pEGFP-N1-linamarase重组真核表达载体的构建及linamarase在MH-CC97中的表达

目的:构建携带木薯亚麻苦甙水解酶(lis)基因,以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因的重组真核表达载体,并导人人肝癌细胞MHCCW中表达.方法:提取木薯总RNA,PCR扩增lis目的基因,将该全长基因定向克隆至真核表达载体pEGFP-N1上,构建重组质粒载体.利用电穿孔转染体外培养的MHCC97,在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察lis-EGFP融合蛋白在细胞中的表达;PCR检测lis基因转录水平的表达;Western Blot方法验证lis蛋白水平的表达.结果:PCR扩增片段与预期结果相符,酶切和测序证明pEGFP-N1-lis真核表达载体构建成功.pEGFP-N1-lis转染MHCC97细胞后,Western Blot可以检测到lis蛋白在MHCC97细胞表达,用荧光显微镜观察到转染细胞中有绿色荧光蛋白表达.结论:成功构建真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N1-lis,可为后续lis基因功能的研究奠定实验基础.     

pEGFP-AFP-TK重组真核表达载体的构建及在PEG-PEI/Fe3O4纳米磁流体介导下转染肝癌细胞

目的:构建甲胎蛋白(AFP)启动子介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)重组真核表达载体,并检测其在AFP阳性肝癌细胞株的特异性表达.方法:PCR 扩增AFP 基因启动子、HSV-TK基因,将上述片段插入EGFP-N1载体的多克隆位点,构建pEGFP-AFP-TK重组表达载体,通过包裹PEG-PEI/Fe3O4纳米磁流体,经其介导,转染AFP 阳性肝癌细胞株HepG2 和AFP阴性肝癌细胞株SMMC7721, 利用增强型绿色荧光蛋白及Western blotting法检测目的基因在2种细胞系中的表达.结果与结论:肝癌特异性真核表达载体pEGFP-AFP-TK构建成功.利用增强型绿色荧光蛋白及Western blotting法可以检测到嵌合AFP启动子的pEGFP-AFP-TK重组真核表达载体能够特异性在AFP阳性的肝癌细胞株表达,而在AFP阴性的肝癌细胞株中基本不表达.     

TK自杀基因的构建及鉴定

目的利用分子生物学技术,构建胸苷激酶基因（TK）自杀基因并测定其结构,为该自杀基因的进一步研究提供良好的实验基础。方法以人类单纯疱疹病毒Ⅰ（HSV1）基因组DNA为模板,利用聚合酶链反应（PCR）法,扩增出约为1 100 bp TK基因,定向克隆到载体PEGM-T,构建克隆载体。两端分别引入限制性内切酶NotⅠ、XholⅠ酶切位点,经PCR及酶切鉴定初步证实为重组体后,测序认证。结果经PCR、酶切鉴定和测序鉴定完成TK基因的构建,同源性高达98.70%,完全具备表达该目的基因的要求。结论成功扩增出TK基因,为继续研究打下基础。     

pcDNA3.1-hTERT真核表达载体的构建及其抗肿瘤效应

目的:构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)真核表达载体pcDNA3.1-hTERT,并观察其对荷瘤小鼠的抗肿瘤效应.方法:用RT-PCR方法扩增出带有Hind Ⅲ, BamHⅠ酶切位点的hTERT基因片段,与pGEM-T Easy克隆载体连接,筛选出阳性克隆,酶切获得目的片段,与pcDNA3.1载体连接,构建pcDNA3.1-hTERT表达载体.将真核表达载体pcDNA3.1-hTERT注射移植性H22肝癌模型C57BL/6小鼠,并设PBS组及转染空质粒pcDNA3.1组,观察3组的抗肿瘤效应.结果与结论:成功构建pcDNA3.1-hTERT真核表达载体.该载体中的hTERT基因片段全长为951 bp,可编码相对分子量为37 000、由317个氨基酸构成的多肽.该基因片段与GenBank公布的相应基因进行同源性比较,核苷酸序列的同源性为98.73%,编码产物的氨基酸序列的同源性为99.68%.该真核表达载体免疫荷瘤小鼠后,pcDNA3.1-hTERT组肿瘤生长受到抑制,且该组生存期分别长于PBS组及pcDNA3.1组 (P<0.05);pcDNA3.1- hTERT组的IL-2、IFN-γ细胞因子水平也均高于PBS组与pcDNA3.1组(P<0.05).提示该真核表达载体在受试动物体内可有效地诱导特异性抗肿瘤免疫应答.     

MDR1启动子调控的双自杀基因真核表达载体的构建及其在K562/A02细胞中的表达

目的：构建多药耐药基因（MDR1）启动子调控的CD-TK双自杀基因真核表达载体用于耐药白血病的靶向性基因治疗。方法：采用PCR方法从K562/A02细胞基因组DNA中扩增MDR1启动子，将其连接到双自杀基因CD TK的上游，构建pcDNA3 MDR1 Promoter CD-TK真核表达载体，用脂质体介导法将构建好的载体转染入K562、K562/A02细胞，PCR鉴定CD、TK基因的整合，RT-PCR鉴定CD、TK基因的表达。结果：PCR克隆出MDR1启动子经DNA测序证实序列正确，通过连接成功构建含正确目的基因的表达载体pcDNA3-MDR1-Promoter-CD-TK。转染入细胞后PCR结果显示，CD、TK基因均整合入K562、K562/A02细胞中，RT-PCR结果显示,562/A02/CD TK细胞CD、TK基因有特异性条带表达，而K562/CD TK细胞无特异性条带。结论： MDR1启动子调控的CD TK双自杀基因真核表达载体的成功构建及其在K562/A02细胞中的特异性表达为耐药白血病的靶向性基因治疗提供了实验基础。     

pEGFP-N1-亚麻苦甙水解酶重组真核表达载体的构建及亚麻苦甙水解酶在SGC-7901细胞中的表达

目的:构建携带亚麻苦甙水解酶(lis)基因的重组真核表达载体,以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,导入SGC-7901细胞中表达。方法:提取木薯总RNA,PCR扩增lis目的基因,将该基因全长定向克隆至真核表达载体pEGFP-N1上,构建重组质粒载体。用电穿孔法转染体外培养的SGC-7901细胞,在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察lis-EGFP融合蛋白在细胞中的表达。用PCR检测lis转录水平的表达,用Western blot法验证lis蛋白水平的表达。结果:酶切和测序证实pEGFP-N1-lis重组质粒构建正确,重组质粒载体在SGC-7901细胞中获得了表达,表达的融合蛋白具有lis和EGFP的双重活性。结论:通过基因克隆方法成功地构建了pEGFP-N1-lis重组质粒载体,并且在SGC-790细胞中稳定表达。     

pcDNA3.1-mAFP真核表达载体的构建及其在293细胞中的表达

目的构建真核表达载体pcDNA3．1-mAFP，观察其在293肿瘤细胞中的表达情况。方法从Hepal-6小鼠肝癌细胞中提取总RNA，设计特异性引物，通过RT-PCR法扩增小鼠甲胎蛋白（mAFP）基因编码区全长序列，测序确认后，插入到pcDNA3．1真核表达载体中，双酶切鉴定。用Lipofectamine脂质体将构建的重组载体转染293肿瘤细胞，检测AFP蛋白在293细胞中的表达情况。结果成功克隆了mAFP基因编码区全长序列，构建出重组真核表达载体pcDNA3．1-mAFP，脂质体转染后可检测到mAFP基因在293细胞中的表达。结论该研究成功构建了重组pcDNA3．1-mAFP真核表达载体，为进一步开展原发性肝癌的靶向性基因治疗奠定了基础。     

NS特异性siRNA真核表达载体的构建

目的：构建nucleostemin(核干细胞因子，NS)特异性siRNA真核表达载体。方法：以小鼠组织基因组DNA为模板，PCR方法克隆小鼠编码U6 snRNA基因的启动于，将NS—siRNA表达序列、PolⅢ识别的终止信号与U6启动于连接起来，并将其插入pcDNA4／C载体中。结果：(1)从小鼠基因组DNA中克隆到编码U6 snRNA基因的启动子，(2)构建了含有U6启动子、NS—siRNA表达序列和PolⅢ识别终止信号的NS—siRNA表达的片段，(3)将NS—siRNA表达片段插入了pcDNA4／C真核表达载体。结论：构建了针对NS特异性的siRNA真核表达载体pcDNA4／C—NS—Silencer。     

人akt1基因真核表达载体的构建及表达

目的:构建带有flag标签的人akt1及豆蔻酰化akt1真核表达载体,并检测其在真核细胞中的表达及对细胞周期的影响.方法:应用RT-PCR的方法从人牙髓组织mRNA中扩增出akt1和myr-akt1基因,并在其C-末端带上含24bp的flag标签,克隆到pMD-18T载体并测序,再亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1( ),酶切鉴定正确后采用脂质体法瞬时转染COS-7细胞,Western blot检测flag-akt1及flag-myr-akt1在细胞中的表达,同时流式细胞术观察细胞周期.结果:测序证实从人牙髓组织mRNA中扩增出的flag-akt1及flag-myr-akt1融合基因的序列以及读框全部正确;脂质体法转染COS-7后检测到预期目的蛋白的表达.流式细胞术的结果显示当AKT1过度表达以及过度活化时对COS-7细胞周期未产生明显影响.结论:成功构建了C-末端带flag标签的akt1及豆蔻酰化akt1真核表达载体,并使其在真核细胞COS-7中表达.但是AKT1对细胞周期的调控有待进一步研究.     

大鼠GDNF真核表达载体的构建及其真在核细胞中的表达

目的：构建ｐｃＤＮＡ３／ＧＤＮＦ真核表达质粒并了解其在真核细胞内的表达．方法：将ＧＤＮＦ逆转录聚合酶链式反应产物克隆至ｐｃＤＮＡ３真核表达载体上,经酶切鉴定及测序分析并以脂质体介导法转染真核细胞,了解其在细胞内的表达及其表达蛋白的生物学活性．结果：酶切鉴定及测序分析表明重组ｐｃＤＮＡ３／ＧＤＮＦ表达质粒克隆成功,转染实验表明重组质粒能在真核动物细胞中表达出具有活性的ＧＤＮＦ蛋白．结论：以脂质体介导     

人类细胞周期蛋白D3反义表达质粒的构建

目的：构建人类细胞周期蛋白D3(cyclin D3)反义表达质粒，为今后利用反义核酸阻断技术研究cyclin D3基因的功能提供基础。方法：运用DNA重组技术将人cyclin D3基因反向克隆到真核表达载体pcDNA3．1中，构建成cyclin D3反义表达质粒pcDNA3--ascyclinD 3。结果：通过酶切鉴定及测序分析证实，实验成功构建了人cyclin D3反义表达质粒。结论：cyclin D3反义表达质粒pcDNA3--ascyclin D3的成功构建，为进一步研究cyclin D3的生物学功能及其在肿瘤发生、发展、诊疗和预后中的作用奠定了基础。     

HBV S基因重组体的构建及免疫小鼠的实验

目的 :探讨 HBV核酸免疫的可行性。方法 :采用 PCR技术 ,扩增得到编码 HBV HBs Ag的 S基因片段 ,将其插入到真核表达载体 pc DNA3,酶切鉴定并测序确证 ,得到质粒 pc DNA3- S,转染至 COS- 7细胞表达。将所构建的核酸疫苗免疫小鼠 ,观察其诱导产生的特异性体液免疫和细胞免疫功能。结果 :HBV S基因序列与文献报道一致 ,转染真核细胞后能表达目的蛋白。免疫小鼠后实验组和阳性对照组抗 - HBs阳性率分别为 70 % (7/ 10 )和 80 %(8/ 10 ) ,抗体水平分别为 (32 .14± 13.79) m IU/ ml和 (2 8.5 0± 11.87) m IU/ ml,两者比较无显著性差异 (P>0 .0 5 )。对照组和空白组抗 - HBs均为阴性 ,小于 10 m IU/ ml。实验组和阳性对照组的特异性 CTL杀伤率在效∶靶比为 2 0∶ 1时分别为 (35 .4 0± 4 .85 ) %和 (38.2 0± 7.6 9) % ,效∶靶比为 10∶ 1时则分别为 (2 3.95± 3.98) %和 (2 4 .5 5±3.5 9) % ,两者比较无显著性差异 (P>0 .0 5 )。对照组和空白组的 CTL杀伤率在效∶靶比为 2 0∶ 1和 10∶ 1时均小于 5 %。结论 :pc DNA3- S直接经肌肉免疫小鼠可诱导产生特异性体液和细胞免疫反应     

人核心蛋白聚糖真核表达载体的构建及鉴定

目的：构建人核心蛋白聚糖（DCN）真核表达载体,为进一步研究其生物学活性奠定基础。 方法：采用聚合酶链反应（PCR）扩增目的片段,PCR产物及真核表达载体pcDNA3分别双酶切后进行连接,并转化入大肠杆菌JM109中扩增以获得重组载体。 结果：PCR获得与预期大小一致的、约1 000 bp的特异性DNA片段,PCR产物与表达载体经双酶切后连接,构建重组载体pcDNA-dec,经双酶切鉴定及测序证实,人DCN基因cDNA片段正确插入真核表达载体中。结论：成功构建人DCN真核表达载体pcDNA-dec。     

人分泌型内皮抑素质粒的构建及序列测定

目的：旨在获得人内皮抑素(endostatin)分泌型基因片段。方法：合成含信号肽的上游引物，用聚合酶链反应技术克隆人分泌型内皮抑素基因，10g／L琼脂糖凝胶电泳后回收，将其重组入PGEM-T载体，双脱氧末端终止法测定其核苷酸序列。结果：经Genbank分析证实，所获得的645bp基因片段序列属于信号肽及人内皮抑素功能区段基因，翻译为蛋白质序列正确。结论：本研究为应用内皮抑素基因进行肿瘤的抗血管生成治疗奠定了基础。     

人p58.2重组逆转录病毒载体的构建及稳定包装细胞系的鉴定

目的　构建并鉴定携带人p5 8 2基因的重组逆转录病毒载体及稳定的包装细胞系。方法　用PCR技术从pSPORT1-p5 8 2扩增出编码p5 8 2N端 1～ 3 45个氨基酸的全长基因 ,定向克隆入逆转录病毒载体pMSCVneo中 ,酶切鉴定 ;脂质体法将重组逆转录病毒转入包装细胞系PT67,G418筛选建立稳定产病毒的细胞株。结果　双酶切鉴定 ,成功构建重组逆转录病毒载体 ;重组逆录病毒载体转入包装细胞 ,经G418筛选 ,形成了抗性克隆 ,并测得病毒滴度为 3×10 5cfu/ml,提示构建携带人p5 8 2基因的逆转录病毒载体及稳定的包装细胞系成功。结论　构建人p5 8 2基因的逆转录病毒载体可行 ,并且可望成为一种很好的对血液系统疾病进行基因治疗的方法     

HBV核心启动子部分缺失重组质粒的构建

目的　构建乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）核心启动子（ＣＰ）部分缺失的真核表达质粒。方法　利用线性化的、从ＣＰ上游顺 序开始且含完整转录单元的ＨＢＶ 基因克隆（Ｐ３．８Ｉ质粒）为工具,采用分子克隆、人工定点突变、ＰＣＲ－ＲＦＬＰ,鉴定和测 序分析等技术构建目的载体。结果　成功构建了ＨＢＶ全基因ＣＰ ２０／２１个ｂｐ缺失（ｎｔ １７４８／１７４７－１７６７）和ＣＰ２０／２１个ｂｐ 缺失＋１８９６热点变异的重组真核质粒表达质粒,并经ＰＣＲ－ＲＦＬＰ序列分析证实。结论　此重组真核表达质粒构建可为 体外进一步研究上述变异的生物学意义奠定基础。     

果蝇S2细胞中高表达荧光素酶重组质粒的构建及活性测定

目的：构建果蝇S2细胞中高表达荧光素酶的重组质粒。方法：用PCR方法扩增得到pac启动子的基因片段,经酶切亚克隆至pGL3—Basic的真核表达载体中,转染果蝇S2细胞,通过测定荧光素酶和β-半乳糖苷酶的活性计算荧光素酶的相对活性。结果：构建的重组质粒在S2细胞中荧光素酶的相对活性较pGL3—Control中增加了2．7万倍。结论：成功构建了果蝇S2细胞中高表达荧光素酶的重组质粒pGL3—pac。     

Construction and identification of eukaryotic eukaryotic expression plasmid pcdna3.1-bace and its transient expression in cells

Objective： To generate eukaryotic expression vector of pcDNA3.1-BACE and obtain its transient expression in COS-7 cells and high expression in the neuroblastoma SK-N-SH cells. Methods： A 1503 bp cDNA fragment was amplified from the total RNA of human neuroblastoma by RT-PCR method and cloned into plasmid pcDNA3.1. The vector was identified by digestion with restriction enzymes BamHI and XhoI and sequenced by Sanger-dideoxy：mediated chain termination. The expression of BACE gene was detected by immunocytochemistry method. Results： The results showed that the cDNA fragment included 1503 bp total coding region. The recombinant eukaryotic cell expression vector of pcDNA3.1-BACE was constructed successfully, and the sequence of insert was identical to the published sequence. The COS-7 cells and the neuroblastoma SK-N-SH cells transfected with the pcDNA3.1-BACE plasmid expressed high level of BACE protein in cytoplasm. Conclusion： The recombinant plasmid pcDNA3.1-BACE can provide very useful tool for researching the mason of Alzheimer＇s disease and lays the important foundation for preventing the AD laterly.