Rap1与胃癌多药耐药的相关性

目的探讨Rap1与胃癌多药耐药的相关性。方法采用免疫荧光技术和Westernblot方法检测胃癌细胞SGC7901、多药耐药胃癌细胞SGC7901／VCR和SGC7901／ADR中Rapl的表达。结果胃癌细胞SGC7901、多药耐药胃癌细胞SGC7901／VCR和SGC7901／ADR胞核和胞浆均有Rap1阳性染色,多药耐药胃癌细胞中Rap1表达明显高于亲本细胞SGC7901。结论Rap1与胃癌多药耐药相关。     

TSG101 siRNA表达载体的构建及其作用研究

目的构建TSG101（tumor susceptibility gene 101，TSG101）小于扰RNA（TSG101 siRNA）的真核表达载体并鉴定，初步研究其与胃癌多药耐药的相关性。方法根据小于扰RNA的设计原则由计算机软件辅助设计TSG101的靶序列，应用DNA重组技术将目的序列克隆入小干扰RNA的表达载体；将TSG101 siRNA的真核表达载体转染胃癌长春新碱（VCR）耐药细胞SGC7901／VCR，通过Western blot鉴定TSG101 siRNA的抑制效率；以MTT实验检测细胞生长曲线和对VCR、阿霉素（ADM）的药物敏感性。结果所构建的载体经酶切后释放出预期大小的片断并经测序证实；TSG101 siRNA真核表达载体瞬时转染胃癌耐药细胞SGC7901／VCR后，发现TSG101的表达被显著抑制；细胞生长减慢，且对VCR、ADR的敏感性增加。结论成功构建了TSG101 siRNA的真核表达载体，并初步提示其参与了胃癌的多药耐药，为下一步工作奠定了基础。     

端粒重复序列结合因子2真核表达载体的构建及表达

目的:构建端粒重复序列结合因子2(TRF2)真核表达载体,观察其在胃癌细胞中的表达.方法:EcoRI,HindⅢ双酶切AdTRF2质粒,胶回收1 600 bp小片段,连接入pcDNA3.1载体.经双酶切及测序鉴定后转染SGC7901细胞,空载体质粒转染SGC7901细胞为对照.G418选择培养液培养2个月,选取转染组及对照组细胞克隆.①细胞用阿霉素处理6 h后Western blot法检测TRF2表达.②MTT法检测转染对细胞生长增殖速度的影响.结果:成功构建TRF2真核表达载体,转染后SGC7901细胞TRF2表达明显增高,对细胞的生长增殖速度无明显影响(P＞0.05).结论:成功构建TRF2真核表达载体及稳定转染细胞株,为进一步研究TRF2功能奠定了基础.     

RPL23编码基因的克隆及其正反义核酸转染胃癌细胞

目的 扩增人核糖体蛋白L23（RPL23）编码基因序列，构建其正、反义真核表达载体，分别转染胃癌细胞SGC7901及胃癌长春新碱耐药细胞SGC7901／VCR，以进一步研究RPL23基因与胃癌多药耐药的关系。方法 按文献报道的RPL23核苷酸序列设计合成PCR引物，利用总RNA抽取试剂盒从人胃癌长春新碱耐药细胞SGC7901／VCR中提取细胞总RNA，反转录合成cDNA，再用PCR方法扩增目的基因序列。PCR产物经DNA序列测定证实后，通过双酶切，将所获目的基因分别按正、反两个方向定向克隆入真核表达载体pcDNA3.1( )K ，酶切电泳鉴定。采用脂质体介导的方法将pcDNA3.1( )-RPL23转染SGC7901细胞，pcDNA3.1（＋）－anRPL23转染SGC7901／VCR细胞，经G418筛选后，随机挑选细胞克隆。通过斑点杂交检测正、反义转染后RPL23 mRNA表达水平的变化。结果 应用RT－PCR反应扩增获得大小约0.5kb的特异性片段。经DNA序列分析，证实与文献报道的人RPL23编码区序列一致。重组正义真核表达载体pcDNA3.1( )-RPL23双酶切产生大小约5.4kb,0.5kb的片段；重组反义真核表达载体pcDNA3.1( )-anRPL23双酶切产生大小约5.4kb,0.5kb的片段，均与预期结果相符。转染细胞经筛选后，随机挑选，扩增了2个细胞克隆，斑点杂交提示反义转染后RPL23mRNA表达水平显著下降，而正义转染后其表达水平明显增加。结论 成功克隆了人RPL23编码基因序列，并构建了其正、反义真核表达载体。在胃癌细胞系SGC7901及长春新碱耐药细胞SGC7901／VCR中得到稳定转染细胞株，正义转染细胞中RPL23mRNA表达明显增加，反义转染细胞中表达明显受抑。     

朊蛋白在耐阿霉素胃癌细胞系SGC7901/ADR中的过表达及其意义

目的 探讨朊蛋白(PrP)在耐阿霉素胃癌细胞系SGC7901/ADR中过表达及其与胃癌多药耐药性的相关性。方法(1)利用Northern印迹和Western印迹分别从RNA 水平和蛋白质水平检测朊蛋白在胃癌耐药细胞系SGC7901/ADR和SGC7901/VCR及其亲本细胞SGC7901中的表达;(2)借助DNA重组技术构建朊蛋白基因的正反义真核表达载体;(3)通过电穿孔方法将正反义真核表达载体分别转入SGC7901和SGC7901/ADR细胞;(4)以流式细胞仪检测瞬时转染细胞中的阿霉素蓄积和潴留。结果(1)Northern印迹和Western印迹结果提示朊蛋白在SGC7901/ADR和SGC7901/VCR中的表达显著高于其在SGC7901中的表达;(2)将正反义真核表达载体转入SGC7901(命名为PS)和SGC7901/ADR(命名为PA)中,PCDNA3.1空载体转入SGC7901(命名为BS)和SGC7901/ADR(命名为BA);转染48h后检测转染细胞的平均阿霉素荧光强度,阿霉素蓄积BS为8.9±0.7,PS为6.6±0.3,BA为5.5±0.7,PA7.5±0.6,阿霉素潴留BS为8.0±0.7,PS为5.9±0.5,BA5.1±0.7,PA为7.1±0.5,PS与BS相比两组均为P<0.01,BA与BA相比均为P<0.01表达,并对胃癌细胞,具有统计学意义。结论 朊蛋白在胃癌耐药细胞系SGC7901/ADR和SGC7901/VCR中高表达并对胃癌细胞的药物蓄积有影响。     

缺氧状态下丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶1对缺氧诱导因子1α和p300在体外结合的影响

目的探讨丝裂原活化的蛋白激酶磷酸酶1（MKP-1）对缺氧诱导因子1α（HIF-1α）和p300在体外结合的影响。方法采用DNA重组技术构建含HIF-1α反式激活域（TAD）的原核表达载体并进行原核表达;利用谷胱甘肽-琼脂糖珠子纯化原核表达的谷胱甘肽S转移酶（GST）融合蛋白;利用脂质体将含MKP-1的正义真核表达载体和空载体转入SGC7901细胞;借助Pull-down试验和Western印迹检测MKP-1或PD98059对HIF-1d与协同激活因子p300在体外结合的影响;Western印迹检测MKP-1对p300表达的影响。结果（1）成功构建了含HIF-1αTAD的原核表达载体,使含HIF-1αTAD的GST融合蛋白在BL-21大肠杆菌中得到表达。（2）利用谷胱甘肽-琼脂糖珠子纯化得到了含HIF-1αTAD的GST融合蛋白。（3）缺氧12h后,GST融合蛋白HIF-1αTAD从PD98059处理细胞裂解液中洗脱的p300量低于从二甲基亚砜（DMSO）处理细胞和SGC7901细胞裂解液中洗脱的p300。（4）分别将MKP-1正义真核表达载体和pcDNA3．1空载体瞬时转入SGC7901细胞;缺氧12h后,GST融合蛋白从MKP-1正义真核表达载体转染细胞（SGC7901-MKP-1）裂解液中洗脱的p300的量低于从空载体转染细胞（SGC7901-空载体）和未转染细胞（SGC7901）裂解液中洗脱的p300。（5）缺氧12h后,p300的表达量在SGC7901-MKP-1、SGC7901-空载体和SGC79013组细胞中无变化。结论MKP-1抑制HIF-1α和p300在体外结合。     

HO-1siRNA表达载体的构建及其稳定转染SGC7901细胞系的建立

目的:构建携带绿色荧光蛋白的HO-1基因siRNA表达载体,通过将载体转染入胃癌细胞株SGC7901筛选稳定转染细胞株.方法:参照前期工作,构建可用于筛选阳性克隆并带有绿色荧光的HO-1基因siRNA表达载体,采用脂质体转染法将载体转入SGC7901细胞中,并用G418进行阳性克隆筛选,获得稳定转染细胞系.结果:经酶切和测序验证,证实表达载体构建成功,将HO-1 siRNA表达载体转入SGC7901后,通过G418筛选获得稳定转染细胞系,经检测HO-1的表达水平明显低于为未转染的细胞.结论:本实验成功地构建了HO-1基因siRNA表达载体,筛选出HO-1基因沉默的稳定转染胃癌细胞系,为今后研究HO-1基因的作用机制提供了实验基础.     

RNA干扰靶向抑制胃癌SGC7901细胞COX-2基因和蛋白表达的研究

目的 利用RNAi技术,以胃癌SGC7901细胞COX-2作为靶点,建立有效的RNA干扰方法,为胃癌及其复发和转移提供基因治疗的新方法.方法 设计并合成6条COX-2 siRNA和1条阴性对照siRNA,用3种不同的转染试剂分别转染胃癌SGC7901细胞,荧光定量PCR和Western blotting检测胃癌SGC7901细胞中COX-2基因和蛋白的表达.结果 TOPtranfection能够有效介导报告基因DNA(pcDNA/lacZ)转染SGC7901细胞,细胞转染率为56.0%,明显优于其它两种转染试剂,转染的pcDNA/lacZ-siRNA对报告基因产生显著抑制;TOPtranfection介导的COX-2 siRNA有效抑制了胃癌细胞COX-2 mRNA表达,与对照组相比抑制效率达90%以上,最高达98.3%,同时抑制胃癌SGC7901细胞COX-2蛋白表达71.5%.结论 TOPtranfec-tion能够有效介导COX-2siRNA转染SGC7901细胞;靶向COX-2的RNA干扰能有效抑制胃癌细胞中COX-2基因和蛋白的表达,为胃癌的治疗以及抑制胃癌复发和转移提供基因治疗新的靶点和方法.     

人端粒酶蛋白催化亚单位反义基因转染对胃癌细胞恶性表型的逆转作用

目的 探讨人端粒酶蛋白催化亚单位（hTRT）反义基因治疗对胃癌细胞恶性表型的逆转作用。方法 采用基因重组技术,构建hTRT正比、反义真核表达载体,采用脂质体法导入SGC－790细胞、反义真核表达载体,并导入SGC－790胃癌细胞株中,获得稳定表达正、反义基因的细胞系7901－S、7901－AS1和7901－AS2。7901－AS1和7901－AS2出现显著生长抑制现象,端粒酶活性明显下降,细胞凋亡增加,异型性减小,G0／G1期细胞增加,S和G2M期细胞减少,增殖指数减小,软琼脂中克隆形成,裸鼠体内成瘤消失。结论 hTRT反义基因治疗可以明显抑制SGC－7901细胞的增殖,部分逆转肿瘤细胞的恶性表型,其机制可能主要是通过诱导细胞分化而非诱导细胞凋亡途径实现的,提示hTRT基因可以作为肿瘤治疗的靶基因。     

葡萄糖神经酰胺合成酶siRNA表达载体的构建

目的:构建针对葡萄糖神经酰胺合成酶(GCS)mRNA的siRNA表达载体,并观察其对转染细胞中GCS表达的影响.方法:根据人GCS mRNA编码序列,设计并合成3对针对GCS的发卡状RNA的寡核苷酸,各64个碱基,退火后插入pSUPER EGFP载体重组构建RNAi质粒,进行双酶切及测序鉴定.重组质粒用脂质体包裹转染入SGC7901/VCR细胞,采用RT-PCR检测GCS mRNA表达水平的变化.结果:重组构建的载体经酶切鉴定与测序分析,显示特定位点靶序列与设计序列完全一致.转染SGC7901/VCR细胞后,GCS mRNA表达明显降低.结论:GCSsiRNA表达载体构建成功,并可有效抑制人胃癌耐药SGC7901/VCR细胞中GCS的表达,为后续研究及肿瘤的基因治疗奠定了基础.     

人胃癌SGC7901/VCR裸鼠移植瘤模型的建立及耐药性检测

目的建立人胃癌SGC7901/VCR裸鼠移植瘤模型,并检测其多药耐药性,为进行肿瘤多药耐药逆转剂的筛选和体内实验研究奠定基础。方法采用皮下接种法建立裸鼠移植瘤模型;观察裸鼠生长状况;移植瘤生长情况;进行瘤重及瘤体积比较;移植瘤P-gp耐药蛋白表达;原代培养细胞,检测移植瘤模型多药耐药性。结果人胃癌SGC7901/VCR裸鼠移植瘤组织病理学检查为低分化腺癌,移植瘤组织原代细胞培养后,P-gp表达强阳性+++,具有多药耐药性,模型建立成功。结论成功建立了人胃癌SGC7901/VCR裸鼠多药耐药移植瘤模型,为胃癌耐药研究提供了较理想的动物模型。     

人bax真核表达载体的构建及其在人胃癌耐药细胞系SGC7901/VCR中的表达

目的：构建人ｂａｘ真核表达载体,经脂质体导入人胃癌耐药细胞ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ,并检测ｂａｘ基因在转导株的表达．方法：采用分子克隆技术将ｂａｘ基因插入真核表达载体ｐＢＫ－ＣＭＶ的多克隆位点之间,以脂质体介导法将目的基因导入受体细胞ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ,Ｇ４１８筛选克隆细胞,Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测ｂａｘ基因的表达．结果：成功地构建了重组质粒ｐＢＫ－ｂａｘ,将之转入细胞后,经Ｇ４１８筛选３０ｄ获得了稳定的细胞克隆,即ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ－ｂａｘｃｅｌｓ．Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹证实了ｂａｘ基因转导株具有明显的Ｂａｘ蛋白表达．结论：ｂａｘ真核表达载体的构建,为胃癌耐药的临床治疗打下了基础．     

Upregulation of drug sensitivity of multidrug-resistant SGC79 01/VCR human gastric cancer cells by bax gene transduction

Objective To investigate the role of bax in a vincristine （VCR）-induced multidrug-resi stant （MDR） human gastric cancer cell line, SGC7901/VCR, in which the Bax prot ein expression level was significantly lower compared with that in parent cells .Methods A bax eukaryotic expression vector was constructed and transfected into SGC7901/ VCR cells by lipofectamine, and resistant clones were selected by G418. Western blotting detected Bax expression in transfectants. Tetrazolium blue (MTT) assa y evaluated the differences in drug sensitivity and cell cycle changes of transf ectants were analyzed using flowcytometry (FCM). Results The bax eukaryotic expression vector was constructed and transfected into SGC790 1/VCR cells. Through G418 selection, resistant clones were obtained. Western b lotting demonstrated that the expression of Bax protein was markedly increased i n bax transduced cells. These cells were more sensitive to adriamycin (ADR) and VCR than mock vector transducted cells. Moreover, bax transfection enhanced AD R-induced apoptosis and VCR-induced G(2)/M phase arrest of SGC7901/VCR cells. Conclusion Bax was involved in the MDR of SGC7901/VCR cells.     

ACTN4对胃癌细胞侵袭转移的影响

目的 研究α-辅肌动蛋白（alpha-actinin-4,ACTN4）在胃癌SGC7901细胞及正常胃黏膜上皮RGM-1细胞中的表达及对胃癌SGC7901细胞侵袭和转移的影响。方法 通过qRT-PCR技术及蛋白印迹技术检测ACTN4在胃癌SGC7901细胞及RGM-1正常胃黏膜上皮细胞中的表达;利用RNAi技术敲低SGC7901细胞中的ACTN4表达,并应用qRT-PCR及蛋白印迹技术检测SGC7901细胞中ACTN4的沉默效果;通过Transwell实验检测细胞侵袭及转移能力的变化。结果 ACTN4在胃癌SGC7901细胞中明显高表达;ACTN4-siRNA可有效敲低SGC7901细胞中ACTN4的表达,敲低ACTN4的表达可以明显降低胃癌SGC7901细胞的侵袭转移能力。结论 ACTN4在胃癌细胞发生侵袭转移中发挥着重要作用。     

miR-16通过调节Bcl-2的表达活性影响胃癌细胞的生物学行为

目的 探讨miR-16调节Bcl-2的表达活性影响胃癌细胞生物学行为的机制。 方法 qPCR检测miR-16在胃癌SGC7901细胞中的转染效率,CCK-8检测miR-16对SGC7901细胞活性的影响,划痕实验检测miR-16对SGC7901细胞迁移能力的影响,流式细胞仪检测miR-16对SGC7901细胞凋亡的影响,Western blotting检测miR-16对Bcl-2蛋白表达的影响以及对凋亡相关蛋白表达的影响。结果 通过miR-16 mimic使miR-16在胃癌SGC7901细胞中过表达后,其细胞活性、迁移能力明显下降,而细胞凋亡率显著上升,同时相关凋亡蛋白表达也增高;Bcl-2 siRNA与miR-16 inhibitor共转染后,能改变miR-16对SGC7901细胞迁移能力、细胞活性和凋亡的影响。结论 miR-16通过调节Bcl-2的表达,抑制细胞活性和迁移能力,诱导胃癌SGC7901细胞凋亡。