼠,分离脾细胞,用ConA刺激培养16～18 h,然后用Annexin V-FITC染色法检测脾细胞凋亡.结果:小鼠脾细胞原液组和ConA刺激组细胞凋亡发生率均显著低于PBS对照组(P＜0.05或P＜0.01);每个ConA刺激组脾细胞凋亡发生率显著高于相应的原液组(P＜0.05或P＜0.01);鼻腔粘膜接种组脾细胞凋亡率显著低于皮下注射组(P＜0.01).结论:多房棘球绦虫重组BCG-EmⅡ/3疫苗可抑制感染小鼠脾细胞发生凋亡,增加CD4 T细胞亚群的数量,加强宿主抗多房棘球绦虫感染的保护性免疫反应.     

多房棘球绦虫混合重组BCG-EmⅡ/3和BCG-Em14-3-3疫苗诱导的保护力观察

目的:探讨多房棘球绦虫(Echinococcus multilocularis,Em)混合重组BCC-EmⅡ/3和BCG-Em14-3-3疫苗免疫小鼠后对Em原头节攻击感染的保护性作用.方法:将混合重组BCG疫苗采用皮下注射和鼻腔内接种分别免疫BALB/c鼠,免疫后8周用多房棘球绦虫原头节进行攻击感染,感染后18周剖杀小鼠,计算减蚴率,测定血清中IgG及其亚类和IgE水平,同时设有空载体、BCG和PBS对照.结果:混合疫苗接种组的减蚴率为45.29%～76.47%,血清IgG、IgG2a、IgG2b和lgE水平明显升高,IgG1和IgG3显著降低.结论:多房棘球绦虫混合重组BCG-EmⅡ/3和BCG-Em14-3-3疫苗鼻腔内接种是一种较好的途径,IgG、IgG2a、IgG2b和IgE在疫苗诱导的保护力中起重要作用.     

多房棘球绦虫混合重组BCG-EmⅡ/3和BCG-Em14-3-3疫苗诱导小鼠的免疫保护力观察

目的 探讨多房棘球绦虫混合重组BCG-EmⅡ/3和BCG-Em14-3-3疫苗免疫鼠后对Em原头节攻击感染的保护性作用.方法 将混合重组BCG疫苗采用皮下注射和鼻腔内接种分别免疫BALB/c小鼠,免疫后8周用多房棘球绦虫原头节进行攻击感染,感染后18周剖杀小鼠,计算减蚴率,测定血清中IgG及其亚类和IgE水平;分离脾细胞,流式细胞仪检测脾CD4 和CD8 T淋巴细胞亚群的百分比,同时设有空载体、BCG和PBS对照.结果 疫苗接种组的减蚴率为45.29%～76.47%,血清IgG、IgG2a、IgG2b和IgE水平明显升高,IgG1和IgG3显著降低;疫苗接种组的脾CD4 T细胞亚群显著增加,CD8 T细胞亚群无明显变化,CD4 /CD8 亚群比值明显升高.结论 多房棘球绦虫混合重组BCG-EmⅡ/3和BCG-Em14-3-3疫苗鼻腔内接种是一种较好的途径,IgG、IgG2a、IgG2b和IgE以及CD4 T细胞亚群在疫苗诱导的保护力中起重要作用.     

多房棘球绦虫混合重组BCG-EmⅡ/3和BCG-Em14-3-3疫苗抑制小鼠脾细胞的凋亡

目的:多房棘球绦虫混合重组BCG-EmⅡ/3和BCG-Em14-3-3疫苗免疫小鼠并以Em原头节攻击后探讨以上疫苗对小鼠脾细胞凋亡的变化.方法:将混合重组BCG疫苗采用皮下注射和鼻腔内接种分别免疫Balb/c鼠8 wk后,用多房棘球绦虫原头节进行攻击感染,感染18 wk杀鼠取脾并分离脾细胞,流式细胞仪检测脾细胞的凋亡发生率,同时设有空载体、BCG和PBS对照.结果:疫苗接种组的脾细胞凋亡发生率明显低于感染对照组.结论:泡球蚴感染可引起小鼠脾细胞凋亡,而多房棘球绦虫混合重组BCG-EmⅡ/3和BCG-Em14-3-3疫苗可在一定程度上抑制感染鼠脾细胞的凋亡.     

多房棘球绦虫混合重组BCG-EmⅡ/3和BCG-Em14-3-3疫苗抑制小鼠脾细胞的凋亡

目的：多房棘球绦虫混合重组BCG-EmⅡ／3和BCG-Em14-3-3疫苗免疫小鼠并以Em原头节攻击后探讨以上疫苗对小鼠脾细胞凋亡的变化．方法：将混合重组BCG疫苗采用皮下注射和鼻腔内接种分别免疫Balb／c鼠8wk后，用多房棘球绦虫原头节进行攻击感染，感染18wk杀鼠取脾并分离脾细胞，流式细胞仪检测脾细胞的凋亡发生率，同时设有空载体、BCG和PBS对照．结果：疫苗接种组的脾细胞凋亡发生率明显低于感染对照组．结论：泡球蚴感染可引起小鼠脾细胞凋亡，而多房棘球绦虫混合重组BCG-EmⅡ／3和BCG-Em14-3-3疫苗可在一定程度上抑制感染鼠脾细胞的凋亡．     

多房棘球绦虫混合重组BCG-EmⅡ/3和BCG-Em14-3-3疫苗免疫小鼠后脾细胞亚群的动态观察

目的:动态观察多房棘球绦虫混合重组BCG-EmⅡ/3和BCG-Em14-3-3疫苗免疫小鼠后脾细胞亚群的变化.方法:将疫苗采用鼻腔内接种免疫BALB/C鼠,在免疫后0、2、4、6、8、10、12、14、16和18周各剖杀4只小鼠取脾,分离脾细胞,流式细胞仪检测脾CD4 和CD8 T淋巴细胞亚群的百分比,同时设有PBS对照.结果:疫苗接种组的脾CD4 和CD8 T细胞亚群分别在免疫后2～12周和2～18周升高,分别在免疫后6和10周达最高水平.结论:CD4 T细胞亚群数目在多房棘球绦虫混合重组BCG-EmⅡ/3和BCG-Em 14-3-3疫苗免疫早期(2～6周)显著增加.     

多房棘球绦虫混合重组BCG-EmⅡ/3和BCG-Em14-3-3疫苗诱导小鼠脾脏T细胞亚群的变化

目的:探讨多房棘球绦虫混合重组BCG-EmⅡ/3和BCG-Em14-3-3疫苗免疫和Em原头节攻击后小鼠脾CD4 和CD8 T淋巴细胞亚群的变化.方法:将混合重组BCG疫苗采用皮下注射和鼻腔内接种分别免疫BALB/C鼠,免疫后8周用多房棘球绦虫原头节进行攻击感染,感染后18周杀鼠取脾,分离脾细胞,流式细胞仪检测脾CD4 和CD8 T淋巴细胞亚群的百分比,同时设有空载体、BCG和PBS对照.结果:疫苗接种组的脾CD4 细胞亚群显著增加,CD8 T细胞亚群无明显变化,CD4 /CD8 亚群比值明显升高;皮下注射组的CD4 和CD4 /CD8 亚群比值显著高于鼻腔内接种组.结论:CD4 T细胞亚群在多房棘球绦虫重组BCG-Em14-3-3疫苗诱导的小鼠抗Em原头节攻击感染的保护性免疫机制中起一定作用.     

多房棘球绦虫重组BCG-Em14-3-3疫苗诱导小鼠脾细胞因子变化的研究

目的:探讨多房棘球绦虫重组BCG-Em14-3-3疫苗免疫和Em原头节攻击后小鼠脾细胞冈子的变化.方法:将疫苗采用皮下注射和鼻腔内接种分别免疫BALB/c鼠.免疫后8周用多房棘球绦虫原头节进行攻击感染,感染后18周杀鼠取脾,分离脾细胞,用EmAg或ConA刺激培养,收集脾细胞培养上清液,用试剂盒检测脾细胞培养上清液的IL-2、IFN-γ、TNF-α和IL-4水平,同时设有空载体、BCG和PBS对照.结果:疫苗接种组的IFN-γ和TNF-α水平升高,IL-4水平降低;鼻腔内接种组的TNF-α水平高于皮下注射组.结论:多房棘球绦虫重组BCG-Em14-3-3疫苗诱导小鼠产生一个THl型反应,从而对抗Em原头节攻击感染.     

多房棘球绦虫重组BCG-Em14-3-3疫苗免疫小鼠后脾细胞因子的动态观察

目的:动态观察多房棘球绦虫重组BCG-Em14-3-3疫苗免疫小鼠后脾细胞因子的变化。方法:将疫苗采用鼻腔内接种免疫BALB/C鼠,在免疫后0、2、4、6、8、10、12、14、16和18周各剖杀4只小鼠取脾,分离脾细胞,用EmAg或ConA刺激培养,收集脾细胞培养上清液,用试剂盒检测脾细胞培养上清液的IL-2、IFN-γ、TNF-α和IL-4水平,同时设有PBS对照。结果:疫苗接种组的IL-2、IFN-γ、TNF-α和IL-4分别在免疫后4～8周、2～8周、2～8周和6～10周升高,分别在免疫后6、6、4～6和8周达最高水平。结论:多房棘球绦虫重组BCG-Em14-3-3疫苗在免疫早期(2～8周)即可诱导小鼠产生一个TH1型保护性免疫反应。     

多房棘球绦虫重组BCG-Em14 -3-3疫苗不同接种途径诱导小鼠细胞因子的研究

目的探讨多房棘球绦虫重组BCG-Em14-3-3疫苗免疫和Em原头节攻击后小鼠脾细胞因子的变化。方法将疫苗通过皮下注射和鼻腔内接种分别免疫BALB/c鼠,免疫后8周用多房棘球绦虫原头节进行攻击感染,感染后18周杀鼠取脾,分离脾细胞,用EmAg或ConA刺激培养,收集脾细胞培养上清液,用试剂盒检测脾细胞培养上清液的IL-2、IFN-γ、TNF-α和IL-4水平,同时设有PBS对照。结果疫苗接种组的IFN-γ和TNF-α水平升高,IL-4水平降低;鼻腔内接种组的TNF-α水平高于皮下注射组。结论多房棘球绦虫重组BCG-Em14-3-3疫苗诱导小鼠产生一个TH1型反应,从而对抗Em原头节攻击感染;疫苗鼻腔内接种是一种较好的免疫途径。     

多房棘球绦虫重组质粒BCG-EmⅡ/3-10的构建及意义

目的:构建多房棘球绦虫重组质粒BCG-EmⅡ/3-10,探索泡球蚴病防治的新途径。方法:超声粉碎泡球蚴组织提取总RNA,通过RT-PCR扩增EmⅡ/3-10抗原编码基因,将该基因定向克隆到大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭表达载体pBCG,构建重组质粒pBCG-EmⅡ/3-10,电穿孔法将该质粒导入BCG构建多房棘球绦虫重组BCG-EmⅡ/3-10。结果:经过PCR扩增鉴定、电泳证实获得的重组基因的大小和插入方向正确。结论:成功构建了多房棘球绦虫重组质粒BCG-EmⅡ/3-10,为进一步研究多房棘球绦虫重组疫苗奠定基础。     

多房棘球绦虫Em14-3-3抗原编码基因在BCG中的表达

目的：研究多房棘球绦虫Em14-3-3抗原编码基因在BCG中的表达.方法：将重组质粒pBCG-Em14-3-3用电穿孔法导人BCG构建rBCG,将含有重组子的细菌培养至对数生长期,在收菌前3天每天45℃热诱导30min,然后对表达产物作SDS-PAGE及免疫印迹分析.结果：多房棘球绦虫pBCG-Em14-3-3在BCG中成功表达了Em14-3-3重组蛋白,在相对分子量为27KDa处可见明显的表达蛋白带,其表达量占菌体总蛋白量的11%.结论：多房棘球绦虫pBCG-Emi4-3-3能在BCG中高效表达,且能与鼠血清抗体发生特异结合,提示rBCG-Em14-3-3疫苗表达的Em14-3-3重组蛋白具有特异的抗原性.     

多房棘球绦虫葡萄糖转运蛋白1重组抗原肽构建及原核表达方法建立

目的 设计构建及表达纯化多房棘球绦虫葡萄糖转运蛋白1重组抗原肽(GLEP),为后续疫苗研究寻找有效工具.方法 用生物信息学软件预测EmGLUT1跨膜结构,将设计构建的表达载体pC zn1-GLEP转化入大肠杆菌真核表达系统,经IPTG诱导、Ni-NTA纯化获得目的 蛋白.结果 生物信息学软件分析结果表明EmGLUT1为...     

新疆狐、狼体多房棘球绦虫形态观察

作者调查了准噶尔盆地塔城、和丰、北屯、福海、阜康、小拐等地区及乌鲁木齐西南效区,狐、狼体多房棘球绦虫感染。对各地绦虫形态作了比较,主要形态结构均相似,最高感染率为33％。调查中发现,狼体寄生的多房棘球绦虫与狐体标本在体节数、孕节外形、顶突钩及奉丸形态上有不同点。     

细粒棘球绦虫AgB8/1重组抗原表达系统的构建

目的 构建pET32a-AgB8/1原核表达载体,并对其重组蛋白进行原核细胞表达.方法 从细粒棘球绦虫原头蚴中提取总RNA,反转录生成cDNA,以此cDNA为模板用基因特异性引物扩增EgAgB8/1基因编码其分泌型多肽的片段,经测序后,以此基因片段为依据,人工合成合成EgAgB8/1抗原编码核酸序列,将其克隆至pUCm-T载体,测序鉴定其正确性.通过对pUCm-T/AgB8/1重组质粒进行双酶切,将获得的AgB8/1抗原编码核酸序列用定向克隆技术克隆至原核表达质粒pET32a上,测序鉴定插入片段正确性后,转化至E.coli BL21 (DE3)Lys S,IPTG初步诱导表达pET32a-AgB8/1重组蛋白.用SDS-PAGE电泳分析鉴定重组蛋白的表达水平.结果 测序表明,AgB8/1抗原编码核酸序列正方向插入至pET32a质粒.SDS-PAGE电泳分析显示,IPTG诱导后重组蛋白得到成功表达,在相对分子量约28 kDa处有表达条带.结论 本研究成功构建了pET32a-AgB8/1原核表达质粒,并初步诱导表达出AgB8/1重组蛋白,为进一步研究其免疫学特性奠定了基础.     

细粒棘球绦虫重组质粒pBI-Eg95构建及其在根癌农杆菌LBA4404中表达效率的研究

目的:构建细粒棘球绦虫重组质粒pBI-Eg95,分析其在根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens,At)LBA4404株中的表达效率.方法:从细粒棘球蚴包囊中分离原头节,超声粉碎后抽提总RNA,采用RT-PCR方法扩增Eg95编码基因,将该基因定向克隆到植物表达载体pBI121中构建pBI-Eg95重组质粒;电穿孔转化At(LBA4404),抽提质粒进行酶切及PCR鉴定.用IPTG分别诱导rAt 0、1、3、5、7、9、11和13h.用SDS-PAGE和Western blot鉴定所表达的蛋白质.结果:471bp Eg95基因克隆成功.经酶切及PCR证实重组质粒pBI-Eg95成功转入At(LBA4404).用Bio-Rad Quantity one分析系统分析,表达产物分子质量(Mr)约为16.5 kD,且能被感染细粒棘球蚴的鼠血清特异识别,表达效率为约占LBA4404菌体总蛋白的20%.结论:成功构建了细粒棘球绦虫重组质粒pBI-Eg95,且能在At(LBA4404)中表达,为进一步研究细粒棘球绦虫转基因植物疫苗奠定了基础.     

细粒棘球绦虫重组pCD-Eg95质粒构建及鉴定

目的:构建并鉴定细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus,Eg)重组pCD-Eg95质粒.方法:从细粒棘球蚴包囊中分离原头节,超声粉碎后抽提总RNA,采用RT-PCR方法扩增Eg95编码基因,将该基因定向克隆到真核表达载体pCDNA3.1中构建pCD-Eg95重组质粒;电穿孔转化大肠杆菌BIA21(DE3)株,抽提质粒进行酶切及PCR鉴定.结果:电泳及测序证实471 bpEg95基因克隆成功.经酶切及PCR证实重组质粒pCD-Eg95成功转入BL21(DE3).结论:成功构建了Eg重组pCD-Eg95质粒.     

结核分枝杆菌重组Bb-MPT64疫苗的构建、鉴定及表达

目的:构建和鉴定结核分枝杆菌重组双歧杆菌(Bifidobacteria bifidum,Bb)-MPT64疫苗.方法:以结核分枝杆菌H37Rv标准株基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到MPT64抗原编码基因序列,定向克隆入大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT中,构建重组质粒pGEX-MPT64;用电穿孔法将该质粒导入Bh及BL21(DE3),构建结核分枝杆菌重组双歧杆菌-MPT64疫苗.用IPTG诱导重组BL21(DE3)菌表达MPT64/GST融合蛋白;SDS-PAGE及Western blot对表达产物进行鉴定.结果:PCR成功扩增出688bp的MPT64目的基因;双酶切证实MPT64目的基因成功插入pGEX-1λT中;PCR证实rBb-MPT64疫苗构建成功.免疫印迹分析发现重组质粒pGEX-MPT64的表达产物在相对分子量(50ku)处有明显的蛋白表达条带,且能被活动性结核病人血清特异识别.结论:成功构建了结核分枝杆菌rBb-MPT64疫苗,为发展新型结核病疫苗奠定了基础.