EB病毒融合蛋白ZtaN-p23在大肠杆菌中的表达、纯化及活性鉴定

目的:克隆EB病毒立即早期蛋白ZtaN和衣壳蛋白p23,构建原核表达载体,并在大肠杆菌中表达融合蛋白,为后续利用蛋白进行疾病诊断奠定基础。方法:采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术从B95-8细胞中分别扩增出目的基因BZLF1N和BLRF2,利用融合PCR法将两个基因进行连接,构建重组质粒pGEX-4T-1-BZLF1N-BLRF2,并转化大肠杆菌BL21(DE3)。加入IPTG诱导表达融合蛋白ZtaN-p23,通过SDS-PAGE和Western blot确定蛋白表达量及活性鉴定。结果:重组质粒pGEX-4T-1-BZLF1N-BLRF2经双酶切鉴定和序列分析正确,证实已成功构建原核表达载体;SDS-PAGE显示诱导的蛋白Mr约46 000,与预期值一致;对融合蛋白表达条件进行优化后,发现其主要以包涵体的形式存在于细胞中;亲和层析结果显示纯化后的ZtaN-p23纯度>95%;Westernblot显示ZtaN-p23具有良好的生物活性。结论:成功构建原核表达载体pGEX-4T-1-BZLF1N-BLRF2,并在大肠杆菌中进行了表达纯化,融合蛋白显示出良好的活性。     

β-hCG蛋白在大肠杆菌系统的表达、纯化及活性鉴定

目的 获得β-人绒毛膜促性腺激素(β-hCG)融合蛋白β-hCG/GST并验证其抗原活性.方法 利用PCR法扩增β-hCG全长基因,将其克隆至原核表达载体pET-42a中,构建重组质粒pET-42a-β-hCG,将该重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中IPTG诱导表达,经SDS-PAGE分析,亲和层析法纯化融合蛋白,目的蛋白用Western blot法鉴定,ELISA检测纯化得到的融合蛋白的抗原活性.结果 测序结果证实成功扩增出目的基因β-hCG;酶切和测序结果证实pET-42a-β-hCG原核表达载体构建成功;转化后可以成功诱导并纯化出大小与预期一致的蛋白;Western blot法及ELISA检测证实纯化后的β-hCG/GST融合蛋白具有良好的免疫原性.结论 成功获得β-hCG/GST融合蛋白,该蛋白具有良好的免疫原性,为以β-hCG为靶位的抗肿瘤主动免疫治疗研究奠定了基础.     

NY-ESO-1/GST融合蛋白在大肠杆菌的表达、纯化及鉴定

目的:构建肿瘤-睾丸抗原NY-ESO-1与GST融合基因的原核表达载体,在大肠杆菌中表达并对融合蛋白NY-ESO-1/GST进行纯化和初步鉴定。方法:设计针对NY-ESO-1的特异性引物,采用聚合酶链反应(PCR)从睾丸组织的cDNA文库扩增NY-ESO-1基因片段,经上下游引物所引入的EcoR I和Xho I双酶切后克隆入原核表达载体pGEX-4T1中GST标签的下游,构建重组表达载体pGEX-4T1-NY-ESO-1,并将该载体转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中,IPTG诱导表达NY-ESO-1/GST融合蛋白,经不同浓度尿素洗脱纯化后,表达产物通过SDS-PAGE和Western blot法进行鉴定。结果:重组质粒经限制性内切酶EcoR I和Xho I双酶切鉴定和IPTG诱导表达NY-ESO-1/GST的SDS-PAGE分析表明,表达产物的相对分子质量(Mr)为44 000,与理论值相符,并主要以包涵体形式存在,灰度扫描分析显示融合蛋白表达量占菌体蛋白总量的90%,Western blot结果证实该NY-ESO-1/GST可与抗GST单克隆抗体(mAb)发生特异性结合反应,提示为融合蛋白。结论:成功构建了NY-ESO-1基因原核表达载体pGEX-4T1-NY-ESO-1,利用大肠杆菌表达系统,获得了较高纯度的包涵体形式NY-ESO-1/GST融合蛋白。     

VEGFR2 D3.4/GST融合蛋白在大肠杆菌的表达、纯化及鉴定

目的: 构建人血管内皮细胞生长因子II型受体(VEGFR2)胞膜外区第三及第四个免疫球蛋白样结构域与GST融合蛋白VEGFR2 D3.4/GST基因的原核表达载体, 在大肠杆菌中表达并纯化该融合蛋白.方法: 由公司合成VEGFR2胞膜外区第三、第四免疫球蛋白样结构域氨基酸的编码序列, 克隆入原核表达载体pGEX-4T1中GST标签的下游, 构建重组表达载体pGEX4T-VEGFR2D3.4, 将该载体转化大肠杆菌BL21(DE3) pLysS, IPTG诱导表达VEGFR2 D3.4/GST融合蛋白, 经不同浓度尿素洗脱纯化后, 表达产物用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定.结果: SDS-PAGE分析表明, 表达产物的相对分子质量(Mr)为46 000, 与理论值相符, 主要以包含体形式存在; 灰度扫描分析融合蛋白的表达量占菌体蛋白总量的38.6%, 纯化产物纯度最高为87.1%, Western blot 证实该蛋白为VEGFR2 D3.4/GST融合蛋白.结论: 利用大肠杆菌表达系统, 获得了较高纯度的包含体形式VEGFR2 D3.4/GST融合蛋白.     

重组人MUC1-MBP融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化及其免疫活性测定

目的 :以MUC1为靶点研制抗肿瘤蛋白疫苗。方法 :将MUC1基因连入pMAL p2原核表达载体 ,并转化大肠杆菌 ,通过IPTG诱导MUC1表达 ,经Westernblot鉴定 ,Amylose亲和层析纯化蛋白。用MUC1 MBP免疫健康C5 7BL 6小鼠 ,测定其免疫活性 ,通过ELISA测定血清中抗MUC1抗体的效价 ;采用MTT法测定小鼠脾CTL活性 ,通过3H TdR掺入法测定T细胞增殖能力。结果 :成功构建了pMAL MUC1表达载体并得到稳定表达MUC1的菌株 ,鉴定了MUC1在大肠杆菌中的表达 ,纯化了MUC1蛋白。经重组MUC1 MBP免疫的C5 7小鼠 ,血清抗MUC1抗体的效价为 1:5 76 0± 32 2 1;脾CTL对MCF 7及Lewis肺癌细胞的杀伤率分别为 4 7 7%± 4 3%和 6 7 5 %± 6 5 %。结论 :人类重组MUC1融合蛋白可引发小鼠CTL反应和体液免疫应答 ,有希望研制成抗腺癌蛋白疫苗。     

自身抗原La融合蛋白在大肠杆菌中的表达及免疫学鉴定

系统性自身免疫病患者血清中有多种针对核蛋白复合物 (ＲＮＰ)的自身抗体 ,它们在发病机制中的作用尚不清楚。抗Ｌａ抗体常出现在许多系统性自身免疫病患者的血清中 ,如系统性红斑狼疮 (ＳＬＥ)、干燥综合征(ＳＳ)、和新生儿狼疮 (ＮＬＥ)。因此 ,我们克隆了ＬａｃＤＮＡ ,并在大肠杆菌中表达其融合蛋白 ,经免疫印迹法证实其抗原性 ,以期进一步分析其分子结构及临床意义。1　材料与方法1.1　材料　ＰＧＥＸ 2Ｔ质粒 ;ＪＭ10 9菌株 ;ＬａｃＤＮＡｃｌｏｎｅｐＬａ (本中心所存 ) ;ＴａｑＤＮＡ多聚酶 ,ＥｃｏＲＩ内切酶 ,ＢａｍＨＩ内切酶 ,…     

IFNα A-HBV preS 融合蛋白在大肠杆菌中的表达及生物学活性的初步鉴定

本实验利用重组ＩＦＮαＡ－ＨＢＶｐｒｅＳ融合基因ｐｌｙ５质粒在大肠杆菌ＤＨ５α中表达ＩＦＮαＡ－ＨＢＶｐｒｅＳ融合蛋白。该融合基因产物的分子量为３９ｋＤ左右，融合蛋白的表达率为１１．８％。对该融合蛋白的初步鉴定表明：该融合蛋白既具有ＨＢＶｐｒｅＳ蛋白的免疫原性，又具备ＩＦＮα的生物学活性。     

融合蛋白mTSLPR-Ig的表达、纯化及其鉴定

目的:构建含小鼠TSLPR胞外段与小鼠Ig Fc段融合基因的腺病毒表达载体(Ad-mTSLPR-Ig),体外表达、纯化并鉴定可溶性融合蛋白mTSLPR-Ig。方法:运用PCR方法从小鼠胸腺cDNA文库中扩增mTSLPR胞外段基因,构建并鉴定mTSLPR胞外段与小鼠Ig Fc段融合基因的腺病毒表达载体(Ad-mTSLPR-Ig);将Ad-TSLPR-mIg转染COS-7细胞,收集细胞上清液;采用双抗体ELISA夹心法检测上清中融合蛋白表达;经蛋白A亲和层析,制备纯化可溶性融合蛋白mTSL-PR-Ig。结果:经测序证实,所构建表达载体的目的基因片段mTSLPR-Ig序列正确,成功包装出腺病毒表达载体Ad-mTSL-PR-Ig;ELISA法检测到上清中融合蛋白mTSLPR-Ig的表达;通过亲和层析法获得纯化的融合蛋白,经Western blot鉴定融合蛋白表达无误。结论:成功获得可溶性融合蛋白mTSLPR-Ig,为进一步研究其生物学特性奠定基础。     

自身抗原PDC-E2融合蛋白在大肠杆菌中的表达及免疫学鉴定

目的：用基因工程的方法克隆表达丙酮酸脱氢酶复合体E2（PDC-E2）融合蛋白,以用于人原发性胆汁性肝硬化（PBC）的早期发现和临床诊断.方法：针对PDC-E2的cDNA序列设计引物,从正常人的淋巴细胞中提取RNA,通过反转录PCR方法扩增得到相应的基因片段,经测定序列验证后插入表达载体pET28a（＋）,构建重组表达载体pET28a（＋）-PDC-E2,转化大肠杆菌BL21（DE3）后诱导表达蛋白质.表达蛋白经SDS-PAGE、Western blot鉴定.结果：经核苷酸序列测定和酶切鉴定结果表明,成功地构建了PDC-E2重组质粒.IPTG诱导表达后,获得PDC-E2融合蛋白.经免疫学鉴定,重组抗原片段具有抗线粒体抗体二亚型（AMA-M2）的免疫原性.结论：获得PBC特异性靶抗原的多肽片段,为PBC的早期发现和临床诊断提供有力工具.     

鼠疫F1-V融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达及鉴定

目的通过构建pET-11c-F1-V融合表达质粒,从而获得具有免疫原性的融合蛋白。方法克隆鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)的F1基因和V基因,然后将F1基因和V基因分别连接到pGEM-T载体上,经测序正确后再将F1基因和V基因连接到pET-11c原核表达载体上,构建pET-11c-F1-V融合表达质粒,并转化到BL21(DE3)大肠杆菌中,进行PCR及双酶切鉴定,筛选阳性克隆,通过IPTG诱导F1-V表达,经SDS-PAGE检测表达产物,通过Western-Blot检测重组蛋白的免疫原性。结果测序结果显示F1基因的碱基序列与Gene-bank(X 61996)完全一致,V基因的碱基序列与Gene-bank(M 26405)相比在564 bp处有一同义突变;SDS-PAGE在Mr约58 000处出现一条蛋白条带,经薄层扫描分析目的蛋白条带约占全菌体蛋白的25％左右,主要以可溶性蛋白形式存在;Western-Blot显示重组蛋白具有免疫原性。结论成功地构建了pET-11c-F1-V融合表达质粒,并且在大肠杆菌中获得了高效表达,表达的蛋白具有免疫原性。     

人MBL糖识别域在大肠杆菌中的表达、纯化及鉴定

目的原核表达重组人甘露聚糖结合凝集素（MBL）糖识别域（CRD）。方法采用PCR技术,从含汉族人MBL全长编码区cDNA的重组质粒pGEM-mbl中扩增出CRD包括颈区的基因片段,将其插入原核表达载体pGEX-4T1中,经PCR、限制性酶切和测序确证后,以IPTG诱导其在大肠杆菌中表达。包涵体经变性、复性后以GSTtrap亲和层析柱纯化,融合蛋白经凝血酶切割后回收目的蛋白。分别以Western blot和ELISA分析表达产物的免疫学和糖结合活性。结果PCR扩增得到长约450bp的目的基因片段,插入pGEX-4T1载体所获重组表达载体pGEX4T1-CRD的酶切图谱和序列与预期的一致。重组子经诱导表达,表达产物主要以包涵体形式存在。以GSTtrap亲和层析柱纯化获得约Mr43000的GST-CRD融合蛋白,经凝血酶切割后得到约Mr17000的CRD蛋白。纯化的GST-CRD蛋白能与抗人CRD单克隆抗体特异性结合并具糖结合活性。结论获得了具生物学活性的人MBL CRD蛋白,为进一步探索MBL分子CRD的效应功能提供了实验材料。     

氯霉素乙酰基转移酶融合蛋白表达、纯化和鉴定

目的对氯霉素乙酰基转移酶(Chloramphenicol acetyltransferase,CAT)基因进行表达和纯化.方法通过PCR扩增编码CAT氨基酸序列的基因片断,并将之克隆入pGEX-2T载体.IPTG诱导蛋白融合表达,产物经琼脂糖亲和层析树脂纯化.免疫印迹鉴定纯化蛋白的抗原性.结果筛选得到的重组子诱导后表达相对分子质量约为52 600的CAT融合蛋白.树脂纯化及酶切后均得到高纯度的蛋白样品.纯化蛋白能与抗CAT抗体特异结合.结论本研究获得了CAT基因的融合表达蛋白,并对其完成纯化,为制备抗血清和抗体打下基础.     

TLR4胞外段在大肠杆菌中的可溶性表达、纯化及鉴定

目的：构建谷胱甘肽转硫酶-TLR4融合蛋白表达载体，并研究其编码的蛋白质在大肠杆菌中的表达。方法：利用PCR从含TLR4全长cDNA序列的质粒中扩增其胞外段，约1800bp，然后将其克隆入pMD18-T载体中。测序确证后重组入谷胱甘肽转硫酶融合表达载体pGEX-4T-1中，并用IPTG诱导其在大肠杆菌中表达。结果：PCR扩增的TLR4胞外区基因序列与GenBank数据库中的序列一致。重组质粒经酶切鉴定及测序证实，TLR4基因已正确插入到pGEX-4T-1中。重组表达质粒转化感受态大肠杆菌HBl01后用IPTG诱导，获得Mr92 000的GST-TLR4融合蛋白；37℃，O.2mmol／L IPTG诱导4h，SDS-PAGE电泳后，经薄层凝胶扫描分析该融合蛋白占菌体蛋白总量34．25％，部分以包涵体存在，可溶性蛋白约占27．84％；亲和层析纯化后纯度大于90％。Western-blot证实GST-TLR4融合蛋白能与TLR4单抗特异性结合。结论：成功地构建融合蛋白表达载体pGEX-TLR4，并在大肠杆菌中获得有效表达，获得了纯度大于90％的可溶性GSI-TLR4融合蛋白，为进一步研究其功能及制备TLR4单克隆抗体奠定了基础。     

人survivin蛋白的原核表达、纯化及抗原活性鉴定

目的 构建人肿瘤抗原survivin的原核表达载体,优化在大肠杆菌中的表达条件,并对survivin/His融合蛋白进行纯化和抗原活性鉴定.方法 设计针对survivin基因序列的特异引物,通过聚合酶链式反应(PCR)扩增人survivin全长基因序列(538 bp)克隆至原核表达载体pET28a(+),构建重组表达载体pET28 a-survivin,并将该载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达survivin/His融合蛋白,并采用Ni亲和层析凝胶纯化重组蛋白.纯化后的重组蛋白经Western blot法、ELISA鉴定其抗原活性.结果 重组表达载体经BamH Ⅰ和HindⅢ鉴定正确;IPTG诱导后经SDS-PAGE分析表明获得了相对分子质量(Mr)24000大小的重组蛋白;纯化后的蛋白纯度达到90％.Western blot法和ELISA检测证实纯化的survivin蛋白能够与特异性抗体发生反应,表明其具有良好的抗原活性.结论 成功构建了原核表达载体pET28 a-survivin,利用大肠杆菌表达系统实现了融合蛋白的可溶性表达并进行纯化,纯化后survivin蛋白经鉴定具备较高的抗原活性.     

在大肠杆菌中表达EB病毒壳抗原及在诊断中的应用

在大肠杆菌中表达ＥＢ病毒壳抗原及在诊断中的应用潘卫东李燕谷淑燕ＥＢ病毒壳抗原（ＶＣＡ）特异性抗体的血清学普查对于鼻咽癌的早期发现和治疗有重大意义，但是从自然表达ＥＢ病毒相关抗原的类淋巴母细胞株提取抗原，受抗原来源及纯化方法的限制，无法获得足够的抗原用...     

MAGE-D4a融合蛋白的原核表达、纯化及鉴定

目的:构建肿瘤相关抗原MAGE-D4a的原核重组体系,表达、纯化融合蛋白。方法:PCR法从胶质瘤组织cDNA中扩增MAGE-D4a基因全长编码区,连接入原核表达载体pMAL-c2,筛选、鉴定阳性克隆并测序。将重组质粒转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)诱导表达,表达产物经AmyloseResin亲和层析分离纯化,并且对纯化的融合蛋白进行质谱鉴定。结果:成功扩增了MAGE-D4a基因;重组质粒在Rosetta大肠杆菌中诱导表达出MBP/MAGE-D4a融合蛋白;优化了MAGE-D4a原核表达体系的最适条件;蛋白质谱分析结果显示表达的基因重组蛋白与目的蛋白相符。结论:获得了高效表达、可溶性的MAGE-D4a重组蛋白,为抗体的制备及血清学分析奠定了基础。     

大肠杆菌表达p21^ras蛋白的纯化及活性研究

本实验利用重组ｒａｓ基因高效表达质粒ｐＪＬｃⅡｒａｓ在大肠杆菌ＴＡＰ１０６菌株中表达ｐ２１蛋白，该产物为融合蛋白，分子量在２３ｋＤ左右，具有ｒａｓ基因产物ｐ２１的全部生物学活性。在进行初步的酶切鉴定所构建质粒的组成后，本实验比较了４２℃水浴诱导不同时间菌体表达ｐ２１的效率，继而探讨了重组产物ｐ２１蛋白运用变性剂，通过变性──复性──层析的方法进行纯化的可行性，并检测了纯化产物的ＧＴＰ结合活性。结果表明，在４２℃水浴振荡诱导４ｈ可使ｐ２１表达量达到最大值，约占全部菌体蛋白总量的１５．６％；温度诱导表达的ｐ２１蛋白绝大部分以不溶状态存在于裂菌后沉淀中，经ＮＰ４０、脱氧胆酸钠等洗涤剂反复洗涤后，离心所得沉淀中ｐ２１ｒａｓ的纯度达８０％以上。将初步洗涤纯化的沉淀用８Ｍ尿素溶解，再通过缓慢的梯度透析逐步除去溶液中的尿素，在这一过程中相当一部分ｐ２１分子可逐渐复性为可溶解状态。利用阴离子交换柱层析可使复性后的ｐ２１蛋白得到进一步的纯化。在硝酸纤维素膜上进行的ＧＴＰ结合试验结果证明，经变性──复性──柱层析的纯化方法有效，纯化后的可溶性ｐ２１复性良好，ＧＴＰ结合活性明显提高。     

人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIv-1)gag前体蛋白片段在大肠杆菌中的表达、纯化及鉴定

人类免疫缺陷病毒Ⅰ型（ＨＩＶ－１）核心抗体的检测对于ＨＩＶ－１感染者的筛选及确证分析，感染病人的预后分析都具有重要的意义。为此需要获得大量重组核心蛋白。本文利用新型原核表达载体ｐＤＯＧ，在大肠杆菌中高效表达了人类免疫缺陷病毒Ⅰ型（ＨＩＶ－１）ｇａｇ基因片段。表达载体利用ＬＰＲ启动子以及Ｔ７噬菌体基因１０（ｇ１０）的核糖体结合位点（ＲＢＳ）来有效起始表达基因的翻译。表达片段ＰＧ１包括ｐ１７Ｃ－端１３ａａ、整个ｐ２４以及ｐ１５Ｎ－端７４ａａ。与ＰＧ１相比ＰＧ２片段不含有ｐ１７序列，并缺失了ｐ２４Ｎ－…     

重组人TNF-α在大肠杆菌中的表达、纯化及生物学活性研究

目的探讨优化通过大肠杆菌表达重组人TNF-α的相关条件,改良纯化策略,为使用噬菌体随机肽库技术筛选抗TNF-α特异小分子肽提供纯度高活性好的靶蛋白. 方法将表达质粒pUC118- TNF-α转化入大肠杆菌,对表达条件进行优化后进行大量表达.再先后使用SP-FF阳离子交换层析柱和Q-FF阴离子交换层析柱对重组人TNF-α蛋白进行纯化.应用Western blot和细胞测活分别检测重组人TNF-α蛋白的抗原性和细胞毒活性.结果为筛选TNF-α特异性结合肽通过大肠杆菌高效表达出纯度高活性好的重组人TNF-α靶蛋白.