RNA干扰下调NF-κB p65基因表达诱导胰腺癌细胞株PANC-1的凋亡

目的运用RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术下调胰腺癌细胞株PANC-1中NF-κB p65基因表达,并评价其对肿瘤细胞凋亡的影响。方法利用阳离子脂质体Lipofectamine^TM 2000将化学合成的人NF-κB p65的小干扰RNA（small interference RNA,siRNA）转染入胰腺癌细胞株PANC-1中。采用RT-PCR法测定细胞内NF-κB p65mRNA的表达,酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测NF-κB亚单位p65的DNA结合活性的改变,运用Hoechst33258核染色、流式细胞仪和透射电子显微镜检测p65基因表达下调对PANC-1细胞凋亡的影响。结果化学合成的人NF-κB p65 siRNA能有效地抑制PANC-1细胞中NF-κB p65mRNA的表达（P〈0．01）,同时ELISA结果显示,RelA siRNA组的p65亚单位与DNA结合活性明显低于对照组（P〈0．05）。Hoechst33258核染色、流式细胞仪和透射电子显微镜检测发现下调p65基因表达能够诱导PANC-1细胞的凋亡。结论体外实验初步证明了NF-κB p65基因在胰腺癌细胞凋亡调控方面扮演重要角色．通过沉默其表达可诱导胰腺癌细胞的凋亡．     

Survivin 抑制人胆管癌细胞凋亡相关信号通路的实验研究

目的:探讨survivin基因对人胆管癌细胞凋亡信号通路的调节机制.方法:构建针对survivin基因的siRNA和对照siRNA,将QBC939人胆管癌细胞分为3组,分别为siRNA-survivin转染组,对照siRNA转染组和未转染组.转染后,首先用Western blot检测未转染QBC939细胞和QBC939/siRNA(-)细胞及QBC939/siRNA(+)细胞中survivin的表达,验证干扰效果,继而分别用流式细胞仪,激酶活性测定和Western blot检测以上3种状态的QBC939细胞的凋亡情况,caspase-3的活性和caspase-3,caspase-9及procaspase-9凋亡信号分子的表达.结果:QBC939/siRNA(+)细胞survivin蛋白表达量明显低于未转染的QBC939细胞(P＜0.05),而QBC939/siRNA(-)细胞survivin蛋白表达量无明显改变(P＞0.05).与未转染的QBC939细胞比较,QBC939/siRNA(+)细胞凋亡明显增加,caspase-3活性明显升高,caspase-3和caspase-9表达明显上调,而procaspase-9表达降低(均P＜0.05);上述指标在QBC939/siRNA(-)细胞与未转染的QBC939细胞间的差异无统计学意义(均P＞0.05).结论:survivin基因可能通过促进procaspase-9的活化阻止caspase-3和caspase-9的激活,从而抑制胆管癌细胞的凋亡.     

RNA干扰降低环氧化酶2基因表达对人胆管癌QBC939细胞的体外作用

目的研究小干扰RNA（siRNA）降低环氧化酶2（COX-2）基因对胆管癌QBC939细胞凋亡及凋亡蛋白caspase-3蛋白表达的影响。方法采用RNA干扰的方法,将胆管癌细胞株QBC939细胞分为4组：COX-2 siRNA干预组、阴性对照siRNA组、空脂质体、空白对照组。将COX-2 siRNA转染入QBC939细胞;流式细胞仪检测siRNA降低COX-2基因表达对凋亡的作用,WesternBlot法检测siRNA降低COX-2基因表达对caspase-3表达变化的影响。结果 RNA干扰后QBC939细胞COX-2表达下降至空白对照组的42%,流式细胞仪检测结果显示COX-2 siRNA干预组细胞的凋亡率以及凋亡蛋白caspase-3的表达明显高于其他3个对照组。结论 RNA干扰可抑制细胞COX-2蛋白的表达,促使胆管癌QBC939细胞的凋亡,caspase-3途径可能是其调控通路之     

NF-κB P65亚基siRNA增强吉西他宾诱导胰腺癌细胞凋亡作用的实验研究

目的 探讨NF-κB P65亚基siRNA(NF-κB P65 siRNA)在体内外增强吉西他宾诱导胰腺癌细胞凋亡的作用及机制.方法 培养人胰腺癌细胞株BxPC-3和PANC-1,分为空白对照组、阴性干扰序列对照组、吉西他宾组、NF-κB P65 siRNA组和联合治疗组.MTT方法检测细胞增殖情况;Western blot方法检测NF-κB P65及凋亡相关蛋白的表达水平;Annexin V-FITC/PI染色流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测胰腺癌细胞凋亡情况;电泳凝胶迁移实验检测NF-κB的DNA结合活性.BxPC-3接种裸鼠皮下建立胰腺癌移植瘤模型.治疗后监测肿瘤体积;TUNEL染色检测移植瘤组织细胞凋亡指数.结果 转染后72 h,与其他组相比,联合治疗组显著降低了细胞活力指数(P<0.05),下调了Bel-2和proeaspase-3的表达水平,同时上调了Bax的表达水平;流式细胞仪检测结果显示,联合治疗组细胞凋亡率高于其他组(P<0.05);EMSA实验结果证实,NF-κB P65 siRNA组和联合治疗组NF-κB的DNA结合活性低于对照组(P<0.05).联合治疗能够通过诱导凋亡而抑制裸鼠移植瘤生长(P<0.01).结论 NF-κB P65 siRNA可以通过抑制NF-κB的DNA结合活性,调控凋亡相关蛋白的表达水平,激活线粒体凋亡途径,从而增强吉西他宾对胰腺癌细胞的促凋亡作用.     

RNA干扰诱导型一氧化氮合酶基因表达对人胆管癌细胞生长的影响

目的:探讨RNA干扰诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因的表达对人胆管癌细胞生长的影响。方法:针对iNOS设计并合成3种iNOS-siRNA序列(siRNA1、siRNA2、siRNA3)及阴性对照siRNA序列后,分别转染人胆管癌细胞QBC939细胞,用荧光显微镜下观察转染效率,通过iNOS mRNA与蛋白的变化分析干扰效果,选择干扰效果最为明显的iNOS-siRNA序列,观察其干扰后QBC939细胞增殖、细胞周期及细胞凋亡的变化。实验以无处理的QBC939细胞为空白对照。结果:合成的3种iNOS-siRNA序列均可有效转染人胆管癌QBC939细胞,且转染后均能明显降低QBC939细胞中iNOS mRNA与蛋白的表达(均P0.05),其中siRNA2对iNOS的抑制作用最为明显,阴性对照siRNA序列对QBC939细胞中iNOS mRNA与蛋白的表达无明显影响(均P0.05)。转染siRNA2后,QBC939细胞增值明显降低、出现明显的G0/G1期阻滞、凋亡率明显增加(均P0.05);转染阴性对照siRNA序列的QBC939细胞无上述改变(均P0.05)。结论:RNA干扰能有效降低iNOS基因在胆管癌细胞中的表达,从而抑制胆管癌细胞的增殖,并促进其凋亡。     

脆性组氨酸三联体基因对胆管癌细胞凋亡的影响

目的 观察脆性组氨酸三联体(FHIT)基因对胆管癌细胞株QBC939凋亡的影响,探讨FHIT基因对细胞周期蛋白Cyclin D1的调控作用.方法 通过构建重组人FHIT真核表达质粒转染QBC939细胞,应用流式细胞仪检测转染前后细胞凋亡的变化,并通过荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测胆管癌细胞Cyclin D1表达的变化.结果 成功构建出重组人FHIT真核表达质粒并转染入QBC939细胞,转染后QBC939细胞的凋亡率明显增高(25.8%比30.9%比55.4%,P<0.05);并且Cyclin D1 mRNA表达下降至原细胞株的0.03倍,该基因蛋白质的表达也明显下降(0.33±0.02对比0.33±0.01比0.14±0.02,P<0.05).结论 FHIT基因可以促进QBC939细胞凋亡,并能下调Cyclin D1基因的表达.     

华蟾素对人胆管癌细胞系QBC939的作用

目的：探讨华蟾素对人胆管癌细胞株QBC939的抑制作用及可能的作用机制。方法：流式细胞仪检测华蟾素对QBC939细胞凋亡的作用，RT—PCR法研究华蟾素对人胆管癌细胞株QBC939Fas及caspase-3mRNA表达变化的影响。结果：不同浓度华蟾素作用于QBC939细胞48h后，流式细胞仪分析显示，凋亡细胞明显增多，与对照组相比有显著性（P〈0．001）。RT—PCR结果显示：leas、caspase-3mRNA表达实验组与对照组相比增强（P〈0．001）。结论：华蟾素作用于人胆管癌细胞株QBC939，促进其细胞凋亡，而这一作用的实现可能与Fas及caspase-3mRNA表达的上调有关。     

尼美舒利对胆管癌QBC939细胞增殖的抑制作用

目的研究选择性环氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）抑制剂尼美舒利对人胆管癌细胞系QBC939细胞增殖的抑制作用。方法应用MTT比色法观察尼美舒利对QBC939细胞增殖的影响，细胞凋亡采用透射电镜及流式细胞仪检测，应用免疫组化法检测尼美舒利对QBC939细胞COX-2及增殖细胞核抗原（PCNA）蛋白表达的影响。结果尼美舒利呈时间、剂量依赖性抑制QBC939细胞的增殖，降低QBC939细胞COX-2和PCNA的表达，流式细胞仪检测结果显示，随药物浓度增加，细胞凋亡率显著增加，透射电镜下可见典型的细胞凋亡形态学改变。结论尼美舒利显著抑制QBC939细胞的增殖，诱导其凋亡，且呈时间、剂量依赖性，其机理可能与其下调细胞内COX-2蛋白表达有关。     

尼美舒利对胆管癌QBC939细胞增殖与凋亡的调节

目的研究选择性环氧合酶-2（cyclooxygenase-2,COX-2）抑制剂尼美舒利对人胆管癌细胞系QBC939增殖和凋亡的影响.方法应用MTT比色法观察尼美舒利对人胆管癌细胞系QBC939增殖的影响,细胞凋亡采用透射电镜及流式细胞仪检测,应用免疫组化、RT-PCR检测尼美舒利对凋亡相关基因表达的影响.结果尼美舒利呈时间、剂量依赖性抑制胆管癌细胞增殖,高浓度（200 μmol/L）尼美舒利不仅抑制胆管癌细胞增殖,而且诱导其凋亡,流式细胞仪研究显示,随药物浓度增加,细胞凋亡率显著增加,透射电镜下可见典型的细胞凋亡形态学改变：细胞核染色质致密浓缩,凋亡小体形成等,免疫组化和RT-PCR测定显示尼美舒利显著下调bcl-2、survivin表达,而bax表达上调.结论尼美舒利显著抑制QBC939细胞增殖,诱导其凋亡,且呈时间、剂量依赖性,bcl-2、bax、survivin等凋亡相关基因可能参与了尼美舒利诱导的QBC939细胞凋亡过程.     

IκBα突变体对激素难治性前列腺癌细胞放疗敏感性的影响

目的:探讨转染IκBα突变体(IκBαM)基因对激素难治性前列腺癌放疗敏感性的影响.方法:将IκBαM基因转染入激素难治性前列腺癌PC 3M细胞系,采用Western blot法检测癌细胞IκBαM基因表达.X射线照射后,采用MTT比色法检测癌细胞体外生长活性;采用Annexin V-FITC和碘化吡啶双染色流式细胞仪法检测癌细胞凋亡率;采用NF-κB DNA结合ELISA检测癌细胞核内NF-κB活性.结果:Western blot证实转染IκBαM基因的PC-3M细胞表达高水平IκBαM蛋白.采用12 Gy X射线照射后,pcDNA 3.1/IκBαM转染组PC3M细胞生长活性较未转染组明显减弱;而其细胞凋亡率显著高于未转染组细胞.与未转染组相比,pcDNA 3.1/IκBαM转染组细胞核内NF-κB DNA结合活性降低.结论:IκBαM能阻断放疗引起的激素难治性前列腺癌细胞NF-κB活化,增强放疗对癌细胞的诱导凋亡作用.     

PTTG对胆管癌细胞生长和5-FU敏感性影响的研究

目的探讨抑制垂体瘤转化基因(PTTG)表达后胆管癌细胞体外生长的变化及其对5-FU化疗敏感性的影响。方法将反义PTTG真核表达载体pcDNA3.1-PTTGas和空白载体pcDNA3.1(+)转染入胆管癌细胞株QBC939中,筛选获得稳定表达株tQBC939(PTTG-)和tQBC939(pcDNA3.1),并设立未转染的QBC939细胞对照组,绘制细胞生长曲线,以MTT法检测细胞增殖力的变化,流式细胞仪检测细胞周期的比例变化,并采用5-FU处理细胞后,以MTT检测3组细胞的生长抑制率,计算IC50值,流式细胞仪和Hoechst染色法检测各组细胞凋亡情况。结果 tQBC939(PTTG-)组与tQBC939(pcD-NA3.1)组和QBC939组比较,前者生长较为迅速,S期细胞比例增多,G2/M期细胞比例减少(P0.05),增殖指数较高(P0.05);经5-FU处理后,tQBC939(PTTG-)的IC50值明显低于tQBC939(pcD-NA3.1)和QBC939细胞(P0.05),细胞凋亡增多。结论转染PTTG反义DNA可增强胆管癌细胞的增殖力和对5-FU化疗的敏感性。     

E2F1的siRNA真核表达载体转染对胆管癌细胞的作用

目的:探讨E2F1蛋白信号的转导通路对胆管癌细胞凋亡的影响中的作用。方法:根据E2F1基因cDNA序列，设计针对目的基因的4个siRNA靶序列，将其插入U6启动子下游，克隆到真核表达载体pGsensil中，通过酶切鉴定和DNA测序鉴定。采用脂质体介导法将构建好的4个siRNA表达载体分别转染于QBC939细胞中；以RT-PCR检测E2F1基因在转染前后的表达，流式细胞术检测转染后对细胞凋亡率的影响。结果:重组质粒酶切后呈线性化，酶切鉴定及DNA测序结果显示插入片断正确。转染48h后，4个siRNA表达载体均抑制了E2F1 mRNA的表达，沉默E2F1基因后细胞的凋亡率显著增加。结论:E2F1的siRNA真核表达载体转染QBC939细胞后，该表达载体具有抑制E2F1基因表达、促进细胞凋亡的功能，可以用于后续胆管癌的实验研究。     

Apr-1基因对胆管癌细胞QBC939细胞周期基因表达的影响

目的探讨Apr-1基因调控QBC939胆管癌细胞周期的机制。方法运用脂质体介导法将Apr-1基因转染胆管癌细胞系QBC939,建立稳定表达Apr-1基因的细胞模型(QBC939-Apr-1)。采用细胞周期基因芯片,观察转染Apr-1基因前后胆管癌细胞细胞周期相关基因表达的变化。结果转染Apr-1基因的QBC939-Apr-1细胞出现Apr-1 mRNA的表达,成功建立了稳定表达Apr-1基因的细胞模型。基因芯片检测结果发现:Skp2及UBE基因的表达水平明显上调,而CDC6,Cyclin H等25种基因的表达下降,其中MRE11A,CKS2,CDK8及CDC45等下调在3倍以上。结论过表达的Apr-1基因可诱导QBC939细胞多种细胞周期相关基因表达发生变化,为深入认识Apr-1基因参与调节细胞周期的机制提供了新的思路。     

外源性IL-6对胆管癌细胞的抗凋亡作用及其对Bcl-2 mRNA的调控

目的观察外源性IL-6对胆管癌细胞系QBC939凋亡及对Bcl-2 mRNA表达的影响。方法用MTT法检测外源性IL-6对胆管癌细胞QBC939的促增殖作用;通过annexin V/FITC和PI染色、流式细胞分析检测外源性IL-6对QBC939细胞凋亡的影响,RT-PCR测定Bcl-2 mRNA的表达。结果外源性IL-6能刺激QBC939细胞增殖,且QBC939细胞增殖与IL-6浓度呈正相关(r=1);外源性IL-6处理后,凋亡率显著低于对照组(P0.05),外源性IL-6处理细胞后Bcl-2 mRNA显著高于对照组(P0.05)。结论外源性IL-6在一定剂量范围内促进QBC939细胞生长,并抑制QBC939细胞凋亡;而此作用可能与上调Bcl-2 mRNA表达有关。     

WWOX表达对胆管癌QBC939细胞凋亡的影响及其机制

目的 探讨含有WW结构域的氧化还原酶基因(WWOX)表达对胆管癌QBC939细胞凋亡的影响及其作用机制.方法 用脂质体转染法将WWOX重组真核表达质粒转染QBC939细胞;采用荧光定量逆转录－聚合酶链反应(RT-PCR)和Westem blot法鉴定WWOX在QBC939细胞中的表达;流式细胞仪(FCM)法检测转染前后各细胞凋亡率的变化;JC-l染色法检测细胞线粒体膜电位(△Ψm)变化;荧光定量RT-PCR和Western blot法检测胆管癌细胞bcl-2表达的变化;将未转染和转染空质粒的细胞作为对照组接种到裸鼠皮下以检测荷瘤,TUNEL方法原位检测移植瘤的凋亡.结果 建立了稳定表达WWOX基因的QBC939/WWOX细胞株,mRNA及蛋白表达明显增加.FCM显示QBC939/WWOX组的细胞凋亡率明显增高[(1.24±0.35)％比(1.73±0.48)％比(21.40±2.35)％,P＜O.01],JC-l显示转染组的线粒体膜电位下降[(4.27±0.64)％比(4.96±0.52)％比(28.60±3.94)％,P＜O.01],bcl-2 mRNA及蛋白的表达均显著降低(P＜0.05).转染组的皮下肿瘤较对照组生长速度明显减慢(P＜0.05),TUNEL实验证实转染组的皮下肿瘤凋亡指数为(13.6±1.5)％,较对照组明显增高,差异有统计学意义(P＜0.O1).结论 WWOX基因能促进胆管癌细胞的凋亡,其机制可能与下调bcl-2的表达,激活线粒体凋亡通路有关.     

NVP-BEZ235体外对胆管癌细胞株QBC939增殖及凋亡的影响

目的研究NVP-BEZ235体外对胆管癌细胞株QBC939增殖及凋亡的影响。方法在体外培养人胆管癌细胞株QBC939,通过流式细胞仪检测NVP-BEZ235对QBC939凋亡的影响;MTT法检测NVP-BEZ235作用24小时、48小时和72小时对QBC939的增殖影响;Western blot分析NVP-BEZ235作用48小时对QBC939凋亡的影响(PARP),并检测分析相关信号通路蛋白Bcl-2、Akt、p-Akt、c-FLIPL和Mcl-1表达水平的变化。结果 NVP-BEZ235能抑制QBC939的增殖,抑制作用具有时间依赖性和浓度依赖性,同时能诱使细胞发生凋亡。NVP-BEZ235导致细胞内抗凋亡蛋白Mcl-1、c-FLIPL和Bcl-2表达下调,并降低p-Akt表达。结论 NVP-BEZ235抑制Akt的磷酸化,NVP-BEZ235通过PI3K/Akt通路下调Bcl-2、Mcl-1和c-FLIPL的表达,从而诱使QBC939出现凋亡,抑制QBC939增殖。     

过表达核心蛋白聚糖基因对胆管癌细胞周期及凋亡的影响

目的 观察过表达核心蛋白聚糖(DCN)基因对胆管癌细胞周期及凋亡的影响.方法 脂质体介导真核表达质粒pEGFP-DCN和空载体pEGFP-N1转入人胆管癌细胞株QBC939,Westernblot检测DCN蛋白的表达,实时定量反转录-聚合酶链反应(RT-qPCR)检测DCN mRNA的表达,克隆形成实验计算克隆形成率,噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖活力,流式细胞术检测细胞周期及凋亡.结果 RT-qPCR示过表达DCN相对空载体上调32.34倍;Western blot结果示过表达组DCN上调2.00倍.pEGFP-DCN转染组细胞克隆形成数[(210.9±19.3)个]显著低于空质粒转染组[(608.7±56.3)个],差异有统计学意义(P＜0.05).转染pEGFP-DCN细胞与空载体比较,细胞增殖能力显著降低,差异有统计学意义(P＜0.05).流式细胞周期检测显示,胆管癌细胞转染pEGFP-DCN后G1～ Go期细胞比例明显升高,而G2～S期细胞减少,细胞周期被阻滞在G1～Go期,凋亡分析转染pEGFP-DCN的QBC939细胞较转染空载体细胞凋亡显著增加,半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)-3明显增高,而B细胞淋巴瘤/白血病-2(bcl-2)的表达水平明显降低(0.787±0.068比1.276±0.157).结论 转染DCN能够显著抑制胆管癌细胞的增殖,明显促进胆管癌细胞凋亡,而DCN促进胆管细胞凋亡与上调Caspase-3和下调bcl-2蛋白相关.     

GABA对胆管癌细胞株QBC939增殖及凋亡的影响

目的观察γ-氨基丁酸(GABA)对胆管癌细胞QBC939增殖及凋亡的影响。方法采用MTT比色法观察GABA对人系胆管癌细胞QBC939增殖的作用,流式细胞术检测GABA对胆管癌细胞QBC939凋亡及其细胞周期的影响,放射免疫分析法检测cAMP含量。结果GABA抑制胆管癌细胞的增殖,呈剂量依赖性,流式细胞仪检测结果显示,随药物浓度增加,细胞凋亡率显著增加(4.8%增至28.03%,P<0.05),同时促进胆管癌细胞内cAMP含量的增加。结论GABA抑制胆管癌细胞QBC939增殖,诱导细胞凋亡,可能机制是通过受体后信息介导的。     

反义调控DNA甲基转移酶3b基因对人胆管癌细胞QBC939生长的影响

目的观察转染反义DNMT3b基因真核表达质粒对人胆管癌细胞QBC939生长的影响，初步探讨DNMT3b基因在胆管癌发生中的作用。方法构建反义DNMT3b基因真核表达质粒，用脂质体介导法将其转人人胆管癌细胞株QBC939；Western blot检测转染前后DNMT3b蛋白表达的变化；MTT法和软琼脂克隆形成试验观察细胞的生长增殖能力；流式细胞术观察细胞生长周期及凋亡率的变化。结果转染反义基因能使DNMT3b蛋白表达水平降低；转染反义DNMT3b基因不能抑制QBC939的生长曲线，对其软琼脂克隆形成率亦无影响（P=0．717）；转染反义DNMT3b基因不能改变QBC939的细胞周期和促进细胞凋亡（P=0．089）。结论转染反义DNMT3b基因真核表达质粒可下调DNMT3b在QBC939细胞中的表达水平，但对QBC939的生长和增殖无影响，也不能改变QBC939的细胞周期和促进细胞凋亡的发生。     

乙型肝炎病毒X基因转染人胆管癌细胞系及对端粒酶逆转录酶mRNA表达的影响

目的了解乙型肝炎病毒X(HBx)基因转染对胆管癌细胞端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA的表达影响,阐明HBx基因调节hTERT基因转录表达在胆管癌发生中的意义。方法体外培养胆管癌细胞QBC939,应用脂质体介导的基因转染技术,将含HBx基因的真核表达载体转染到胆管癌细胞中;转染36h后以增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)表达判定转染成功率,流式细胞仪检测转染率;收集细胞提取总RNA,逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)分析转染后细胞内hTERT mRNA的表达变化,并通过细胞免疫化学和Western Blotting了解转染后胆管癌细胞内有无HBx蛋白的表达。结果转染含HBx基因表达载体和空载体的QBC939转染率为29．6％;转染HBx基因后hTERT mRNA表达量比未经转染或转染空载体的hTERT mRNA表达量明显增加;细胞免疫组化和Western Blotting也证实只在转染了HBx基因的胆管癌细胞有HBx蛋白表达。结论HBx基因转染能上调胆管癌细胞hTERT mRNA的转录表达。