大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导分化的超微结构变化

背景：目前对骨髓间充质干细胞成骨诱导分化的超微结构观察的报道甚少。 目的：采用全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,成骨诱导并染色鉴定,利用电镜观察诱导前后细胞超微结构变化特点。 方法：全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞表面标记物,成骨染色鉴定向成骨方向诱导分化,扫描电镜及透射电镜观察成骨诱导前后细胞超微结构变化。 结果与结论：培养的第3代骨髓间充质干细胞纯度高、活力强,成骨诱导后的碱性磷酸酶活性染色、钙化结节染色均呈阳性。扫描电镜及透射电镜观察显示,经向成骨细胞诱导分化后,细胞形态铺展,不规则,其线粒体、粗面内质网、空泡明显增多,表明细胞功能活跃。     

体外诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化

背景：常规诱导方法诱导的细胞生长缓慢，数量少，使用生长因子可加快诱导速度，但生长因子价格昂贵限制了它的使用。 目的：验证未加生长因子的诱导液体外诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的效率。 设计、时间及地点：对比细胞学观察，于2007-07/2008-02在青岛大学医学院附属医院中心实验室完成。 材料：骨髓来源自体干细胞移植治疗糖尿病患者，均征得患者同意。 方法：采用密度梯度法分离培养骨髓间充质干细胞，应用0.1 μmol/L地塞米松、10 mmol/Lβ-甘油磷酸钠、50 μmol/L维生素C对第3代骨髓间充质干细胞进行诱导，同时设立对照组，不加入诱导剂。 主要观察指标：相差显微镜观察骨髓间充质干细胞的形态变化，诱导后经碱性磷酸酶染色和钙结节染色观察细胞形态变化。 结果：第3代骨髓间充质干细胞在相差显微镜下呈均匀分布生长，形态为长梭形。经成骨诱导7 d后培养细胞逐渐汇合呈铺路石状，随着诱导时间的延长，局部细胞呈重叠生长，间充质逐渐堆积、间充质中矿盐沉积，形成多个结节，并逐渐融合。培养14 d可形成倒置显微镜下可见的褐色点状矿化结节中心；培养21 d形成小片状矿化结节，von Kossa法测定可见钙结节呈黑色，碱性磷酸酶活性测定为阳性。 结论：骨髓间充质干细胞易诱导分化为成骨细胞，且增殖快，成骨能力强。     

抗坏血酸、β-甘油磷酸钠和地塞米松联合诱导大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化*

背景：成骨细胞来源于骨髓中的间质干细胞,但骨髓间充质干细胞经过高度扩增后,细胞群会出现生长速率减慢等变化,并出现没有分裂倾向的扁平状细胞。 目的：进一步验证在一定诱导条件下,体外分离培养的大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞的定向分化情况。 设计、时间及地点：细胞学体外对照观察,于2007-03/10在南方医科大学解剖实验室完成。 材料：4周龄SD大鼠3只,由南方医科大学实验动物中心提供。成骨诱导过程所使用的抗坏血酸、地塞米松、β-甘油磷酸钠为美国 Sigma公司产品。 方法：采用密度梯度离心+贴壁筛选法体外分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,融合后用EDTA及胰蛋白酶消化,按1∶3传代培养。取生长良好的第2代骨髓间充质干细胞,调整细胞数量为1×107 L-1,分为2组：对照组加入含体积分数为0.1胎牛血清的DMEM-LG培养基,诱导组加入成骨诱导液进行培养,成骨诱导液为含50 mg/L抗坏血酸、0.1 μmmol/L地塞米松、0.5 mmol/Lβ-甘油磷酸钠、体积分数为0.1胎牛血清的DMEM-LG培养基。 主要观察指标：骨髓间充质干细胞的生物学特性,成骨诱导前后细胞碱性磷酸酶活性,诱导后矿化结节的形成。 结果：刚接种的骨髓间充质干细胞呈圆形;原代培养24 h后大部分细胞贴壁生长,呈短梭形、三角形、多边形;72 h时贴壁细胞分裂增殖,逐渐呈长梭形;至第5天可见明显细胞集落形成;第9~10天细胞达80%以上融合;传代后细胞贴壁和增殖速度加快,呈有规则的方向性排列。与诱导前比较,骨髓间充质干细胞成骨诱导7 d后碱性磷酸酶活性明显提高（P < 0.05）。连续成骨诱导20 d后,诱导组可见多个散在分布的圆形不透明钙化结节,对照组未见矿化结节沉积。 结论：在抗坏血酸、β-甘油磷酸钠和地塞米松联合诱导下,大鼠骨髓间充质干细胞可定向分化为成骨细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外向成骨细胞分化培养的生物学特性

背景：骨髓间充质干细胞因取材方便、对机体损伤小,是目前最为合适的骨组织工程种子细胞,但其体外培养的具体方法及生物特性仍无定论。 目的：建立一种简单有效的骨髓间充质干细胞的体外培养及成骨诱导方法,并探讨其体外培养的生物学特点。 方法：采用贴壁法分离提纯Wistar大鼠骨髓间充质干细胞,传至第3代细胞后,分别在普通培养基(对照组)和成骨诱导培养基(实验组)中培养10 d,绘制细胞生长曲线。于培养第4,7,10,13,16天检测两组细胞碱性磷酸酶活性,并对细胞爬片行Von kossa染色。 结果与结论：采用贴壁法获得了均一性较好的骨髓间充质干细胞,对照组细胞生长速度明显快于实验组细胞。对照组细胞碱性磷酸酶活性明显低于实验组(P < 0.05)。实验组细胞Von kossa染色为阳性,对照组为阴性。说明贴壁筛选法是一种简单有效的骨髓间充质干细胞的分离纯化方法,骨髓间充质干细胞在体外可诱导分化为成骨细胞。     

骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分化的超微结构改变*

背景：目前尚缺乏骨髓间充质干细胞及其诱导分化后成骨细胞超微结构特点的观察。 目的：采用全骨髓培养-贴壁筛选法分离培养骨髓间充质干细胞,诱导其向成骨细胞方向分化,利用光镜和电镜观察诱导和未诱导分化细胞的细微和超微结构特点。 设计、时间及地点：观察实验,于2007-03/2008-04在河北医科大学人体解剖教研室和白求恩国际和平医院骨科完成。 材料：成年新西兰大白兔由白求恩国际和平医院实验动物中心提供。Hitachi S-3500N型扫描电镜和Hitachi-7500型透射电镜。 方法：从新西兰大白兔髂后上嵴处抽取骨髓。经原代及传代培养后,取部分第3代细胞加入诱导剂,诱导剂为10 mmol/L β-甘油磷酸钠,10-8 mmol/L地塞米松,50 mg/L维生素C。培养2周后,诱导和未加诱导的骨髓间充质干细胞进行碱性磷酸酶、骨形态发生蛋白和钙化结节检测。 主要观察指标：光镜观察骨髓间充质干细胞及其诱导分化后成骨细胞的一般形态学特征;电镜观察骨髓间充质干细胞和成骨细胞的超微结构特点。 结果：培养的第3代骨髓间充质干细胞,其碱性磷酸酶染色呈强阳性反应;钙化结节染色和骨形态发生蛋白免疫组织化学检测,均呈现阴性结果。经向成骨细胞诱导分化后,其碱性磷酸酶染色,钙化结节染色和骨形态发生蛋白免疫组织化学检测,均呈现阳性反应。光镜和扫描电镜观察显示,骨髓间充质干细胞大部分呈长梭形,少量呈星形;经向成骨细胞诱导分化后,细胞体积增大,更加饱满,似鱼群样排列。透射电镜观察显示,骨髓间充质干细胞的细胞器较丰富,向成骨细胞诱导分化后,其线粒体明显增多,出现较多的基质小泡、髓样体和空泡状结构。 结论：骨髓间充质干细胞成骨诱导分化后细胞的超微结构表现为胞浆中出现增多的基质小泡、髓样体和空泡状结构。     

骨髓间充质干细胞成骨方向诱导过程中的基因表达

背景：目前骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化演变中的基因表达模式尚不明确。 目的：观察骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分化过程中碱性磷酸酶、骨桥蛋白、Ⅰ型胶原、碱性成纤维细胞生长因子和骨钙素基因的表达情况,验证骨髓间充质干细胞是否向成骨细胞成熟分化。 方法：抽取2月龄新西兰大白兔股骨骨髓,全骨髓贴壁法培养获得骨髓间充质干细胞,用矿化诱导培养基(DMEM/F12、地塞米松1×10-8 mmol/L、β-磷酸甘油钠0.01 mol/L、维生素C 0.05 g/L)进行成骨诱导培养,用反转录-聚合酶链反应方法检测诱导培养后第一二代骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶、骨桥蛋白、Ⅰ型胶原、碱性成纤维细胞生长因子和骨钙素基因的表达情况,并对该骨髓间充质干细胞表面抗原CD44进行鉴定。 结果与结论：经矿化诱导培养基诱导培养后,第一二代骨髓间充质干细胞阶段性表达碱性磷酸酶、骨桥蛋白、Ⅰ型胶原、碱性成纤维细胞生长因子和骨钙素基因;第1代骨髓间充质干细胞抗原CD44阳性率达44.4%。提示兔骨髓间充质干细胞在体外矿化诱导培养中逐渐向成骨细胞分化,分别于诱导后第一二代细胞中阶段性顺序表达成骨细胞特异性基因碱性磷酸酶、骨桥蛋白、Ⅰ型胶原、碱性成纤维细胞生长因子和骨钙素,该细胞已具备成骨细胞特征,为揭示骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化过程中基因表达机制提供了实验依据。     

脐带间充质干细胞向成骨细胞分化的潜能

背景：人脐带间充质干细胞含量丰富,较为原始,分化能力强,免疫原性低,是细胞治疗的理想靶细胞。 目的：体外分离培养脐带间充质干细胞并将其定向诱导为成骨细胞。 方法：无菌条件下培养脐带间充质干细胞,分为诱导组和对照组,诱导组用成骨诱导液处理、对照组为干细胞培养液处理。倒置光显微镜观察细胞形态,MTT法测细胞增殖,荧光双染法检测细胞活力,流式细胞仪检测细胞周期与细胞表面标记。诱导后：检测碱性磷酸酶,Von Kossa染色分析钙盐沉积,RT-PCR检测骨桥蛋白基因、碱性磷酸酶、骨唾液蛋白mRNA的表达。 结果与结论：传代细胞形态稳定、活力好,高标达CD44。诱导后von Kossa染色表现为阳性。碱性磷酸酶活性诱导组比对照组高(P < 0.05),不同时间点比较21 d最高(P < 0.05)。RT-PCR显示：诱导组21,28d 碱性磷酸酶mRNA表达均较与对照组增强(P < 0.05)。诱导组有骨唾液蛋白和骨桥蛋白基因mRNA表达。提示,人脐带间充质干细胞能够定向分化为成骨细胞。     

兔骨髓间充质干细胞的体外培养及多向诱导分化

髓间充质干细胞的分离获取及培养鉴定一直以来仍无统一标准和定论。 目的：体外获取兔骨髓间充质干细胞、纯化、扩增,同时研究其生物学特性及多向分化潜能。 方法：采用贴壁筛选法分离培养兔骨髓间充质干细胞,观察其增殖和生长特性,绘制生长曲线;倒置相差显微镜、苏木精-伊红染色及碱性磷酸酶染色观察细胞形态;并向成骨细胞、软骨细胞和血管内皮细胞多向诱导分化,分别采用钙结节茜素红染色、甲苯胺蓝染色和荆豆凝集素染色鉴定。 结果与结论：经贴壁筛选法得到的骨髓间充质干细胞性状稳定,为纺锤状,呈克隆样生长,碱性磷酸酶染色弱阳性;经成骨、成软骨、成血管内皮细胞诱导培养的骨髓间充质干细胞,表现出相应细胞的形态特征和生物学特征。提示,全骨髓培养法取材方便,骨髓间充质干细胞增殖能力强,在适宜条件下能够多向分化。     

大鼠骨髓间充质干细胞与成骨细胞共育环境下Ⅰ型胶原的表达

背景：骨髓间充质干细胞在不同条件下可以分别分化为成骨细胞、软骨细胞、成肌细胞、脂肪细胞、神经胶质细胞、血管内皮细胞等。 目的：与成骨细胞共培养的条件下，观察大鼠骨髓间充质干细胞Ⅰ型胶原的表达。 设计、时间及地点：细胞学体外观察，于2007-01/08在广州中医药大学附属骨伤科医院细胞室完成。 材料：3月龄SPF级SD大鼠6只用于骨髓间充质干细胞的分离与扩增，1 d龄以内清洁级SD乳鼠10只用于成骨细胞的分离与扩增。 方法：贴壁法分离骨髓间充质干细胞，扩增后以流式细胞仪检测其均一性及细胞表型。采用酶消化法分离培养成骨细胞，以磷酸酶染色观察细胞分泌情况。利用Transwell培养板将成骨细胞和骨髓间充质干细胞在培养液以及其中的大分子蛋白可以相互交流而细胞间不相互接触的培养板内培养，以采用普通培养板单独培养的骨髓间充质干细胞为对照。 主要观察指标：观察骨髓间充质干细胞的形态学变化及矿化能力，20 d后半定量RT-PCR方法检测骨髓间充质干细胞Ⅰ型胶原的表达，茜素红染色后显微镜下计数钙化结节。 结果：流式细胞仪检测结果显示细胞均一性较好，2代细胞均一性在90%以上，CD34、CD45表达为阴性，CD44表达阳性。成骨细胞原代培养20 d时出现不透光的钙化结节，生长期细胞分裂相多见，细胞突起相互连接，汇合时呈铺路石状。茜素红染色矿化结节呈现酒红色，骨碱性磷酸酶染色可见胞质内出现黑色颗粒或块状沉淀。共培养的骨髓间充质干细胞形成的钙化结节数高于对照组(P < 0.05)；与成骨细胞共培养的骨髓间充质干细胞Ⅰ型胶原表达量明显高于对照组(P < 0.01)。 结论：与成骨细胞共培养的骨髓间充质干细胞Ⅰ型胶原的表达量高，成骨能力强。     

重组腺病毒Ad-LMP-1感染大鼠骨髓间充质干细胞

背景：LIM矿化蛋白1 (LIM Mineralization protein, LMP-1)是一种细胞内非分泌蛋白，可以通过招募众多的成骨因子共同参与成骨细胞的分化。LMP-1在成骨上游水平发挥的强大作用提示了其在骨骼重建方面具有巨大的应用潜力。 目的：观察重组腺病毒Ad-LMP-1感染骨髓间充质干细胞的效果，及对其分化的影响。 方法：大鼠骨髓间充质干细胞分离培养，传代后，检测特异性标记物CD44的表达情况，矿化液诱导细胞成骨分化后用茜素红染色鉴定。感染重组腺病毒Ad-LMP-1后通过观察绿色荧光蛋白表达情况计算转染效率，RT-PCR及Western blot验证感染效果，观察感染Ad-LMP-1 2，7，14 d后骨髓间充质干细胞的形态变化和对细胞增殖活力的影响。 结果与结论：传代细胞形态一致，排列紧密。矿化液诱导后，细胞形态明显改变。茜素红染色结果表明，诱导后出现钙化结节。观察绿色荧光蛋白信号表明重组病毒Ad-LMP-1感染骨髓间充质干细胞效率在85%左右。感染重组腺病毒Ad-LMP-1后第7天出现了细胞形态改变，14 d出现类钙化结节，但不伴有细胞增殖活力改变。结果提示重组腺病毒Ad-LMP-1可以有效地感染原代培养的骨髓间充质干细胞，并诱导其向成骨细胞分化。     

携带肾上腺髓质素基因腺病毒体外转染骨髓间充质干细胞及其蛋白的表达

背景：肾上腺髓质素具有促进骨髓间充质干细胞增殖、生长及减少凋亡等作用。 目的：观察携带肾上腺髓质素基因的腺病毒体外转染骨髓间充质干细胞及其蛋白的表达。 方法：培养293A细胞,并扩增携带肾上腺髓质素基因的腺病毒(Ad-ADM),实验分为对照组、空载体组和Ad-ADM转染组,3组分别于细胞长满至50%~60%时加入等量的无血清L-DMEM、Ad-lacZ和Ad-ADM,噬斑法检测扩增后腺病毒的滴度;贴壁法体外分离、扩增培养大鼠骨髓间充质干细胞;Ad-GFP体外感染骨髓间充质干细胞后检测转染效率;RT-PCR检测Ad-ADM转染后肾上腺髓质素mRNA的表达。 结果与结论：病毒扩增后噬斑试验测定Ad-ADM的病毒滴度为1.1×109 pfu/mL。Ad-ADM感染骨髓间充质干细胞后,肾上腺髓质素mRNA的表达明显增加,对照组、空载体组未见ADM mRNA表达;量化结果表明其表达量从第1天开始逐渐增加,第7天达高峰,在11 d时仍可检测其表达。提示腺病毒对骨髓间充质干细胞有较高的转染效率。感染Ad-ADM后,骨髓间充质干细胞可有效表达肾上腺髓质素。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外增殖与多向分化的能力

背景：生理条件下机体内多数骨髓间充质干细胞增殖并不明显,然而在一定刺激下可表现出旺盛的有丝分裂活动,具有很强的增殖倍增能力,且体外实验表明其具有多向分化潜能。 目的：进一步验证体外分离培养的大鼠骨髓间充质干细胞生长增殖与多向分化潜能。 方法：全骨髓法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,贴壁筛选法进行纯化,倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长特征,MTT法绘制细胞生长曲线,免疫组化法对细胞表面干细胞标志CD44进行鉴定。取传至第4代细胞,分别用成骨、成软骨、成脂肪和成神经诱导剂予以培养,通过碱性磷酸酶染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色、油红O染色、NeuN抗体免疫组化染色进行分化能力鉴定。 结果与结论：分离培养的细胞呈长梭形或多边形,细胞生长曲线呈S形,群体倍增时间约为31 h,免疫细胞化学染色后CD44呈阳性表达,CD34呈阴性。第4代骨髓间充质干细胞成骨诱导2周后出现钙盐沉积,成软骨诱导培养2周后Ⅱ型胶原检测呈阳性,成脂肪诱导培养2周后在细胞的胞浆内充满大量红色脂肪滴,成神经诱导6 h后细胞出现突起,类似神经元的轴突和树突纤维,NeuN免疫组化染色呈阳性。表明体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞生长增殖能力旺盛,可向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经元样细胞方向分化。     

腺病毒介导骨形态发生蛋白2基因转染诱导脂肪间充质干细胞向

背景：在众多的骨生长因子中,骨形态发生蛋白2具有显著促进骨缺损修复和骨折愈合的效果。骨修复是一个阶段性过程,不需要转染的目的基因长久表达,因此利用腺病毒载体将目的基因导入脂肪间充质干细胞来促进骨愈合比较理想。 目的：观察腺病毒介导的骨形态发生蛋白2基因转染后大鼠脂肪间充质干细胞的分化情况。 设计、时间及地点：细胞学体外对照观察,于2008-01/10在北京大学第三医院中心实验室完成。 材料：清洁级3周龄雄性Lewis大鼠24只,由北京大学实验动物学部提供。腺病毒载体Ad-BMP2、Ad-GFP由靳小兵博士构建扩增。 方法：胶原酶消化法分离培养大鼠脂肪间充质干细胞,传至第3代分为Ad-BMP2转染组、Ad-GFP转染组和未转染组。各转染组分别向培养液中加入对应的腺病毒液,转染复数MOI=100。 主要观察指标：转染后脂肪间充质干细胞碱性磷酸酶活性,von Kossa染色结果,Western blotting法检测骨桥蛋白和骨形态发生蛋白2的表达。 结果：与未转染组比较,转染后7,14,21d Ad-GFP转染组细胞碱性磷酸酶活性无明显变化;Ad-BMP2转染组细胞碱性磷酸酶活性明显增高（P < 0.01）,且随时间延长碱性磷酸酶活性增加更为显著。Ad-BMP2转染组von Kossa染色出现黑色钙结节,免疫细胞化学染色结果示胞浆内有大量黄染颗粒,骨桥蛋白、骨形态发生蛋白2均呈明显强阳性表达。Western blotting检测结果显示Ad-BMP2转染组脂肪间充质干细胞骨桥蛋白、骨形态发生蛋白2表达水平增高,Ad-GFP转染组中未检测到骨桥蛋白、骨形态发生蛋白2的表达。 结论：大鼠脂肪间充质干细胞经腺病毒介导的骨形态发生蛋白2基因转染后,可定向分化为成骨细胞。     

骨碎补总黄酮可促进兔骨髓间充质干细胞的增殖和分化*

背景：骨碎补促进骨损伤愈合疗效确切,但具体作用机制尚不清楚。 目的：观察骨碎补总黄酮对兔骨髓间充质干细胞增殖、分化的影响。 方法：冲洗兔股骨和胫骨骨髓腔获取骨髓,采用密度梯度离心法联合贴壁培养法体外纯化扩增兔骨髓间充质干细胞;以四甲基偶氮唑蓝法测定不同浓度骨碎总黄酮对兔骨髓间充质干细胞增殖的影响;经骨碎补总黄酮体外诱导后,行扫描电镜形态学观察,碱性磷酸酶染色、茜素红染色和Von Kossa银染色了解细胞钙化情况。 结果与结论：兔骨髓间充质干细胞可以通过密度梯度离心法联合贴壁培养法扩增和纯化;含骨碎补总黄酮血清培养后,四甲基偶氮唑蓝测定结果显示,骨碎补总黄酮浓度为10-6 mmol/L时可明显促进兔骨髓间充质干细胞增殖。经骨碎补总黄酮诱导液诱导,扫描电镜下可见成骨细胞样形态和钙结节形成;细胞碱性磷酸酶染色、钙结节茜素红染色和Von Kossa银染色均呈阳性,提示骨碎补总黄酮可促进兔骨髓间充质干细胞增殖和分化。     

黄芪诱导大鼠骨髓间充质干细胞的分化特点

背景: 黄芪提取物有较好的抗氧化、清除氧自由基的作用,加之骨髓间充质干细胞的多向分化潜能及其自体移植的优越性,可能为 神经退行性疾病的治疗提供新的方式。 目的：探讨黄芪诱导后大鼠骨髓间充质干细胞的分化特点。 设计：细胞学体外观察。 材料：清洁级6周龄雄性大鼠1只,购自中国医科院实验动物中心。黄芪注射液批号060105,为大理药业有限公司产品。 方法：全骨髓法体外分离培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,传至第4代时,按4×108 L-1密度接种于置有盖玻片的12孔板内,制备细胞爬片。盖玻片上细胞达80%~90%融合后全量换液,加入含200 g/L黄芪注射液、体积分数为15%胎牛血清的DMEM培养基连续诱导6 d;对照组DMEM培养基中不加入黄芪注射液。 主要观察指标：倒置显微镜观察诱导前后骨髓间充质干细胞的形态变化,诱导后免疫细胞化学染色鉴定特异性标志物的表达。 结果：原代培养的骨髓间充质干细胞多呈圆形,扩增至第4代后细胞形态多呈梭形或成纤维细胞状,诱导后细胞形态发生改变,自胞体长出突起,随诱导时间延长,长出突起的细胞数量逐渐增多,部分突起末端呈分叉状,可见网络状连接。免疫细胞化学染色结果显示,诱导第3天巢蛋白阳性细胞、神经元特异性烯醇化酶阳性细胞和神经胶质纤维酸性蛋白阳性细胞较多,诱导第6天微管相关蛋白2阳性细胞较多。 结论：黄芪首先诱导骨髓间充质干细胞向神经干细胞分化,然后促进其向神经元或神经胶质细胞的非特异性分化,并能够使已分化细胞的进一步成熟、老化。 关键词：黄芪;骨髓间充质干细胞;神经干细胞;诱导分化     

细胞密度与骨髓间充质干细胞向神经元样细胞的分化

景：细胞种植密度是影响干细胞分化的因素之一,对于细胞种植密度在骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化过程中的作用尚缺乏深入研究。 目的：观察细胞种植密度对骨髓间充质干细胞诱导向神经元样细胞分化的影响。 方法：采用贴壁培养法分离大鼠骨髓间充质干细胞,传至第4代后将其按2×102,2×103,4×103,8×103,2×104,4×104/cm2种植于六孔板,每组均加入碱性成纤维细胞生长因子+表皮生长因子+维甲酸诱导向神经元样细胞分化,并通过免疫组织化学染色鉴定,计算每组细胞出现神经元样细胞的比例,比较各组的分化率。 结果与结论：各组骨髓间充质干细胞加入诱导剂后均出现神经元样细胞,Nestin、NSE、GFAP细胞化学染色呈阳性。不同种植密度组出现神经元样细胞比例不同,以8×103/cm2组神经元样细胞比例最高,且神经元样存活时间最长,达7 d。结果说明骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化与细胞接种密度有关,过高或过低细胞密度均不利分化。     

骨髓间充质干细胞自体移植促进兔缺血肢体的血管生成

背景：常规药物治疗、介入或血管旁路移植手术对下肢动脉闭塞症的远期疗效均不理想。近年来采用干细胞的血管再生疗法在梗死部位修复或重新建立有效侧支循环逐渐成为可能。 目的：验证骨髓间充质干细胞自体移植对兔缺血后肢血管再生的促进作用。 设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2005-08/2006-11在江苏省血吸寄生虫病防治研究所完成。 材料：选用新西兰大白兔8只，制备兔后肢缺血模型。按随机数字表法分为2组，实验组及对照组各4只。 方法：分离培养实验组兔骨髓间充质干细胞，5-溴-2-脱氧尿苷标记，将骨髓间充质干细胞制成悬液注射于实验组兔后肢缺血部位；对照组注射等量生理盐水。 主要观察指标：2 周后行兔股动脉二维及彩色多普勒超声检测，观察移植前后的血管内径、血流峰值速度及血流加速时间等；取缺血部位肌肉组织，通过免疫荧光及苏木精-伊红染色观察移植细胞分布及血管生成情况。 结果：细胞移植2周后实验组兔的股动脉内径、血流峰值速度均大于对照组(P < 0.01)，血流加速时间短于对照组(P < 0.01)。免疫荧光染色结果显示实验组兔移植部位有抗5-溴-2-脱氧尿苷染色阳性细胞存在；苏木精-伊红染色结果显示实验组缺血部位血管密度高于对照组。 结论：骨髓间充质干细胞具有促进血管生成的作用，自体移植可望成为一种简单的、有效的治疗下肢缺血的方法。     

原子力显微镜观察人脐带间充质干细胞：生物学特性与超微结构的关系*

背景：细胞形态结构和功能密不可分,但目前对人脐带间充质干细胞超微结构的报道还很少。 目的：探讨人脐带间充质干细胞的生物学特性与原子力显微镜下超微结构的关系。 方法：采用酶消化法体外分离培养并扩增人脐带间充质干细胞,取第3代细胞,用原子力显微镜在接触模式下观察成像,通过流式细胞仪检测细胞免疫表型和细胞周期,油红O染色及碱性磷酸酶染色鉴定其成脂、成骨分化潜能。 结果与结论：第3代人脐带间充质干细胞强表达CD44,CD29,低表达CD106,不表达CD34;有80%以上的细胞处在G0/G1期,增殖指数为19.9%;成脂诱导后,油红O染色可见胞浆中有大量桔红色的小脂滴;成骨诱导后,碱性磷酸酶染色可见立方形、多边形细胞的胞质染成棕褐色。原子力显微镜下人脐带间充质干细胞以长梭形为主,细胞骨架丝明显,并形成网状连接,这与其强大的增殖、迁移、分化功能相适应。